Покращена пам’ять для розпізнавання об’єктів за допомогою повторюваної транскраніальної магнітної стимуляції після кодування. Частина 1

анотація

Довідкова інформація: відомо, що стимуляція мозку впливає на канонічні шляхи та білки, задіяні в пам’яті. Однак існують суперечливі результати щодо здатності стимуляції мозку покращувати пам’ять, що може бути пов’язано з варіаціями в часі стимуляції.

Існує тісний зв'язок між стимуляцією мозку і пам'яттю. Стимуляція мозку може сприяти активності нейронів мозку, тим самим покращуючи пам’ять і когнітивні здібності.

По-перше, стимуляція мозку може сприяти з’єднанню між нейронами. Стимулюючи мозок, спілкування та зв’язок між нейронами стане більш частим і ефективним. Ці зв’язки стануть більш стабільними та реальними, що зробить мозок більш гнучким, креативним і вдумливим. Ці переваги дадуть вам перевагу в навчанні та житті.

По-друге, стимуляція мозку може зміцнити пам'ять. Часта стимуляція мозку може підвищити життєздатність і здоров'я мозку, тим самим покращуючи пам'ять. Існує життєво важливий зв’язок між здоров’ям мозку та пам’яттю та когнітивною діяльністю. Стимуляція мозку допоможе мозку відновитися, рости та відновлюватися. Таким чином нам буде легше засвоювати знання або отримувати значущу інформацію з життя, і ми зможемо краще зберігати їх і запам’ятовувати в мозку.

Крім того, стимуляція мозку також може сприяти навчанню та застосуванню нової інформації. У житті ми постійно стикаємося з різними проблемами, з якими не знаємо, як впоратися. Стимулюючи мозок часто, ми можемо швидше й точніше розуміти цю складну інформацію, поступово адаптуватися до неї, знаходити способи її обробки та краще справлятися з нею, що робить нас зручнішими у справах.

Коротше кажучи, завдяки стимуляції мозку ми можемо бути більш гнучкими, креативними та вдумливими. Ми також з більшою впевненістю зустрінемося з проблемами та викликами в житті. Стимуляція мозку є хорошим способом покращити наші когнітивні здібності, посилити навчання та покращити пам’ять. Дотримуймося нашого плану вправ для мозку, зберігаймо позитивний настрій, будьмо позитивними, прагнемо кращого особистого розвитку та втілюй наші ідеали. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад, підвищувати рівні ацетилхоліну та факторів росту, які дуже важливі для пам’яті та навчання. Крім того, Cistanche також може покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатнє харчування та енергію, тим самим покращуючи життєву силу та витривалість мозку.

Натисніть Знати, щоб покращити робочу пам'ять

Гіпотеза: ми припустили, що повторювана транскраніальна магнітна стимуляція (rTMS), яка виконується після навчального завдання та протягом періоду до пошуку, може допомогти покращити пам’ять. Методи: ми імплантували самців мишей B6129SF2/J (n=32) із краніальним прикріпленням для закріплення котушки rTMS. що мишам можна надавати постійну стимуляцію лобової області, вільно рухаючись.

Потім миші пройшли фазу вибірки тесту на розпізнавання об’єктів і отримали лікування через 3, 24, 48 години після тесту. Лікування включало 10 хв 10 Гц стимуляцію rTMS (TMS, n=10), фіктивне лікування (SHAM, n=11) або контрольну групу, яка не виконувала поведінковий тест або не отримувала rTMS (КОНТРОЛЬ n=11).

У þ72 мишей було перевірено на їхнє дослідження нового об’єкта проти знайомого об’єкта. Результати: у 72-h лише миші, які отримали rTMS, краще досліджували новий об’єкт, ніж знайомий об’єкт.

Крім того, ми показуємо, що стимулювання синаптичного GluR2 і підтримання синаптичних зв’язків у периринальній корі та гіпокампальному CA1 важливі для цього ефекту.

Крім того, ми знайшли докази того, що ці зміни були пов’язані з шляхами CAMKII та CREB у нейронах гіпокампу.

Висновок: Пов’язуючи відомі біологічні ефекти rTMS із шляхами пам’яті, ми надаємо докази того, що rTMS ефективний у покращенні пам’яті, якщо його застосовувати під час фаз консолідації та підтримки.

1. Вступ

Відомо, що неінвазивна стимуляція мозку впливає на канонічні шляхи та білки, що беруть участь у пам’яті. Однак поточні дослідження, які вивчали вплив стимуляції мозку, зокрема повторюваної транскраніальної магнітної стимуляції (rTMS), на пам’ять дали суперечливі результати [1].

Причиною цього може бути націлювання на стимуляцію в різний час під час формування та відновлення пам’яті [1]. Докази свідчать про те, що націлювання на rTMS на фазах після кодування або консолідації може виявитися корисним для розвитку стабільної довготривалої пам’яті [2]e4.

Консолідація — це фаза, яка перетворює короткочасну пам’ять на довготривалу (LTM). Процес залежить від певного часу синтезу білка, який перетворює нову інформацію в стабільні синаптичні модифікації з підвищеною щільністю постсинаптичних рецепторів [5,6].

Важливість цього специфічного для часу та регіону синтезу білка була показана в дослідженнях, які блокують синтез білка denovo. Наприклад, одне дослідження, яке блокувало синтез білка в гіпокампі 3-год, але не 6-год після події навчання, порушило LTM, але не короткочасну пам’ять у щурів[7].

З цих білків було ідентифіковано кілька важливих сигнальних шляхів, які активовані та важливі в цьому процесі.

У синапсі існує кілька сигнальних шляхів, які сигналізують про іннервацію рецептора та стабільність хребта, необхідні для LTM. Вони активуються через подію довгострокового потенціювання (LTP) і часто підсилюються нейротрофічними факторами, такими як нейротрофічний фактор мозку (BDNF) [8].

BDNF має особливе значення для створення довготривалої пам’яті, оскільки блокування синтезу BDNF у певні моменти часу наступне навчання блокує його консолідацію [5].

BDNF зв’язується з рецепторами тирозинкінази (TrkB) і може ініціювати численні сигнальні шляхи, такі як мітоген-активована протеїнкіназа/позаклітинна сигнально-регульована кіназа (ERK) або фосфоліпаза Cg. Ці сигнальні шляхи конвергують при активації фактора регуляції транскрипції циклічного АМФ-реактивного елемент-зв'язуючого білка (CREB).

Кальцій-активовані білки, такі як кальцій/кальмодулін-залежна протеїнкіназа II (CAMKII), також відіграють важливу роль у регуляції гена, що активується CREB [9e11], і вони також можуть безпосередньо опосередковувати синаптичну експресію глутаматергічних AMPA-рецепторів і стабілізувати синаптичні каркаси [12e15] .

Разом ці сигнальні шляхи призводять до експресії та транслокації рецептора зсуву, що опосередковує підвищену активацію в синапсі, тим самим слугуючи для стабілізації синапсів і сприяючи підтримці тривалого LTP [16]. Важливо, що попередні дослідження показали, що можна покращити консолідацію пам’яті. через періодичну реактивацію цих шляхів консолідації в експериментальних умовах [17].

Попередні дослідження показали здатність rTMS безпосередньо впливати на ці специфічні шляхи в мозку. Дослідження in vivo показали, що rTMS підвищує рівень BDNF у мозку [18e20]. Більш прямо, in vitro rTMS призводить до збільшення Ca2þ в нейронах, переважної сигнальної молекули в шляху CAMKII [18]. Підвищене фосфорилювання CAMKII і CREB також було показано in vitro після rTMS [20,21].

rTMS також безпосередньо впливає на експресію синаптичних рецепторів, збільшуючи щільність рецепторів АМРА [22e24] і регулюючи субодиниці рецептора АМРА — глутаматний рецептор 1 (GluR1) і глутаматний рецептор 2 (GluR2) [25,26].

Таким чином, asrTMS активує ці шляхи, що було б найбільш ефективним для покращення пам’яті під час фази консолідації. У цьому дослідженні розглядалося використання rTMS для покращення пам’яті шляхом націлювання на стимуляцію фаз консолідації та підтримки пам’яті.

Ми припустили, що rTMS, введений після навчального завдання та протягом періоду до відновлення, може покращити продуктивність пам’яті. Це було б результатом періодичної реактивації шляхів, залучених до пам’яті, на які також впливає rTMS.

Використовуючи тваринну модель конкретного епізодичного LTM, ми показали, що rTMS покращує пам’ять об’єкта, якщо її вводити протягом 72- год між кодуванням і пошуком, тоді як миші, які отримували лікування SHAM, не зберігали пам’ять.

Цей ефект підтверджувався змінами синаптичних зв’язків у периринальній корі та СА1, підвищеною активацією CREB і CAMKII і динамічним зсувом субодиниць рецептора АМРА в синапсі.

2. Матеріал і методи

2.1. Тварини

Для цього дослідження ми використали n=33 мишей-самців B6129SF2/J віком 2–4 місяці. Усі миші жили в циклі 12-год світла/12-год темряви з вільним доступом до сухого корму та води. Увесь догляд за тваринами та процедури відповідали Закону про добробут тварин, відповідали інституційним інструкціям і схвалені Комітетом з досліджень тварин VA Palo Alto.

2.2. Хірургія підтримки спіралі

Кожна з мишей пройшла операцію, щоб прикріпити опору спіралі, яка дозволила послідовну rTMS стимуляцію неспаних тварин. Подробиці про хірургічну процедуру можна знайти в Poh et al., 2018 [27].

Коротше кажучи, тварин анестезували 3% ізофлураном і підтримували на рівні 2-3% за допомогою носового конуса. Після гоління та очищення ділянки для стерильності лезом скальпеля був зроблений сагітальний розріз довжиною приблизно 10 мм.

Окістя було обережно зішкряблено, а попередньо виготовлену спиральну опору було прикріплено до брегми за допомогою ціаноакрилату та зміцнено стоматологічним цементом. Потім рану зашивали навколо опори спіралі.

2.3. Процедури поведінки та стимулювання

Огляд поведінки та процедур стимуляції див. на мал. 1а. Після п’яти днів відновлення після операції зі спиральною підтримкою мишей привчали до окремої клітки для стимуляції та спіральних процедур протягом трьох днів.

В останній день звикання котушки миші пройшли тест у відкритому полі (OFT) протягом 10-хв, який також служив для звикання до тесту на розпізнавання об’єктів (ORT). Наступного дня мишей піддавали фазі відбору проб ОРТ із двома однаковими об’єктами протягом 10 хвилин. Об’єкти були однакового розміру, але різного кольору та форми. Ці об'єкти були розміщені в протилежних кутах квадратної випробувальної арени.

Через три години мишей випадковим чином розділили на дві групи лікування: TMS, які отримували активну стимуляцію 10-хв 10 Гц rTMS, і SHAM, яких лікували так само, за винятком того, що спіраль була вимкнена під час стимуляції.

Мишей TMS і SHAM обробляли повторно24- і 48-год після ознайомлення. В останній день (72- год після ознайомлення) миші піддавалися фазі ОРТ-тесту протягом 10- хв з одним знайомим об’єктом і одним новим об’єктом.

Щоб визначити, чи дослідження нового об’єкта було більшим, ніж знайомого об’єкта, ми розрахували індекс дискримінації (((дослідження нового об’єкта)-(дослідження знайомого об’єкта))/((дослідження нового об’єкта)þ(дослідження знайомого об’єкта))). Ми обрали 72-h, оскільки як попередні дослідження [28], так і пілотні дані (не показано) продемонстрували, що за нормальних умов миші не зберігають пам’ять ORT у цей момент часу.

Як типи об’єктів, так і розташування нового об’єкта були збалансовані між групами. Для звикання, відбору зразків і сеансу зондування мишам завжди давали 30 хвилин для адаптації до експериментальної кімнати перед випробуваннями, а об’єкти та арену очищали 70% етанолом після кожної миші.

Щоб дослідити вплив виключно поведінкового завдання, ми також включили групу, до якої ставилися так само, як до мишей SHAM, за винятком того, що вони не робили ОРТ.

Замість цього вони були піддані сеансу відбору проб і зонду, але без об’єктів. Одна миша в групі TMS не досягла необхідного порогу загального 20- дослідження обох об’єктів під час сеансу вибірки, тому її виключили з дослідження. Ця миша була виключена з подальшого біохімічного аналізу.

Усі інші миші досягли критеріїв як під час сеансу відбору проб, так і під час тестування. За винятком однієї миші, кінцеві числа в експериментальних групах були TMS n=10, SHAM n=11 і CONTROLn=11.

2.4. Вестерн-блот

Через три години після зондового сеансу мишей умертвили з передозуванням кетаміну, а тканини гіпокампу та лобної кори швидко розрізали на сухому льоду та зберігали при 80°C.

Ці зразки гомогенізували за допомогою 300 мл крижаного реагенту Synaptic Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) з 1 таблеткою інгібітора протеази (Roche) і 1 таблеткою інгібітора фосфатази (Roche) (на 10 мл) протягом 5 секунд.

Гомогенати центрифугували при 1200 g протягом 10 хвилин для видалення залишків клітин. Відбирали супернатант і частину супернатанту ділили на аліквоти для аналізу повного гомогенату. Залишок центрифугували при 15,{3}} g протягом 20-хв при 4 C.

Гранули, що містять синаптосоми, обережно ресуспендували в Syn-Per при 1,5 мл/г тканини для створення синаптичного гомогенату. Для кількісного визначення концентрації білка в зразку використовували нанокраплю.

Повний гомогенат і синаптичний гомогенат зберігали при 80°C до аналізу. Гомогенати Full і Synaptic розбавляли до 4 мг/мл охолодженого PBS і змішували з буфером для завантаження білка (LiCor) 1:4 і меркаптоетанолом 1:4000. Потім їх нагрівали при 95 C протягом 5-хв і завантажували в гелі Mini PROTEAN TGX (Bio-Rad).

Після розділення за допомогою електрофорезу при 100 В білки переносили на нітроцелюлозну блот-мембрану (GE Healthcare Lifesciences). Мембрани промивали розчином для попередньої обробки SuperSignal WesternBlot Enhancer Antigen (Thermo Scientific), а потім блокували блокуючим буфером (Rockland) і 1% козячої сироватки протягом 1- год.

Після блокування мембрану інкубували з первинними антитілами, розведеними в розріджувачі первинних антитіл SuperSignal Western BlotEnhancer (Thermo Scientific), протягом ночі при кімнатній температурі.

Основними використовуваними антитілами були мишачі моноклональні ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), кролячі моноклональні фосфо-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), мишачі моноклональні CREB (1:500, Cell SignalingTechnologies), кролячі моноклональні антитіла фосфо-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), кролячий моноклональний CAMKIIalpha (1:1000, Cell Signaling Technologies), мишачий моноклональний фосфо-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), мишачий моноклональний GluR1 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology), кролячий моноклональний фосфо-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), кролячий моноклональний фосфо-GluA1 (S831) (pGluR1(831) 1:750, Cell Signaling Technologies), миша моноклональний GluR2 (1:750, Invitrogen), кролячий поліклональний фосфо-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), мишачий моноклональний TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) або кролячий поліклональний фосфо-TrkB( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Кролячий поліклональний Cofilin (1:2000, Sigma) використовували для стандартного контролю завантаження. Після промивання в TBS-Tween мембрану інкубували протягом 1 години при кімнатній температурі в козячому анти-кролячому 800 і козячому анти-мишачому 680 (1:3000, LiCor).

Імуноблот був зображений за допомогою системи інфрачервоної візуалізації Odyssey Clx (LiCor), а аналіз даних інтенсивності смуги проводився за допомогою Image Studio (LiCor).

2.5. Імуногістохімія

Через три години після зондового сеансу мишей, убитих із передозуванням кетаміну, потім транскардіально перфузували 50 мл холодного 1 М PBS.
Мозок негайно постфіксували в 4% розчині параформальдегіду при 4°C і переносили в 30% сахарозу в PBS принаймні на 48- год перед кріозрізанням на зрізи 30 мм. Вільно плаваючі зрізи блокували та пермеабілізували 10% сироваткою козячого осла в 0,1% тритоні в 1 М PBS, потім інкубували 48-з кролячим поліклональним PSD95 (1:300, Thermo Scientific) і мишачим моноклональним SV2A (1:300, Біотехнологія Санта-Крус).

Потім ці зрізи інкубували протягом 1- год з вторинними антитілами Alexa Fluor goat anti-rabbit 568 (1:500, Invitrogen) і Alexa Fluorgoat anti-mouse 488 (1:500, Invitrogen. Потім зрізи промивали ядерним барвником DAPI (1:1000, Sigma), встановлений на слайдах і покритий Fluoromount (Thermo Scientific).

Фарбування кількісно оцінювали у фронтальній корі (FC), дорсальному CA1 гіпокампі, енторинальній корі (EC) і периринальній корі (PC).

Zstacked зображення були зроблені за допомогою флуоресцентного мікроскопа BZ-X700 (Keyence) при 40-кратному збільшенні для визначення синаптичних точок по всьому зрізу. Загальна кількість точок PDS95, точок SV2A та колокалізованих (визначених як дві точки поруч одна з одною або перекриваються) підраховували щонайменше з чотирьох зображень для кожної області, а також середнє значення результатів для кожної миші. Кількісне визначення % колокалізованих було завершено шляхом підрахунку (перекриття SV2A та PSD95)/(загальна кількість SV2A та PSD95) точок.

2.6. Статистика

Усі дані відповідали припущенням нормальності, оціненим шляхом вивчення асиметрії, ексцесу та значення Шапіро Вілка обчислених залишків, і не було порушень однорідності дисперсії, оціненої за допомогою статистики Левена.

Для тестів поведінки використовували t-тести студентів для порівняння SHAM з TMS, для дослідження нових і знайомих об’єктів у групах використовували двосторонній дисперсійний аналіз RepeatedMeasures Two-Way ANOVA.

Дані імуногістохімії та Вестерн-блоту перевіряли на значущість за допомогою One-WayANOVA. Для всіх ретроспективних парних порівнянь використовувалося коригування Тьюкі зі значущістю при p < 0.05.

Якщо однорідність дисперсії була порушена, значущість визначали за допомогою тесту Welch Test і наступну пост-гоц коригували за допомогою Games-Howell, ці випадки відзначаються в результатах. Усі статистичні дані були виконані за допомогою SPSS (версія 22, IBM), а графіки створені за допомогою GraphPad (версія 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com