Тандемна мас-спектрометрія високої роздільної здатності ідентифікує особливий гангліозидний патерн у хворих на цукровий діабет 2 типу на ранній стадії діабетичної хвороби нирок

Анотація:

Беручи до уваги цінну інформацію, яку надають глікосфінголіпіди, якмолекулярні маркериі обмежені дані, доступні для їх виявлення та характеристики у пацієнтів, які страждають наДіабетична хвороба нирок 2 типу(DKD), ми розробили та впровадили кращий метод, заснований на мас-спектрометрії високої роздільної здатності (МС) і тандемній МС (МС/МС) для визначення гангліозидів у сечіХворі на DKD. Це дослідження було зосереджено на: (i) тестуванні здійсненності та продуктивності HR MS і MS/MS у відображенні тасеквенування ниркових гангліозидів при ЦД 2 типупацієнтів; (ii) визначення змін угангліозид сечі DKDпацієнтів врізні стадії захворювання-нормо-, мікро- та макроальбумінурія - у порівняльному аналізі зі здоровими особами контролю. Завдяки високій роздільній здатності та масовій точності порівняльний скринінг МС виявив, що стан сіалілювання компонентів гангліозиду; їх модифікація O-ацетилом, CH3COO−, O-фукозилом та O-GalNAc; а також склад кераміду є можливими маркерами для раннього виявлення DKD, оцінки прогресування захворювання та подальшого лікування. Крім того, структурне дослідження MS/MS показало, що GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) і GT1b(d18:1/18:{{ 23}}) ізомери пов’язані з макроальбумінурією, що заслуговує на подальше дослідження щодо їхньої ролі в DKD.

Ключові слова: наноелектророзпилювач; тандемна мас-спектрометрія високої роздільної здатності; скринінг; аналіз фрагментації; діабетична хвороба нирок; гангліозидні біомаркери

1. Введення

Цукровий діабет 2 типу (ЦД) залишається терапевтичною проблемою з постійно зростаючим глобальним поширенням, незважаючи на наукові досягнення в цій галузі. Пов’язаний із руйнівним довгостроковим пошкодженням макро- та мікросудин, ЦД 2 типу призводить до підвищення смертності. Діабетична хвороба нирок (ДЗН) є найпоширенішою причиною термінальної стадії ниркової недостатності (ТНН) у розвинених країнах і країнах, що розвиваються [1,2]. Таким чином, раннє виявлення DKD та оптимальне лікування ЦД 2 типу мають вирішальне значення для зниження ускладнень, захворюваності та смертності. Наразі діагностика та прогресування DKD ґрунтується на вимірюванні альбумінурії та стабільного зниження швидкості клубочкової фільтрації (eGFR), обидва параметри демонструють скромне прогнозування майбутнього ниркового статусу. Природний перебіг DKD включає кілька клінічних стадій, включаючи наступні: рання клубочкова гіперфільтрація, поява мікроальбумінурії або макроальбумінурії, зниження швидкості клубочкової фільтрації та ESRD. Однак останні дослідження вважають альбумінурію маркером погіршення стану [3].

В останнє десятиліття особливий інтерес проявили до субтелоцентричної концепції, згідно з якою проксимальний каналець і тубулоінтерстиціальний компартмент можуть відігравати істотну роль у ініціації та прогресуванні ДЗН [4–6]. У цьому контексті розробка прогностичних і прогнозних глікомічних біомаркерів привертає все більшу увагу і протягом багатьох років стає центром уваги багатьох дослідницьких груп [7–11].

Гангліозиди представляють особливий клас глікосфінголіпідів зі складною структурою, ідентифікованим у всіх тканинах і рідинах організму, і особливо поширених у центральній нервовій системі (ЦНС) [12]. Будучи основними складовими двошарових мембран нейронних клітин, гангліозиди відіграють важливу роль у розвитку мозку, дозріванні та старінні, опосередковуючи клітинну адгезію, активацію, проліферацію, рухливість і ріст. Гангліозиди складаються з кераміду різного складу щодо сфінгоїдної основи, залишків жирних кислот, вкорінених у зовнішній шар мембрани, і сіалільованого олігосахаридного ланцюга, що покриває мембрану та бере участь у специфічних і істотних взаємодіях з іншими молекулами в навколишньому середовищі. Через нормальний оборот клітинної поверхні, відомий як «розщеплення клітинної поверхні», гангліозиди певною мірою вивільняються в міжклітинний простір.

Оскільки відомо, що експресія, розподіл і структура гангліозидів є типоспецифічними для клітин і тканин і можуть змінюватися під час розвитку тканин, дозрівання, старіння і, головне, в патологічних станах [12], гангліозиди вважаються одними з найцінніших діагностичні маркери та проспективні терапевтичні засоби.

Кілька методів із застосуванням фрагментів біопсії сироватки або нирки були застосовані для ідентифікації ниркових гангліозидів у пацієнтів із ЦД 2 типу, наприклад тонкошарове імунне фарбування [7,8], високоефективна тонкошарова хроматографія (HPTLC) [9], спектрофотометрія [10]. ] та мас-спектрометрії (МС) [11].

Враховуючи цінну інформацію, яку можуть надати гангліозиди як молекулярні маркери нейронної тканини [12], і обмежені дані, наявні на даний момент щодо виявлення та характеристики глікосфінголіпідів у сечі пацієнтів з ДЗ, ми розробили та впровадили кращий метод, заснований на на наноелектроспреї (nanoESI) MS високої роздільної здатності (HR) для визначення гангліозидів у сечі хворих на ЦД. Цей варіант для HR MS керувався перевагами цього методу в аналізі складних сумішей гангліозидів, екстрагованих із сечі людини. Підвищена роздільна здатність приладу: (i) дозволяє виявити іони з близькими значеннями m/z, які інакше не можна було б розрізнити в гетерогенному багатокомпонентному зразку, що містить види різної довжини та архітектури гліканового ланцюга та різного складу керамід; (ii) в основному усуває потребу в розділенні суміші методами рідинної хроматографії чи електрофорезу перед проведенням МС-аналізу; (iii) забезпечує високу точність маси, що значно підвищує надійність структурної ідентифікації; і (iv) пропонує не тільки краще уявлення про складність гангліозидому, асоційованого з DM, але також дані про види з потенційною роллю біомаркера на основі високої впевненості у визначенні маси як для молекулярних, так і для фрагментних іонів.

Це пілотне дослідження з метою характеристики гангліозидів сечі з біомаркерними ролями врання діагностика DKD, було зосереджено на: (а) тестуванні здійсненності та ефективності HR MS і тандемної MS (MS/MS) за допомогою високоенергетичної дисоціації, спричиненої зіткненням (HCD) у картографуванні ниркових гангліозидів у пацієнтів із ЦД 2 типу; (b) визначення змін у експресії нативних сумішей гангліозидів із зразків сечі пацієнтів із ЦД 2 типу в порівняльному аналізі зі здоровими особами контролю та характеристика виявлених біомаркерів. Для цього ми оптимізували сучасну біоаналітичну платформу на основі nanoESI HR MS на приладі Orbitrap, налаштованому на роботу в режимі негативних іонів як у MS-скринінгу, так і MS/MS-фрагментації для детального структурного аналізу.

2. Результати та їх обговорення

2.1. Порівняльний скринінг зразків за допомогою nanoESI HR MS

Зразки гангліозидів A1, A2, A3 і C вливали за допомогою nanoESI один за одним в Orbitrap MS і перевіряли в режимі негативних іонів за ідентичних інструментальних умов. У кожному випадку сигнал загального іонного струму (TIC) отримували протягом 2 хвилин, генеруючи спектри з накопичення 100 сканувань. Завдяки високій чутливості методу, навіть за умов, що обмежували час, отримані мас-спектри мали високе відношення сигнал/шум і насичену структуру молекулярних іонів.

Оцінка даних картування, отриманих за однакових умов, виявила значні відмінності в кількості та типі гангліозидних компонентів, експресованих у зразках A1, A3 та C, тоді як відмінностей між зразками A1 та A2 не спостерігалося. Ці результати підсумовані в таблиці 1, де порівняльно перераховані структури, ідентифіковані в нативних сумішах A1, A3 і C, разом із експериментальними значеннями m/zexp виявлених сигналів і теоретичними значеннями m/ztheor, що відповідають запропонованим структурам.

Висока роздільна здатність і точність маси використовуваної платформи MS покращили дискримінацію та ідентифікацію на основі точних вимірювань маси не менше ніж 37 різних компонентів гангліозидів і фукогангліозидів сечі в трьох зразках. Виявлені види належать до 15 різних класів, включаючи модифікації основного гліканового ланцюга (табл. 2), і їм присвоєно чудову середню точність визначення маси 4 ppm.

Детальна оцінка структур у таблиці 1 показала, що з усіх зразків суміш A3, яка відповідає макроальбумінурії (отже, пізній стадії DKD), містить найбільшу кількість окремих гангліозидних сполук, тобто 19, за якою слідує зразок C з 12 різними видами та зразок A1 з 10.

Порівняно зі зразками A1 і C, A3 також: (i) охоплює найбільшу кількість видів з найдовшим ланцюгом О-гліканів, що належать до класу G1, і найбільше розмаїття керамідних композицій; (ii) представляє найбільшу кількість виражених класів гангліозидів -12 проти лише 6 у зразку A1 та 6 у зразку C відповідно; (iii) містить найбільшу кількість гангліозидів, які демонструють сахаридне ядро, змінене невуглеводним O-ацетилом, а також вуглеводним O-фукозилом і O-GalNAc біологічно відповідними модифікаціями; (iv) є єдиним екстрактом сечі, що містить гангліозидні структури, модифіковані шляхом приєднання O-GalNAc, а саме GalNAc-GS1(t18:1/18:0), виявлений як чотиришарова депротонована та натрієва молекула при m/z 1176,8266 , і GalNAc-GQ1(d18:1/18:0), як подвійно депротоновану молекулу при m/z 1310.1271. Як видно на малюнках 1a–c, які показують частку класів гангліозидів, виражених у трьох зразках, і на порівняльній гістограмі, зображеній на малюнку 2, екстракт A3 демонструє особливий статус сіалілювання, в якому переважають полісіалосполуки. За винятком моносіалільованої гангліотетраози GM1(d18:1/16:1), визначеної як [M-2H+ ] 2− при m/z 756,9078, і моносіалільованої GM3(d18:0/24: 0), виявлений як подвійно депротонована молекула при m/z 645,3956, усі 17 інших видів містять більше одного залишку Neu5Ac у своєму глікановому фрагменті. Крім того, оскільки було виявлено не менше семи трисіало GT1, чотирьох пентасіало GQ1 і навіть гептасіалільований GS1, очевидно, поряд із збільшеною кількістю та різноманітністю структур, довжиною гліканових ядер та їх периферичними модифікаціями, високе загальне сіалілювання вміст являє собою ще одну особливість макроальбумінурії.

Таблиця 1. Види гангліозидів були ідентифіковані в зразках A1, A3 і C за допомогою (-) скринінгу наноESI Orbitrap MS. г: дигідроксильована сфінгоподібна основа; t: тригідроксильована сфінгоподібна основа.

Клінічно значиме спостереження також випливає з порівняльного аналізу A1 проти C. У той час як у контрольному зразку C найвищий ступінь сіалілювання виявлених гангліозидів дорівнює 4, визначеним через дві тетрасіалільовані гангліотетраози GQ1, що відрізняються за складом їхнього ліпідного аглікону, у зразку A1 найвищий ступінь сіалілювання дорівнює 4. Поруч із ди-, три- та тетрасіалільованими гангліозидами суміш A1 містить пентасіалогангліотетраозу GP1(d18:1/18:0), яка визначається як іон [M-4H+ ] 4− за m/z 676,5569, якому було присвоєно чудову точність маси 2,95 ppm. Такі дані, пов’язані зі статусом сіалілювання досліджуваних зразків, показують, що ступінь сіалілювання ниркових гангліозидів відповідає ознакі C < A1 < A2=A3, спостереження, яке підкреслює передчасність цих модифікацій навіть на стадії нормоальбумінурії Хворі на ЦД 2 типу. Ступінь сіалілювання зростає з прогресуванням захворювання, що робить його молекулярним параметром, який слід враховувати не лише для раннього виявлення ДЗН, але й для оцінкиПрогресування DKDіефективність лікування.

Таблиця 2. Табличне представлення ідентифікованих класів гангліозидів сечі разом з їх диференціальною експресією в зразках A1, A3 і C. Символи: x=клас виявлено; -=клас не виявлено.

Детальний огляд будови агліконів показує, що, за винятком помітних відмінностей у складі гліканового ланцюга, гангліозиди, експресовані в трьох зразках, також виявляють відмінності в структурі своїх керамідів. Найбільш очевидні зміни ліпідної частини пов’язані з менш поширеним процесом тригідроксилювання сфінгоїдної основи, який відбувається в сумішах гангліозидів A1 і A3, і незвичайною довжиною ланцюгів жирних кислот, присутніх виключно в A3. Було виявлено, що кожен із зразків A1 і A3 містить два види з тригідроксильованими сфінгоподібними основами кераміду. Отже, GT1(t18:0/18:0) і GT1(t18:0/20:0) були виявлені у зразку A1, тоді як більше у зразку А3 виявлено складні тригідроксильовані структури GT1(t18:1/24:3) та Fuc-GT3(t18:1/18:3).

Примітно, що зразок A3 також демонструє ознаки видів, що містять дуже довголанцюгові жирні кислоти (VLCFA). VLCFA вважається рідкісною ліпідною структурою, яка містить від 23 до 27 атомів вуглецю в ланцюзі жирної кислоти. Чотири такі незвичайні види VLCFA, що несуть 24 атоми вуглецю в ланцюзі жирної кислоти, були виявлені у зразку A3: GM3(d18:0/24:{{10}}), GT1(t18:1 /24:3), O-Ac GT1(d18:0/24:0) і Fuc-GT1(d18:0/24:0), з яких одна структура також характеризується незвичайним тригідроксилюванням сфінгоїдної основи та трьома подвійними зв’язками в ланцюзі жирної кислоти, тоді як дві структури представляють приєднання до гліканового ядра O-Ac та фукозильної групи відповідно.

Ці характеристики церамідних частин у зразках А1 і А3, які не були виявлені в контрольному зразку; подібність між A1 і A2; і помітні відмінності, виявлені в A3, свідчать про те, що, поряд із вуглеводним складом і статусом сіалілювання, структура ліпідного фрагмента в ниркових гангліозидах є ще одним можливим маркером раннього DKD. Крім того, зміни в складі церамідів залежать від стадій альбумінурії; складні цераміди, що виявляють тригідроксилювання сфінгоподібної основи та VLCFA, здається, пов’язані з прогресуючими стадіями альбумінурії. Враховуючи, що незвичайна кількість трьох подвійних зв’язків у ланцюзі жирної кислоти була виявлена ​​лише у зразку A3 через два різні види, Fuc-GT3(t18:1/18:3) і GT1(t18:1/24:3), мабуть, механізм утворення подвійного зв'язку також пов'язаний з прогресуванням DKD.

Негативні ефекти, спричинені накопиченням ліпідів у нирках, як на рівні клубочків, так і на канальцях, є клітинно-специфічними. Крім того, ліпотоксичність пов'язана з різними типами ліпідів, серед яких гангліозиди відіграють центральну роль [13].

Вміст гангліозидів у нирках, серед інших класів ліпідів, був підвищений у подоцитах, а також у клітинах проксимальних канальців у мишачої моделі DN [14]. Проксимальні канальці можуть піддаватися впливу високих рівнів сечових ліпідів, включаючи гангліозиди, через збільшення вмісту жирних кислот на молекулу альбуміну на ранніх стадіях DKD [15]. Прямі наслідки накопичення ліпідів у сегментах нефрону пов’язані зі структурними та функціональними змінами, які призводять до порушення процесингу альбуміну на ранніх стадіях ЦД 2 типу.

Переважна більшість досліджень, спрямованих на характеристику ниркового гангліозиду, спираються на експериментальні моделі діабетичної нефропатії. Наскільки нам відомо, це перше трансляційне дослідження на людях від фундаментальних досліджень до клінічної застосовності, щоб повідомити про певний патерн гангліозидів сечі у пацієнтів із ЦД 2 типу. Практичне значення нашого дослідження полягає в демонстрації зв’язку ступеня сіалілювання сечових гангліозидів і структури їх церамідів з ранньою DKD, стадійованою за рівнем альбумінурії.

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК