Ефект біоактивних сполук, виділених із шкаралупи арахісу за допомогою ультразвукової екстракції, на відбілювання шкіри та проти зморшок

Контактна особа:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 і Jin Woo Kim 1,2,3,*

Анотація:Для оптимізації умов екстракції за допомогою ультразвуку (UAE) використовували методологію відповідної поверхні для одночасної оптимізації залежних змінних, включаючи активність поглинання радикалів DPPH (RSA), інгібування активності тирозинази (TAI) і інгібування активності колагенази (CAI) екстрактів шкаралупи арахісу. Вплив основних змінних, включаючи час екстракції (5.0~55.0 хв, X1), температуру екстракції (26.0~94.0 ◦C , X2) і концентрація етанолу (0.0 відсотків ~99,5 відсотків , X3) були оптимізовані. На основі експериментальних значень для кожної умови були отримані моделі квадратичної регресії для прогнозування оптимальних умов. Коефіцієнт детермінації (R2) незалежної змінної був у діапазоні 0.89~0.96, що демонструє, що регресійна модель підходить для прогнозу. При прогнозуванні оптимальних умов ОАЕ на основі методу накладення було визначено час екстракції 31,2 хв, температуру екстракції 36,6 ◦C і концентрацію етанолу 93,2%. За цих умов було передбачено RSA 74,9 відсотка, TAI 50,6 відсотка та CAI 86,8 відсотка, що добре узгоджується з експериментальними значеннями. Полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції показала, що екстракт шкаралупи арахісу знижує рівень мРНКтирозиназа-споріднені гени протеїну-1 та матриксної металопротеїнази-3 в клітинах B16-F0. Тому ми визначиливідбілювання шкіриі ефекти екстрактів арахісової шкаралупи проти зморшок на рівнях експресії білка та генів, і результати показують, що шкаралупа арахісу є ефективним косметичним матеріалом длявідбілювання шкіриі ефекти проти зморшок. Виходячи з цього дослідження, шкаралупа арахісу, яка вважалася побічним продуктом, може бути використана для розробки здорової їжі, ліків і косметики.

Ключові слова:шкаралупа арахісу; оптимізація;відбілювання шкіри; проти зморшок; антиоксидантний;тирозиназа; колагеназа; протеїн, пов’язаний із тирозиназою людини-1 (TRP-1); матрична металопротеїназа (ММР)

Клацніть, щоб організувативідбілюючі засоби по догляду за шкірою Cistanche.

1. Введення

Меланін — полімерний пігмент коричневого або чорного кольору, який синтезується з меланосом меланоцитів в епідермісі. Його основна функція – блокувати ультрафіолетові (УФ) промені для захисту шкіри. Крім того, його надмірне виробництво може спричинити пігментні потемніння, такі як мелазма, родимки та вікові плями [1–3]. Тирозиназа є основним ферментом, який каталізує реакції автоокислення та полімеризації, за допомогою яких тирозин перетворюється на допахінон через дигідроксифенілаланін і виробляє меланін через допахром під час біосинтезу меланіну [4]. Таким чином, він широко використовується для зменшення або ослаблення вироблення меланіну шляхом інгібуваннятирозиназаактивність з метою посилення відбілюючої дії косметичних засобів [5]. Швидка індустріалізація та збільшення використання хлорфторвуглецю серйозно пошкодили захисний озоновий шар землі, в результаті чого більша кількість ультрафіолетового випромінювання досягає землі та оголює шкіру. Це збільшення УФ-випромінювання, як наслідок, викликає активне утворення активних форм кисню (АФК) в організмі людини, таких як супероксид-аніони, перекиси водню та гідроксильні радикали. Такі види сприяють безперервному окисленню тирозину, що призводить до збільшення виробництва меланіну. У зв'язку з цим активно ведуться дослідження по пригніченнютирозиназадіяльності, а також видалення ROS з метою розвиткувідбілювання шкіриагенти [6]. Колаген є основним позаклітинним матриксом, який складається з 90 відсотків дерми. Колаген захищає та надає шкірі еластичність, бере участь у механічній жорсткості шкіри, стійкості, зв’язуванні сполучних тканин, а також у проліферації та диференціації клітин [7]. Білки, які утворюють позаклітинний матрикс, такі як колаген, розкладаються колагеназою, такою як матриксна металопротеїназа (ММР), викликаючи зморшки, зниження пружності та провисання шкіри [8]. Різні типи MMP, які експресуються ROS, гідролізують колагеновий ланцюг, сполучну тканину шкіри та створюють її аномальне зшивання, щоб збільшити розпад колагену та прискорити утворення зморшок [9]. З цієї причини пригнічення вироблення меланіну та розпаду колагену шляхом зменшення утворення АФК було основним напрямком для відбілювання шкіри та запобігання зморшкам [10]. Арбутин, койєва кислота та ліноленова кислота як відбілюючі косметичні засоби та ретинол, галлат і аденозин як антибіотики -косметика від зморшок, широко використовується в останні роки. Однак використання цих матеріалів обмежене, враховуючи їх нестабільність у присутності світла та тепла, а також побічні реакції, включаючи подразнення шкіри та контактний дерматит [11]. Зі зростанням інтересу до природних антиоксидантів для подолання недоліків звичайних інгредієнтів для відбілювання та боротьби зі зморшками рослинні екстракти активно використовувалися для розробки біологічно активних сполук для безпечних для шкіривідбілюванняі косметика проти зморшок [12,13].

Існують різні методи екстракції, які в даний час використовуються для вилучення біоактивних сполук з рослин. Однак екстракція біологічно активних сполук з природних джерел, особливо рослин, в основному проводилася за допомогою методів екстракції розчинником, гарячою водою та методом Сокслета, які показали різні недоліки, включаючи низьку ефективність екстракції, розкладання інгредієнтів, низьку стабільність і високу вартість експлуатації. [14]. Таким чином, нещодавно були протестовані методи екстракції, включаючи екстракцію за допомогою ультразвуку, мікрохвильової печі та надкритичну екстракцію [15]. Зокрема, ультразвук — це звукова хвиля з частотою приблизно 20 кГц або більше, яка призводить до стиснення, кавітації та розрідження рідини, таким чином максимізуючи молекулярний рух за короткий час для досягнення високої ефективності вилучення [16]. Крім того, перевага ультразвуку полягає в тому, що його короткий час екстракції мінімізує розкладання біологічно активних сполук, і його оцінюють як ефективний метод вилучення природних інгредієнтів за допомогою антиоксидантів,відбілювання, а також властивості проти зморшок багатьох рослин і трав [17]. Оптимізація умов екстракції має важливе значення для підвищення ефективності екстракції за допомогою ультразвуку (ОАЕ), і процес оптимізації може виконуватися експериментальними або статистичними методами. Традиційний однофакторний метод, коли всі змінні залишаються постійними та змінюються лише один фактор за раз, має обмеження у визначенні інтерактивних ефектів, якщо це багатоваріантний експеримент. З іншого боку, RSM надає статистичну інформацію про кореляцію між змінними в багатофакторних експериментах, а також результативні експерименти з використанням мінімальної кількості зразків, а також важливі математичні та статистичні методи для оцінки ефективності та придатності регресійної моделі. Для оптимізації на основі статистики, Широко використовувалися різні дизайни RSM, такі як повний факторний дизайн, дизайн Box-Behnken і центральний композитний дизайн (CCD). Серед них CCD є дуже ефективним і, таким чином, надає багато інформації про експериментальні змінні ефекти та загальну експериментальну помилку, з мінімальною кількістю необхідних прогонів [18]. Тому в багатьох існуючих дослідженнях CCD широко використовувався для розробки, покращення та оптимізації процесу умови вилучення різноманітних антиоксидантів та інших метаболітів із природних продуктів.

Арахіс (Arachis hypogaea) — однорічна рослина сімейства бобових. Його вирощують у понад 50 країнах світу, включаючи Південну Корею, Індію, Китай та США [19]. Арахіс є багатим джерелом білка (25 відсотків), ліпідів (47 відсотків) і вуглеводів (16 відсотків), а також мінералів, вітамінів, ніацину, ненасичених жирних кислот, андолеїнових кислот [20]. Їх споживають у вигляді необроблених або оброблених продуктів, включаючи горіхи, масло та кулінарну олію. За оцінками, щорічне виробництво арахісу в світі становить 4,1 мільйона тонн, а шкаралупа арахісу становить 35-40 відсотків від загальної ваги арахісу [21]. За оцінками, понад 1,5 мільйона тонн шкаралупи арахісу щорічно викидається як побічний продукт. Однак, враховуючи, що лише частина арахісової шкаралупи використовується як корм для тварин і більшість із них спалюється або захоронюється, що спричиняє витрати на утилізацію та екологічні проблеми, необхідно виробляти матеріали з високою доданою вартістю, використовуючи арахісову шкаралупу, щоб подолати проблему побічних продуктів [22]. ]. Попередні дослідження антиоксидантів показали, що екстракти шкірки арахісу мають протизапальну дію та дію проти ожиріння [23,24]. Проте досі немає досліджень щодо виробництва функціональних косметичних матеріалів для оздоровленнявідбілюванняі ефект проти зморшок за допомогою біоактивних сполук зі шкаралупи арахісу. Таким чином, у цьому дослідженні біологічно активні сполуки екстрагували зі шкаралупи арахісу за допомогою ультразвукової екстракції (UAE), щоб підтвердити їх антиоксидантний, відбілюючий ефект і дію проти зморшок, а також представили оптимальний стан UAE за допомогою методу поверхні відгуку (RSM) і підвищили функціональність екстрактів. з метою підтвердження можливості його використання в якості харчових, косметичних і лікувальних інгредієнтів.

2. Результати та їх обговорення

2.1. Встановлення моделей RSM

У цій роботі температуру екстракції, час екстракції та концентрацію етанолу було обрано як основні змінні ПЗЗ за допомогою попереднього експерименту з одним фактором за раз для визначення значущих змінних, що впливають на ОАЕ (Таблиця 1).

Потім було побудовано 17 експериментальних циклів, включаючи 3 повторення в центральній точці з використанням 3-змінних і 5-рівневої ПЗЗ. Експериментальні помилки були зведені до мінімуму шляхом рандомізації експериментального порядку, щоб мінімізувати вплив незрозумілої мінливості. Експериментальні та прогнозовані результати для активності поглинання радикалів DPPH (RSA),тирозиназаінгібування активності (TAI) та інгібування активності колагенази (CAI) показано в таблиці 2.

Щоб визначити кореляцію між 17 експериментальними серіями експериментальних умов ПЗЗ та експериментальними результатами, були запропоновані моделі множинної регресії для прогнозування оптимальних рівнів цих 3 змінних. Застосовуючи множинний регресійний аналіз до експериментальних даних, залежні змінні (Y) і перевірені змінні були пов’язані наступними рівняннями квадратичної регресії (Таблиця 3).

Дисперсійний аналіз (ANOVA) — це статистичний тест для аналізу експериментальних даних. Він підрозділяє загальну варіацію в наборі даних на складові частини, які пов’язані з конкретними джерелами варіації, щоб перевірити гіпотезу щодо змінних моделі або оцінити компоненти дисперсії [25]. Аналіз поверхні відгуку та ANOVA були використані для визначення коефіцієнтів, оцінки статистичної значущості умов моделі та підгонки математичних моделей експериментальних даних, які мали на меті оптимізувати загальну область для змінних відповіді [26]. Як встановлено моделлю, коефіцієнти кореляції (R2), використані для визначення зв’язку між експериментальними та прогнозованими реакціями регресійними моделями, були в діапазоні 0.8862~0.9622. Це свідчить про те, що проаналізовані змінні процесу пояснюють понад 88,6 відсотка незалежних змінних. Програмне забезпечення Design-Expert було використано для розрахунку коефіцієнтів рівнянь квадратичної регресії, а придатність моделі перевірено методом ANOVA. Відповідно до мономіального коефіцієнта значення рівнянь квадратичної регресії наведено в таблиці 4, і порядок пріоритету серед основних ефектів незалежних змінних є концентрація етанолу (X3) > температура екстракції (X2) > час екстракції (X1).

2.2. Вплив умов вилучення на RSA

У таблиці 2 наведено експериментальні дані RSA відповідно до різних умов ОАЕ. RSA екстракту шкаралупи арахісу було визначено в діапазоні 7,6% ~89,9%. Найвищий RSA був визначений за таких умов екстракції: час екстракції 55.0 хв, температура екстракції 60.{{10}} ◦C і концентрація етанолу 5 0.0 відсотків (Виконання №10). Найнижчий RSA 7,6 відсотка за часу екстракції 30.0 хв, температури екстракції 60,0 ◦C і концентрації етанолу 0,0 відсотка було визначено як експериментальне значення (прогон №13). . Застосовуючи множинний регресійний аналіз, експериментальні дані та відповіді були пов’язані рівняннями квадратичної регресії (Таблиця 3). Статистичний аналіз показав, що R2 регресійної моделі становив 0,9308 (p=0,0027), що вказує на те, що це рівняння могло пояснити 93,0 відсотка результатів експериментальних умов, означаючи, що модель була дуже важливою та могла використовуватися для точного прогнозування функція відповіді.

Вплив окремої змінної UAE на фіксованих рівнях інших змінних на RSA передбачено та показано на малюнку 1a. RSA має тенденцію до збільшення, а потім до зменшення зі збільшенням усіх змінних UAE. Концентрація етанолу мала найбільший вплив на RSA серед трьох змінних UAE, тоді як час екстракції та температура екстракції мали найменший вплив на RSA. Цей результат узгоджується з результатами ANOVA, у яких концентрації етанолу показали більш значний вплив (p=0.0002) на RSA, як показано в таблиці 4. Ефект взаємодії між незалежними змінними на RSA було візуалізовано за допомогою 3D криві поверхні відгуку. Температуру екстракції та час екстракції змінювали одночасно при фіксованому рівні концентрації етанолу (рис. 2A). Коли дві змінні (температура екстракції та час) зростали, RSA збільшувався до максимального рівня, а потім знову знижувався. Найвищий RSA був отриманий при температурі екстракції 56,1 ◦C, що, таким чином, передбачає, що екстракція біологічно активних сполук з антиоксидантним потенціалом, таких як поліфеноли, збільшується з руйнуванням компонентів стінок рослин, таких як лігнін, при температурах до 56,1 ◦C; однак при більш високих температурах RSA зменшувався через розкладання або полімеризацію антиоксидантних інгредієнтів. На малюнках 2B, C показано, що на RSA істотно не вплинув час або температура екстракції, тоді як на RSA значно вплинула концентрація етанолу, яка була найвищою при концентрації етанолу 61,0 відсотка, і яка також знову знизилася. Цей результат узгоджується з результатом експерименту з екстракції гарячою водою Lespedeza cuneata, проведеного Кімом та ін. в якому на RSA більше впливала концентрація етанолу, ніж температура екстракції, а RSA був максимальним у діапазоні концентрації етанолу 60-70 відсотків [27]. Ці результати вказують на те, що ефективність екстракції бінарним розчинником (водою та етанолом) ефективніша для екстракції одним розчинником в ОАЕ шкаралупи арахісу.

2.3. Вплив умов екстракції на TAI

Тирозиназаце фермент, який сприяє виробленню меланіну шляхом окислення тирозину в базовому шарі епідермісу, і інгібування цього ферменту має важливе значення для посиленнявідбілювання шкіри [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >температура екстракції (p < {{0}}.0598) > час екстракції (p < 0,4329), що підтвердило, що вплив концентрації етанолу був найбільш значущим у TAI.

Для порівняння впливу умов ОАЕ на TAI використовувався графік збурень, щоб оцінити вплив окремих змінних на TAI шляхом фіксації двох змінних у центральній точці. Як показано на малюнку 1b, TAI показав іншу картину порівняно з попереднім експериментом RSA; воно збільшувалося зі збільшенням концентрації етанолу, тоді як час екстракції істотно не впливав на TAI. Значне пропорційне збільшення TAI з концентрацією етанолу можна пояснити результатами ANOVA. На TAI суттєво вплинув основний член концентрації етанолу (X3), і (p < 0.05)="" квадратичний="" член="" не="" є="" статистично="" значущим,="" таким="" чином,="" демонструючи="" сильну="" пропорційну="" залежність="" між="" tai="" та="" концентрацією="" етанолу.="" тривимірна="" поверхнева="" крива="" відгуку="" є="" графічним="" зображенням="" рівняння="" квадратичної="" регресії="" та="" результатів="" tai,="" залежно="" від="" температури="" екстракції="" (x1),="" часу="" екстракції="" (x2)="" і="" концентрації="" етанолу="" (x3).="" на="" рисунку="" 3а="" показано="" взаємодію="" часу="" екстракції="" та="" концентрації="" етанолу="" на="" tai.="" результат="" підтвердив,="" що="" час="" екстракції="" не="" показав="" істотного="" впливу="" на="" tai,="" тоді="" як="" концентрація="" етанолу="" мала="" сильну="" пропорційну="" залежність="" від="" tai.="" подібним="" чином,="" як="" показано="" на="" малюнку="" 3b,="" tai="" більше="" залежав="" від="" концентрації="" етанолу,="" ніж="" від="" температури="" екстракції,="" і="" найвищий="" tai="" був="" досягнутий,="" коли="" концентрація="" етанолу="" зросла="" до="" 99,5="" відсотків.="" при="" дослідженні="" умов="" оае="" для="" максимального="" tai="" максимальні="" значення="" умов="" tai="" були="" передбачені="" як="" 3{{20}}.0="" хв,="" 26,3="" ◦c="" і="" 99,5="" відсотка.="" цей="" результат="" подібний="" до="" того,="" про="" який="" повідомляють="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" у="" дослідженні="" біологічної="" активності="" листя="" цитрону,="" коли="" 20,0="" %="" ~="" 80,0="" %="" етанолу="" використовували="" як="" розчинник="" для="" екстракції,="" tai="" збільшувався="" пропорційно="" у="" відповідь="" на="" збільшення="" концентрації="" етанолу="" та="" показав="" максимальне="" значення="" при="" екстракції="" з="" використанням="" 80="" %="" етанолу.="" це="" свідчить="" про="" те,="" що="" використання="" вищої="" концентрації="" етанолу="" є="" вигідним="" для="" вилучення="" біоактивних="">відбілювання шкіриефект від шкаралупи арахісу або інших рослин.

2.4. Вплив умов екстракції на CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >концентрація етанолу (p=0.0240) > час екстракції (p=0.8505), таким чином вказуючи на те, що вплив температури екстракції та концентрації етанолу був значним на CAI.

На малюнку 1c показано графік збурень, на якому дві змінні фіксовані, і він візуалізує вплив однієї змінної на CAI. Було показано, що вплив усіх трьох змінних на CAI є подібним, і три змінні показали значний вплив і збільшували, а потім зменшували CAI, коли кожна незалежна змінна зростала. У нашому дослідженні були розроблені тривимірні криві реакції поверхні для візуалізації взаємодії двох незалежних змінних у CAI за допомогою рівнянь квадратичної регресії (рис. 4). Коли концентрація етанолу була зафіксована в центральній точці, вплив часу екстракції та температури на CAI було оцінено на малюнку 4A. Оскільки дві змінні змінювалися одночасно, CAI збільшився до 33,4 хв і 76,8 ◦C і знову знизився після максимального CAI 92,8 відсотка. Як показано на малюнку 4B, C, CAI мав найвище значення при концентрації етанолу 64,3 відсотка, демонструючи тенденцію до поступового зниження згодом, що свідчить про те, що бінарний розчинник, що складається з 64,3 відсотка етанолу, є більш придатним як розчинник для екстракції. Цей результат узгоджується з попередніми дослідженнями, які повідомляли, що бінарний розчинник води та етанолу показав вищий CAI, ніж вода, при екстракції біологічно активних сполук з Orostachys japonica, що свідчить про те, що 50-відсотковий етанол буде більш вигідним для екстракції.відбілювання шкіриінгредієнти [34]. Максимальний CAI екстракту шкаралупи арахісу, передбачений моделлю квадратичної регресії, становив 94,5 відсотка, що було отримано за умов часу екстракції 45,1 хвилини, температури екстракції 93,6 ◦C і концентрації етанолу 42,3 відсотка. CAI, отриманий у нашому дослідженні, становив 94,5 відсотка, що більш ніж удвічі перевищує вплив 39,4 відсотка та 40,3 відсотка значень CAI екстрактів зеленого чаю, повідомлених Oh et al. [35].

2.5. Оптимальні умови екстракції

антиоксидант,відбілювання шкіриЕфекти проти зморшок є важливими функціями для косметики, і необхідно визначити умови, які можуть максимізувати ці три функції одночасно для оптимізації умов ОАЕ. На рисунку 5 показано процедуру оптимізації, яка може одночасно максимізувати RSA (Y1), TAI (Y2) і CAI (Y3) шляхом накладення кожної оптимальної умови контурного графіка, отриманого за допомогою рівняння квадратичної регресії. Діапазони незалежних змінних для оптимізації трьох змінних були обмежені часом екстракції 5.0~55.0 хв, температурою екстракції 26.{{10}}~94 0 ◦C і концентрація етанолу 0.0 відсотка ~99,5 відсотка (Таблиця 5). Згідно з індивідуальними оптимальними умовами екстракції, оптимальні умови UAE становили 31,2 хвилини часу екстракції, 36,6 ◦C температури екстракції, 93,2 відсотка концентрації етанолу та, за вищезазначених умов, RSA 74,9 відсотка, TAI 50,6 відсотка та CAI 86.8 відсотків було передбачено. Коли прогнозовані значення RSA, TAI і CAI порівнювалися з тими, що були отримані в результаті експерименту для перевірки, значення тесту перевірки були подібними до прогнозованих значень, де значення становили 78,2 відсотка, 52,3 відсотка та 87,7 відсотка відповідно.

2.6. Порівняння SE та ОАЕ

Щоб підтвердити ефективність екстракції UAE, ми порівнюємо RSA, TAI та CAI екстракту шкаралупи арахісу, отриманого за допомогою методів UAE та екстракції Сокслета (SE). Коли SE проводили в загальних умовах SE з використанням 99,5 відсотка етанолу при 70 ◦C протягом 4 годин часу екстракції, було виявлено, що RSA, TAI та CAI становили 75,5 відсотка, 60,2 відсотка та 74,4 відсотка, що не було значно відрізняються від результатів, отриманих за оптимальних умов ОАЕ. Однак, коли умови SE були встановлені рівними оптимальним умовам ОАЕ 31,2 хв і 93,2 відсотка етанолу, RSA, TAI і CAI зменшилися на 62,0, 28,3 і 45,6 відсотка відповідно, порівняно з ОАЕ за оптимальних умов. Перевага ультразвуку у виробництві корисних матеріалів із шкаралупи арахісу була оцінена як процес, придатний для високої продуктивності та індустріалізації через низьке споживання розчинника та короткий час екстракції.

2.7. Експресія мРНК MMP-3 і TRP-1

У меланоцитах ссавців меланогенез і гідроліз колагену контролюються генами TRP і MMP відповідно, а TRP{{0}} і MMP-3 відомі як основні гени для регуляції меланогенезу і гідролізу колагену; тому було проведено аналіз RT-PCR на лізатах цілої клітини B16-F0 клітин і ефект екстракту шкаралупи арахісу, виробленого з ОАЕ за оптимальних умов (31,2 хв, 36,6 градуса, 93,2 відсотка) на експресію мРНК MMP-3 і TRP-1. Як показано на малюнку 6, екстракт шкаралупи арахісу значно знижував експресію MMP-3 і TRP-1 у клітинах B16-F0, коли експерименти з експресією генів проводилися з арахісом діапазон концентрації екстракту шкаралупи 0~1 мг/мл. Екстракт шкаралупи арахісу значно знижував експресію MMP-3 і TRP-1 у 6.1-разів і 8.7-разів відповідно при 1.0 мг /мл. Ці результати свідчать про те, що екстракт шкаралупи арахісу пригнічує деградацію колагену в клітинах B16F0 шляхом інактивації MMP 3 до інактивації MMP-1 і перешкоджає взаємодії MMP-9 [36]. Існуючі дослідження показали, що лікування рослинними екстрактами пригнічує експресію асоційованого з мікрофтальмією фактора транскрипції (MITF) шляхом фосфорилювання позаклітинної сигнально-регульованої протеїнкінази (ERK). Таким чином, інгібуючий ефект вироблення меланіну екстрактом шкаралупи арахісу пояснюється пригніченнямтирозиназаактивності через інгібування експресії ERK і MITF [37]. Таким чином, екстракти шкаралупи арахісу знижують рівні експресії мРНК TRP-1 і MMP-3, що вказує на те, що екстракт шкаралупи арахісу має сильну інгібіторну дію на колагеноліз і меланогенез, що робить його чудовим косметичним матеріалом звідбілювання шкіриі ефект проти зморшок.

3. Матеріали та методи

3.1. Матеріали та реагенти

Шкаралупу арахісу було придбано в магазині Nonghyup (Гочанг, Чонбук, Корея) 20березня 19 р., і шкаралупу сушили при 60 ◦C за допомогою сухої печі (FC 49, Lab House, Сеул, Корея) протягом 24 годин до суха маса залишалася постійною. Висушену шкаралупу арахісу подрібнювали за допомогою кухонного комбайна (Hanil HMF-3800, Сеул, Корея), а потім пропускали через сито 600 мкм. Етанол був придбаний у компанії Samchun chemical (95,0% об./об., Сеул, Корея). Реагент Фоліна-Чіокальтеу, галова кислота (97 відсотків) і кверцетин були придбані у Merck (Кенілворт, Нью-Джерсі, США). 2,2-дифеніл-1-пікрилгідразил (DPPH), аскорбінова кислота та 3,4-дигідрокси-L-фенілаланін (L-DOPA) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). Усі інші хімічні речовини, використані в цьому експерименті, були аналітичного класу та придбані в Sigma-Aldrich. Усі вихідні розчини готували очищеною деіонізованою водою з використанням системи очищення Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, США).

3.2. Екстракція за допомогою ультразвуку та екстракція Сокслета

Порошок арахісової шкаралупи (1 г) поміщали в екстракційну посудину, кожну з 10 мл розчинника, і змішували за допомогою вихрового змішувача (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея) для 1 хв. Екстракцію проводили шляхом циркуляції води в ультразвуковому екстракторі (250 Вт, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея) з використанням зовнішнього охолоджувального циркуляційного баню (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Корея). ) з цифровим таймером і регулятором температури. Екстракцію проводили за допомогою ультразвукового пристрою, оснащеного цифровим таймером і терморегулятором. Зразок піддавався ультразвуковій обробці протягом різних експериментальних тривалостей і температур на робочій частоті 40 кГц. Потім екстракт центрифугували при 10, 000 об/хв протягом 10 хв (236R, Labogene, Сеул, Корея). Після центрифугування об’єм зразка доводили до 5 мл і фільтрували через мембранний фільтр 0,2 мкм перед аналізом. Для екстракції Сокслета подрібнену шкаралупу арахісу (5 г) безперервно екстрагували 100 мл, використовуючи 99,5% етанол протягом 4 годин (8 циклів) при максимальній температурі 70 ◦C в апараті Сокслета. Техніка екстракції за допомогою ультразвуку виявилася дуже ефективною для екстракції олії з виноградних кісточок. Перевага ультразвуку, порівняно зі звичайними методами екстракції як для олії, так і для поліфенолів, була подібною, оскільки вихід олії/поліфенолів був отриманий за меншого споживання розчинника та коротшого періоду. час вилучення.

3.3. Експериментальний дизайн

Експериментальний дизайн проводився за допомогою CCD, типу RSM, щоб мінімізувати кількість експериментальних прогонів і вивчити взаємодію між факторами. Програмне забезпечення Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) було використано для планування експериментів, аналізу даних та оптимізації умов екстракції для максимізації екстракції біологічно активних сполук, що містять антиоксиданти,відбілювання шкіри, і ефект проти зморшок від шкаралупи арахісу. Експерименти були розроблені відповідно до CCD, представлені значення діапазону та центральної точки трьох незалежних змінних базувалися на результатах попередніх експериментів (Таблиця 1). CCD було застосовано для прогнозування оптимальних умов ОАЕ для максимізації відповідей, включаючи RSA, TAI і CAI від шкаралупи арахісу. Як незалежні змінні були обрані три змінні: час екстракції (X1), температура екстракції (X2) і концентрація етанолу (X3). Для оцінки відтворюваності було згенеровано 17 експериментальних серій із трьома повтореннями в центральних точках. Модель квадратичної регресії була використана для підгонки експериментальних даних і застосована для прогнозування змінних відповіді, як показано в рівнянні (1):

Y= 0 плюс 1X1 плюс 2X2 плюс 3X3 плюс 11X12 плюс 22X22 плюс 33X32 плюс 12X1X2 плюс 13X1X3 плюс 23X2X3 (1)

де Y - прогнозована відповідь; 0 – константа (перехоплення); 1, 2 і 3 — коефіцієнти регресії для членів лінійного ефекту; 11, 22 і 33 — члени квадратичного ефекту; а 12, 13 і 23 – умови ефекту взаємодії відповідно. Для визначення коефіцієнтів регресії та статистичної значущості умов моделі та підгонки математичних моделей експерименту було використано аналіз поверхні відгуку та ANOVA [38].

3.4. DPPH радикальна активність (RSA)

RSA екстракту шкаралупи арахісу був таким, як описано Pereira-Caro et al. [39]. Готували розчин 0.01 мМ DPPH у метанолі (95 відсотків) і 1,25 мл додавали до 0,25 мл розведеного екстракту. RSA визначали для вимірювання поглинання при 517 нм за допомогою УФ-вісспектрофотометра (UV1650PC, Shimadzu, Кіото, Японія) після 20 хвилин інкубації. Бланк готували з використанням дистильованої води, а RSA розраховували відповідно до наведеного нижче (рівняння (2)):

RSA (відсотки)={1 −Abs (зразок) /Abs (контроль) }× 100 (2)

3.5. Інгібування активності тирозинази (TAI)

TAI проводили відповідно до модифікованого методу з використанням L-DOPA як субстрату Jo et al. [40]. Зразки змішували з 200 мкл L-DOPA і 200 мкл калій-фосфатного буфера (рН 6,8) і 200 мклтирозиназа(125 Од/мл) додавали в пробірку та інкубували при 37 ◦C протягом 20 хв. Оптичну густину зразка вимірювали при 475 нм за допомогою спектрофотометра UV-Vis і результати порівнювали з контролем. Для кожної концентрації активність ферменту розраховували у відсотках порівняно з активністю аналізу з використанням буфера без будь-якого інгібітора, і TAI розраховували на основі наступної формули. (Рівняння (3)):

TAI (відсотки)={1 −Abs (контроль) − Abs (зразок) /Abs (контроль)} × 100 (3)

де Abs (контроль) – поглинання буфера плюс колагеназа; Abs (зразок) — це абсорбція буфера плюс колагеназа плюс зразок/стандарт.

3.6. Інгібування активності колагенази (CAI)

Вимірювання CAI екстрактів проводили модифікацією методів Wünsch і Heindrich [41]. Субстрат, 4-фенілазобезилоксилкарбоніл-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), розчиняли в 10 мл буфера до 1,2 мг/мл, потім додавали 125 мкл розчину та інкубували протягом 60 хв. при 37 ◦С. Колагеназу розчиняли в буфері до 0,4 мг/мл і до буферного розчину додавали 75 мкл розчину ферменту. Суміш фермент-субстрат інкубували на водяній бані при 37 ◦C протягом 30 хвилин і реакцію зупиняли додаванням 75 мкл 20% лимонної кислоти (мас./об.). Після додавання 1,5 мл етилацетату шар етилацетату відокремлювали та вимірювали поглинання при 320 нм. Відсоток інгібування розраховували за наступною формулою.

CAI (відсотки)={1 − [Abs (контроль) − Abs (зразок)] /Abs (контроль)} × 100 (4)

де Abs (контроль) – поглинання буфера плюс колагеназа; Abs (зразок) — це абсорбція буфера плюс колагеназа плюс зразок/стандарт.

3.7. Підтримка та культивування клітинних ліній

Клітини меланоми B16-F0, що продукують меланін, були отримані з Корейського банку клітинних ліній (KCLB, Чонно, Сеул, Корея) і культивувалися в модифікованому Дульбекко середовищі Ігла (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) з додаванням фетальної бичачої сироватки (FBS, 10 відсотків, Welgene, Gyeongsan, Korea) та розчину антибіотиків пеніциліну-стрептоміцину (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Трипсин-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) використовували для трипсинізації клітин. Усі використані матеріали належали до клітинної культури.

3.8. Полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції (RT-PCR)

RT-PCR проводили для вимірювання змін рівнів експресії генів MMP-3 і TRP-1, пов’язаних ізвідбілюванняі ефекти проти зморшок, B16-F0 клітини культивували в 24-лунковому планшеті, обробленому різними концентраціями екстракту шкаралупи арахісу в DMEM без сироватки, та інкубували протягом 24 годин. Необроблені контрольні клітини підтримували в тих самих умовах, що й досліджувана група під час експерименту. Виділення РНК із клітин проводили за допомогою AccuPrep® Universal RNA Extraction Kit (Bioneer, Daejeon, Korea). Комплементарну ДНК синтезували за допомогою AmfiRiert Platinum cDNA synthesis MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). Аналіз RT-PCR проводили за допомогою системи CFX 96 touch PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, США) для визначення рівнів мРНК. Використані такі праймери: MMP-3 смисловий, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 і антисмисловий, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; і TRP-1 сенс, 50-GCTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 і антисенс, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Відповідний набір праймерів, згаданих вище, використовувався для ампліфікації відповідних генів з використанням наступних умов циклу: 94 ◦C протягом 5 хвилин, потім 25 циклів при 95 ◦C протягом 5 секунд, 60 ◦C протягом 30 секунд (для MMP-3) , і 60 ◦C протягом 30 с (для TRP-1), і 72 ◦C для продовження 30 с. Продукти ПЛР піддавали електрофорезу на 1% агарозному гелі, фарбували бромідом етидію та візуалізували за допомогою Gel Doc TM XR плюс System and Quantity One software 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, США). Домашній білок, -актин, використовувався як контроль навантаження з припущенням, що рівні експресії цих білків залишаються постійними.

4. Висновки

У цьому дослідженні був застосований додатковий підхід для відновлення та використання біологічно активних речовин із сільськогосподарських побічних продуктів шкаралупи арахісу для розробки інгредієнтів із доданою вартістю для багаторазового використання. Перш за все, ми намагалися підвищити ефективність вилучення біологічно активних сполук з антиоксидантним ефектом, ефектом відбілювання шкіри та проти зморшок шляхом оптимізації процесу UAE. Таким чином, це дослідження використовувало ОАЕ для ефективного виробництва біоактивних сполуквідбілювання шкіриі ефект проти зморшок від шкаралупи арахісу та застосована статистична оптимізація для максимального одночасного збільшення RSA, TAI та CAI. Умови ОАЕ були оптимізовані за допомогою ПЗЗ, і було підтверджено, що вибір розчинника та концентрації слід враховувати при екстракції біологічно активних сполук із шкаралупи арахісу. Шляхом накладання поверхонь відгуку, криві трьох залежних змінних, час екстракції 31,2 хв, температура екстракції 36,6 ◦C і концентрація етанолу 93,2 відсотка були визначені як оптимальні умови ОАЕ. Було підтверджено, що RSA екстрактів шкаралупи арахісу є дуже високим і можна очікувати збільшення TAI та CAI, які є показникамивідбілювання шкіриі ефект проти зморшок, відповідно. Оптимізація умов в ОАЕ підтвердила збільшення виробництва біологічно активних речовин у шкаралупі арахісу, а також відбілюючий ефект і дію проти зморшок екстракту шкаралупи арахісу черезтирозиназаі зниження активності колагенази. Виходячи з цього, було оцінено вплив шкаралупи арахісу на рівні експресії MMP і TRP, щоб визначити, чи мають вони відбілюючий ефект і дію проти зморшок на рівні експресії генів. Ефекти відбілювання і боротьби з зморшками екстрактів шкаралупи арахісу підтверджено шляхом зниження регуляції Експресії мРНК, а також пригнічення експресії білка MMP-3 і TRP-1. Таким чином, доведено, що екстракт шкаралупи арахісу є ефективнимвідбілюванняі зменшення зморшок на рівні експресії білка та генів. Екстракт шкаралупи арахісу, отриманий з використанням ОАЕ, має високу антиоксидантну активність і чудовий ефект відбілювання шкіри та запобігання зморшкам, що надає шкаралупі арахісу великий потенціал як натурального косметичного та харчового інгредієнта. Крім того, вважається, що виробництво біологічно активних сполук з використанням ОАЕ може бути застосоване до процесу комерціалізації для виробництва косметики, продуктів харчування та фармацевтичних матеріалів, враховуючи вищий вихід продукції та знижені витрати на обробку порівняно зі звичайними процесами.