Генетика остеопонтину у пацієнтів із хронічною хворобою нирок: німецьке дослідження хронічної хвороби нирок Ⅳ

Базові змінні та вимірювання

Стандартизований набір біомаркерів вимірювали в центральній сертифікованій лабораторії з використанням стандартизованих протоколів [81]. Серед іншого, креатинін і альбумін із сироватки та сечі кількісно визначали за допомогою відстежуваної методології IDMS (Creatinine plus, Roche, Німеччина) та турбідиметричного методу (Tina-quant, Roche, Німеччина) Roche/Hitachi MODULAR P відповідно. Швидкість клубочкової фільтрації (ШКФ) оцінювали за допомогою формули CKD-EPI на основі креатиніну (одиниця: мл/хв/1,73 м2, [82]). UACR розраховували як виміряний рівень альбуміну/креатиніну в сечі (мг/г, [83]). Вік і стать були зареєстровані під час початкового візиту. У 2015 році OPN вимірювали у базових зразках сироватки повної когорти дослідження GCKD за допомогою кількісної техніки сендвіч-ферментного імуноаналізу (твердофазний ELISA; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 від R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, UK) )). Кількісне визначення було проведено в Інституті клінічної хімії та лабораторної медицини, Грайфсвальд, Німеччина. Коефіцієнти варіації (всередині аналізу) становили 4,5%, 5,3% і 3,5% для низького, середнього та високого рівнів відповідно. Коефіцієнт варіації між аналізами становив 6,4%. Реагенти та вторинні стандарти використовували згідно з рекомендаціями виробника.

ОРГАНІЧНІ ТРАДИЦІЙНІ ТРАВИ ДЛЯ ЗДОРОВ'Я НИРОК

Генотипування, контроль якості та імпутація

Детальна інформація про генотипування та очищення даних у дослідженні GCKD була описана раніше [18]. Коротко, ДНК була виділена з цільної крові та генотипована за 2 612 357 варіантами для 5 123 учасників GCKD за допомогою масиву Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip (Illumina, GenomeStudio, Genotyping Module Version 1.9.4) у Центрі Гельмгольца в Мюнхені. Очищення даних проводилося окремо для вмісту Omni2.5 і вмісту мікросхеми exome масиву. На основі стандартизованих протоколів [84], написаних на замовлення сценаріїв (R, Perl) і програмного забезпечення Plink1.9 [85] було використано для контролю якості (QC) вмісту Omni2.5. Етапи контролю якості на основі зразків включали перевірку частоти викликів, статі, гетерозиготності, генетичного походження та спорідненості, що призвело до виключення 89 зразків. На рівні варіантів однонуклеотидні поліморфізми (SNP) були виключені, якщо частота викликів була<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Дослідження загальногеномних асоціацій загальних варіантів

Як повідомлялося раніше [17,18], GWAS проводили для учасників GCKD з повним генотипуванням (Omni2.5), даними eGFR, UACR та log2(OPN) (N=4,897) з використанням лінійної регресії log2 (OPN) на SNP (додаткова генетична модель) з MAF �1%, скоригованим на вік, стать, log (eGFR) і log (UACR) (S1, рис.). Аналіз асоціацій проводили за допомогою SNPTEST v2.5 [89]. Зведену статистику перевіряли на якість за допомогою GWAtoolbox [90] та на інфляцію за допомогою геномного контролю [91]. Проте корекція геномного контролю не була запропонована (λ=1.01). Асоціації з p-значенням<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Функціональна анотація варіантів проводилася за допомогою ANNOVAR[92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] і RegulomeDB [96]. Ділянки регіональних асоціацій були побудовані за допомогою LocusZoom v1.3 [97].

Точне відображення

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Аналізи колокалізації

Для подальшого розуміння молекулярних механізмів і пов’язаних фенотипів, що лежать в основі асоціацій, ми провели аналіз спільної локалізації підсумкових статистичних даних OPN GWAS, пов’язаних з двома реплікованими локусами OPN із підсумковими статистичними даними GWAS із трьох інших джерел, як зазначено нижче. Для всіх аналізів спільної локалізації ми використовували функцію «coloc.fast» із пакета R gtx із параметрами за замовчуванням і попередніми визначеннями (https://github.com/tobyjohnson/gtx), реалізацію адаптованої версії методу спільної локалізації, представленого Giambartolomei та ін. [98]. Ми вважаємо позитивну спільну локалізацію, коли постеріорна ймовірність спільного причинного варіанту в локусі асоціації для обох ознак (H4, p12) була > 0.8.

Експресія генів.

По-перше, ми використали підсумкову статистику GWAS даних експресії генів із проекту GTEx [99] і дослідження NEPTUNE [100]. Дані eQTL з GTEx V8 (49 тканин) і дослідження NEPTUNE (NephQTL з клубочків і тубулоінтерстиціальних частин нирки) були завантажені з порталу GTEx (https://www.gtexportal.org/home/) і веб-сайту NephQTL (http ://nephqtl.org/), відповідно. Етапи аналізу колокалізації були детально описані в іншому місці [17]. По-перше, було вилучено підсумки GWAS GTEx і NephQTL у геномних регіонах ±100 кб двох SNP OPN. Ідентифікують гени в екстрагованих GWAS, і для кожного гена визначають цис-вікно розміром 500 кб, що оточує початок і кінець гена. Потім для кожного такого вікна гена cis, з принаймні одним SNP, що має p-значення асоціації < 0,001, підсумки GWAS тканин GTEx і NephQTL, а також OPN GWAS були вилучені та використані як вхідні дані для аналізу колокалізації.