Gao-Zi-Yao покращує функцію навчання та пам'яті у старих щурів зі спонтанною гіпертензією. Частина 2

Піддослідні тварини

Дванадцятимісячні та восьмитижневі самці щурів зі спонтанною гіпертензією (SHR) були придбані в Nanjing Animal Model Center.

Існує тісний зв’язок між 8-тижневими самцями та пам’яттю. У цей період мозок істоти чоловічої статі стрімко розвивається, зв’язки між його нейронами поступово посилюються, що, в свою чергу, впливає на розвиток пам’яті.

Дослідження показують, що пам'ять у істот чоловічої статі продовжує покращуватися з віком. Це не тільки значно впливає на їхнє виживання та розмноження, але й допомагає їм краще адаптуватися до навколишнього середовища та справлятися з новими викликами.

Тому ми повинні активно заохочувати молодих чоловіків брати участь у різноманітних корисних заходах, таких як розгадування головоломок, навчання новим навичкам і дослідження нових областей. Ці дії стимулюють їхній мозок, дозволяючи їм швидше розвиватися та покращувати пам’ять.

У той же час ми також повинні забезпечити відповідне середовище та атмосферу для молодих створінь чоловічої статі. Змушення їх відчувати себе в безпеці та близькості може сприяти розвитку їх мозку та покращити пам’ять.

Коротше кажучи, ми повинні зробити все можливе, щоб допомогти молодим чоловікам покращити свою пам’ять, щоб вони стали розумнішими, впевненішими та здібними істотами. Це сприяє не лише їхньому особистому розвитку, але й процвітанню та виживанню всього виду. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola має антиоксидантну, протизапальну та антистарільну дію, що може допомогти зменшити окисні та запальні реакції в мозку, тим самим захищаючи здоров'я нервової системи. Крім того, Cistanche deserticola також може сприяти росту та відновленню нервових клітин, таким чином покращуючи зв’язок і роботу нейронних мереж. Ці ефекти можуть допомогти покращити пам’ять, навчання та швидкість мислення, а також можуть запобігти розвитку когнітивної дисфункції та нейродегенеративних захворювань.

Клацніть знати добавки для покращення пам’яті

У цій моделі гіпертензія починає розвиватися у віці 4 місяців із появою пов’язаних з гіпертензією змін у мікроциркуляторному руслі головного мозку до 6 місяців [37].

Щурів утримували в оптимальних умовах зі стандартною гігієною, при температурі 25 градусів із циклом світла/темряви 12/12 і годували стандартною щурячою їжею та водою ad libitum.

Усі процедури були схвалені та виконані відповідно до інструкцій щодо догляду та використання тварин, встановлених Університетом Сучжоу, що узгоджується з нашим попереднім звітом[35].

Експерименти проводилися відповідно до Рекомендацій Національного інституту охорони здоров’я щодо використання лабораторних тварин (NIH, номер публікації 85–23, переглянуто 1996 р.). Про це дослідження повідомляється в рекомендаціях ARRIVE.

Для контролю старіння застосовували SHR восьми тижнів (SHR-Young, n=10). Дванадцятимісячних щурів отримували дистильованою водою або без Gao-Zi-Yao (старий SHR-C, n=10), низька доза (старий SHR-L, n=10), середня доза (Старий SHR-M, n=10), висока доза (Старий SHR-H, n=10) через шлунок.

Дозування низького, середнього та високого рівня Gao-Zi-Yao дорівнює 1/2-, 1-, потрійне дозування для клінічного застосування пацієнтом, розраховане відповідно до площі поверхні тіла. Gao-Zi-Yao розчиняли в 5 мл дистильованої води перед застосуванням і одноразово вводили молочний продукт протягом 4 тижнів.

Артеріальний тиск і частоту серцевих скорочень контролювали щотижня за методом хвостової манжети, а вагу тіла також контролювали щотижня згідно з попередніми нашими спостереженнями [35].

Через 4 тижні було проведено експеримент із водним лабіринтом Морріса, і щурів умертвили під анестезією пентобарбіталом натрію (50 мг/кг внутрішньовенно), тканину гіпокампу відібрали для подальшого аналізу. Усі експериментальні протоколи були схвалені комітетом з ліцензування етики Університету Сучжоу.

Експеримент з водним лабіринтом Морріса

Експеримент з водним лабіринтом Морріса (BW-MWM101, Shanghai Bio-will Co., Ltd., Шанхай, Китай) був виконаний, як описано раніше з деякими модифікаціями [38]. Тест було заплановано на 6 днів, дні з 1 по 5 були для періоду навчання, а день 6 був для результатів тестування.

Щурів тренували протягом 2 хвилин молочного продукту, записуючи час для посадки на платформу як час затримки. На 6 день платформу видалили. Щурів поміщали в найдальший квадрант і записували траєкторію плавання протягом 2 хв.

Параметри функції навчання та пам'яті були розраховані програмним забезпеченням.

Вимірювання сироваткових рівнів NO та факторів запалення методом ELISA

Рівні NO (номер за каталогом: S0023), IL-1 (номер за каталогом: A301BH80153), IL-2 (номер за каталогом: A31038348), IL-6 (номер за каталогом: A30681042), і TNF- (номер за каталогом: A38280855) вимірювали за допомогою комерційно доступних наборів ELISA (BiotechnologyCo., Ltd. Shanghai enzyme research. Shanghai, China). Усі етапи виконували згідно з інструкціями виробника.

Фарбування по Нісслю

Тканини гіпокампу щурів виділяли, фіксували, заливали парафіном, потім інкубували в 1% розчині для фарбування толуїдиновим синім протягом 5–10 хвилин при кімнатній температурі. Десять зрізів промивали в дистильованій воді, замочували в 95% етанолі на 5–30 хв і зневоднювали в 100% етанолі.

Після зневоднення зріз поміщали в ксилол і накривали його смоляним середовищем. Кількість нейронів у областях CA1, CA2 і зубчастої звивини (DG) гіпокампу спостерігали та аналізували за допомогою програми аналізу ImageJ.

Вестерн-блот для білків, пов'язаних з навчанням і пам'яттю

Вестерн-блот для білків, пов'язаних з навчанням і пам'яттю, проводився, як описано в нашому попередньому звіті з деякими модифікаціями [39].

Тканини гіпокампусу гомогенізували буфером RIPA (50 mmTris, 150 мМ NaCl, 1% Triton-X-100, pH 7,0), що містить фенілментансульфонілфторид (R&D Systems Inc., Міннеаполіс, США). Гомогенати центрифугували при 12,000 × g протягом 10 хвилин при 4 градусах.

Клітинні білки розділяли SDS-PAGE і переносили на мембрани PVDF (Hybond TM-ECL; AmershamPharmacia Biotech, Inc.). Мембрани були заблоковані в 5% знежиреному молоці в PBS і 0.1% Tween-20при кімнатній температурі.

Потім блоти інкубували з первинним антитілом: анти-глутаматний рецептор 1 (1:1000, Abcam, Inc., № за каталогом: ab183797), антитіло проти NMDAR2B (1:1000, Abcam, Inc., № за каталогом: ab28373), анти-фосфо -CaMKII антитіло (1:1000, Abcam, Inc., каталожний номер: ab171095), антифосфо-CREB антитіло (1:1000, Abcam, Inc., каталожний номер: 32096) або анти-GAPDH (Santa Cruz Biotech, Inc., Номер каталогу: sc-47724).

Далі мембрани інкубували протягом 1 години з вторинним антитілом (HRP-кон’югований анти-кролячий Ig-G, 1:2000, Abcam, Inc. Каталожний номер: ab205718). Потім мембрани тричі промивали протягом 15 хвилин за допомогою TBS-T для видалення надлишку антитіл перед інкубацією протягом 1 хвилини з хемілюмінесцентними реагентами (ECL, R&D Systems Inc., Міннеаполіс, Міннесота, США).

Крім того, імунореактивні смуги були виявлені за допомогою системи електрофорезу в гелі (GL2200 Pro, Crestream Inc. США). Інтенсивність смуг аналізували за допомогою програмного забезпечення Image J. Кількість цільових білків нормалізували за експресією GAPDH [39].

Статистичний аналіз

Для статистичного аналізу використовувалося програмне забезпечення SPSS 18.0. Дані представлені як середнє ± SEM. Згруповані дані аналізувалися за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з наступним тестом Стьюдента–Ньюмена–Кейлза. Значення P < 0.05 вважалося статистично значущим, як у нашому попередньому звіті [35].

Результати

Систолічний артеріальний тиск (САТ), частота серцевих скорочень і маса тіла між SHR молодого та старого SHR

Yong SHR продемонстрував нижчий рівень САТ у перші два тижні порівняно зі старим SHR, а потім збільшився до відсутності різниці між двома групами протягом останніх трьох тижнів (рис. 2A).

Навпаки, частота серцевих скорочень не відрізнялася між двома групами протягом перших двох тижнів, потім SHR у молодих пацієнтів помітно зросла порівняно з SHR у старих протягом наступних трьох тижнів (рис. 2B). Молодий SHR продемонстрував нижчу масу тіла порівняно зі старим SHR протягом усього періоду спостереження (рис. 2C).

Параметри водного лабіринту Морріса між молодим SHR і старим SHR

Щоб визначити залежне від гіпокампу навчання та пам’ять, було проведено експеримент із водним лабіринтом Морріса. Старий SHR продемонстрував більшу затримку втечі в перші чотири дні порівняно з молодим SHR (рис. 3A).

Часи перетину цільового квадранта були меншими у старих SHR, ніж у молодих SHR (рис. 3B).

Відсоток часу в квадранті цільової платформи був меншим у старому SHR порівняно з молодим SHR (рис. 3C). Відсоток довжини шляху в квадранті також був коротшим у старому SHR порівняно зі старим SHR (рис. 3D). Ці результати свідчать про те, що старий SHR має порушення когнітивних функцій.

Кількість нейронів у гіпокампі між молодим SHR і старим SHR

Кількість нейронів у різних ділянках гіпокампу підраховували за допомогою фарбування за Нісслем. Результати показали, що існує менша кількість нейронів у регіонах CA1, CA2 і DG старого SHR порівняно з молодим SHR (рис. 4).

Експресія білка, пов’язаного з навчанням і пам’яттю, в гіпокампі між молодим SHR і старим SHR

Результати вестерн-блоттингу показали, що експресія білків, пов’язаних із навчанням і пам’яттю (GluR1, NMDAR 2B, фосфорильованого CaMK II і фосфорильованого CREB), у старому гіпокампі SHR була нижчою, ніж у молодому гіпокампі SHR (рис. 5).

Вплив Gao-Zi-Yao на SBP, частоту серцевих скорочень і масу тіла в старому SHR

Було проаналізовано вплив Gao-Zi-Yao на SBP. Лікування низькою дозою Gao-Zi-Yao помітно знизило САТ у старих SHR з другого по четвертий тиждень порівняно з контрольною групою старих SHR, середні та високі дози Gao-Zi-Yao помітно знизили SBP у старих SHR з першого тижня до четвертий тиждень порівняно з контрольним старим SHR (рис. 6A). Ці результати свідчать про антигіпертензивну дію Gao-Zi-Yao на стару SHR.

Ми також порівняли дані про вплив частоти серцевих скорочень Gao-Zi-Yaoon і маси тіла. Наші дані показали, що не було істотної різниці в частоті серцевих скорочень і масі тіла між усіма групами протягом усього періоду спостереження (рис. 6B, C).

Вплив Gao-Zi-Yao на сироваткові рівні NO, IL-1, IL-2 і TNF- у старих SHR

Лікування середніми та високими дозами GAO-ZIYAO підвищувало рівні NO у сироватці порівняно з рівнями в контрольній групі SHR (рис. 7A). Лікування всіма перевіреними дозами GAO-ZI-YAO знизило сироваткові рівні IL-1, IL-2 порівняно з рівнями в контрольній групі SHR (рис. 7B, C); однак лише високі дози GAO-ZI-YAO пригнічували рівні TNF- у сироватці (рис. 7D).

Ці результати демонструють, що GAO-ZI-YAO може регулювати окислювальний стрес і запалення.

For more information:1950477648nn@gmail.com