Інгібітор фарнезилтрансферази LNK-754 послаблює аксональну дистрофію та зменшує амілоїдну патологію у мишей. Частина 1

Анотація

фон:

Відкладення амілоїдних бляшок і дегенерація аксонів є ранніми явищами патогенезу AD. A порушує мікротрубочки в пресинаптичних дистрофічних нейритах, що призводить до накопичення порушених ендолізосомальних і аутофагічних органел, що транспортують фермент, що розщеплює білок-попередник амілоїду (BACE1). Отже, дистрофічні нейрити генерують A 42 і значно сприяють відкладенню бляшок.

Дегенерація аксонів - це неврологічний розлад, який спричиняє пошкодження аксонів нейронів, тим самим впливаючи на нервову провідність. Імунітет є важливою лінією захисту організму людини від вторгнення чужорідних мікробів і вірусів. Отже, чи існує зв’язок між дегенерацією аксонів та імунітетом?

По-перше, аксональна дегенерація не є захворюванням, спричиненим імунною системою, тому немає необхідності турбуватися про негативний вплив імунітету на нього. Хоча конкретна причина аксональної дегенерації невідома, деякі дослідження показують, що аксональна дегенерація може бути пов’язана із запальними реакціями в імунній системі. Запальна реакція є захисним механізмом імунної системи проти вторгнення чужорідних патогенів. Однак, якщо він надмірно активований, це спричинить запальне пошкодження нейронів і сприятиме дегенерації аксонів.

По-друге, сильна імунна система може підвищити опірність організму і знизити ризик інфекцій і захворювань, що особливо важливо для пацієнтів з дегенерацією аксонів. Оскільки нервова система пацієнтів з дегенерацією аксонів була пошкоджена, здатність організму до самовідновлення відносно слабка. Якщо вони страждають іншими захворюваннями, стан погіршиться, що ще більше вплине на якість їхнього життя. Таким чином, дотримання здорового харчування та життєвих звичок, а також зміцнення імунітету можуть допомогти зменшити ризик інших захворювань. У той же час він може покращити імунну відповідь організму та сприяти відновленню аксонів та відновленню нервової провідності.

Таким чином, хоча немає необхідного зв’язку між аксональною дегенерацією та імунітетом, здорова імунна система може забезпечити необхідний захист і підтримку для пацієнтів з аксональною дегенерацією. Тому ми повинні звернути увагу на важливість підтримки імунної системи, починаючи з таких аспектів, як дієта та життєві звички, і активно покращуючи рівень імунітету організму, щоб закласти міцну основу для здоров’я та довголіття. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola є традиційним китайським лікарським матеріалом, який має багато унікальних ефектів, одним із яких є покращення пам’яті. Ефективність м’ясного фаршу пов’язана з різними активними інгредієнтами, які він містить, включаючи кислоти, полісахариди, флавоноїди тощо. Ці інгредієнти можуть сприяти здоров’ю мозку різними способами.

Клацніть дізнатися про 10 способів покращити пам’ять

Інгібітори фарнезилтрансферази (FTI) нещодавно були досліджені для зміни позиції в бік лікування нейродегенеративних розладів і блокування дії фарнезилтрансферази (FTase) для каталізації фарнезилювання, посттрансляційної модифікації, яка регулює білки, залучені до функції лізосом і стабільності мікротрубочок. У головному мозку після смерті AD FTase та його передача сигналів посилюється. Проте вплив FTI на амілоїдну патологію та дистрофічні неврити невідомий.

Методи:

Ми протестували вплив FTIR LNK-754 і лонафарнібу на мишачій моделі амілоїдної патології 5XFAD.

Результати:

У 2-місячних мишей 5XFAD, які отримували хронічне лікування протягом 3 місяців, LNK-754 зменшило навантаження амілоїдних бляшок і гіперфосфорилювання тау та послабило накопичення BACE1 і LAMP1 у дистрофічних нейритах. У 5-місячних мишей 5XFAD, які отримували гостре лікування протягом 3 тижнів, LNK-754 зменшив розмір дистрофічних нейритів і накопичення LysoTracker-Green за відсутності впливу на відкладення A. Гостра терапія LNK-754 покращила пам’ять і дефіцит навчання у амілоїдних мишей hAPP/PS1.

На відміну від LNK-754, лікування лонафарнібом було менш ефективним у зменшенні бляшок, гіперфосфорилювання тау та дистрофічних нейритів, що могло бути результатом зниження активності проти FTase порівняно з LNK-754. Ми досліджували вплив FTI на переміщення аксонів ендолізосомальних органел і виявили, що лонафарніб і LNK-754 посилюють ретроградний аксональний транспорт у первинних нейронах, що вказує на те, що FTI можуть сприяти дозріванню пізніх ендосом аксонів у лізосоми. Крім того, лікування FTI підвищило рівень LAMP1 у первинних нейронах мишей і мозку мишей 5XFAD, демонструючи, що FTI стимулюють біогенез ендолізосомальних органел.

Висновки:

Ми надаємо нові дані, які свідчать про те, що LNK-754 сприяє переміщенню аксонів і функціонуванню ендолізосомальних компартментів, що, як ми припускаємо, зменшує дистрофію аксонів, зменшує накопичення BACE1 і пригнічує відкладення амілоїду у мишей 5XFAD. Наші результати узгоджуються з попередньою роботою, що визначає FTase як терапевтичну мішень для лікування протеїнопатій і може мати важливі терапевтичні наслідки для лікування AD.

Ключові слова:

Хвороба Альцгеймера, дистрофічні неврити, інгібітори фарнезилтрансферази.

Фон

Хвороба Альцгеймера (ХА) — це прогресуюче нейродегенеративне захворювання, яке є найпоширенішою причиною деменції серед старіючого населення та характеризується значним погіршенням навчання та пам’яті. На молекулярному рівні відмітними ознаками мозку AD є накопичення амілоїдних (A) бляшок і наявність гіперфосфорильованих включень тау.

На ранніх безсимптомних стадіях AD A накопичується в мозку протягом двох десятиліть або довше до початку порушення пам’яті [1–3]. Отже, зниження рівня А у мозку було центральним напрямком стратегій лікування AD [4]. Наразі єдиною терапією, яка модифікує захворювання, умовно схваленою FDA, є антитіло проти А, яке очищає агреговані форми А з мозку [5], підтверджуючи, що націлювання на А в мозку є багатообіцяючим підходом до лікування AD.

Однак більшість клінічних випробувань, зосереджених на А, зазнали невдачі через проблеми з безпекою чи ефективністю, і тепер акцент робиться на цілях, заснованих на різних гіпотезах AD, включаючи поширення тау, запалення, кальцієвий дисгомеостаз і нервово-судинні фактори [4, 6, 7]. ]. Крім того, зростає інтерес до терапевтичного потенціалу активації лізосомальних деградаційних шляхів як методу зменшення патогенних білків, характерного для нейродегенеративних захворювань [8–12].

Виражена дисфункція ендолізосомальних і аутофагічних шляхів добре задокументована як рання подія патогенезу AD. Багато генетичних локусів сприйнятливості до AD пов’язані з субклітинним ендолізосомальним транспортом і функцією лізосом [13], а збільшені дисфункціональні ендолізосомальні та аутофагічні органели накопичуються в мозку AD у дистрофічних нейритах [14, 15].

Дистрофічні нейрити, мабуть, ініціюються після пошкодження нейронів, і при AD це, як припускають, дестабілізація мікротрубочок A [16]. Це призводить до вогнищевих набряків аксонів, які порушують нормальний обмін і шляхи деградації ключових білків, які беруть участь у виробництві A, включаючи BACE1 [16, 17]. Як результат, дистрофії генерують A 42 і значно сприяють відкладенню позаклітинних бляшок і дистрофії аксонів [18], ініціюючи шлях прямого живлення, що призводить до втрати синапсів, нейродегенерації та когнітивного дефіциту [16].

Терапевтичні стратегії, які покращують транспорт і активність ендолізосомальних і аутофагічних органоїдів, можуть запобігти невротичній дистрофії, підтримувати деградацію патогенних білків і бути критичним механізмом для зниження рівнів BACE1 і A при AD.

У міру того як тривають пошуки ефективного лікування AD, кількість повторно призначених препаратів у клінічних випробуваннях AD значно зросла, оскільки клінічно оцінені препарати мають відомі проблеми з безпекою та ефективністю, що прискорює процес розробки ліків [7, 19]. В останні роки дослідження визначили FTI як клас ліків, які потенційно можуть бути використані для лікування нейродегенеративних захворювань.

FTI пригнічують фарнезилювання, посттрансляційну модифікацію, яка регулює білки, в яких фарнезилпірофосфат ковалентно модифікований до залишків цистеїну в білках, які містять мотив CAAX [20]. FTI спочатку були розроблені для блокування онкогенної активності Ras шляхом пригнічення його пренілювання, але їх було припинено в клінічних випробуваннях для лікування раку після відкриття альтернативних шляхів пренілювання Ras [21, 22].

Однак існує багато субстратів FTase [23–25], що веде до оцінки FTI для широкого спектру захворювань, включаючи серцево-судинні захворювання, гепатит D і прогерію [20, 26]. Крім того, FTI показали перспективу щодо нейродегенеративних захворювань, що характеризуються накопиченням білкових агрегатів. У моделях протеїнопатій на гризунах і клітинних культурах FTI індукують лізосомну активність і протеоліз специфічних для захворювання токсичних білків [8, 9, 27, 28].\

Раніше ми показали, що LNK-754, FTI, протестований у дослідженнях раку, посилює передачу лізосомальної гідролази та знижує альфа-синуклеїнові (-синуклеїнові) агрегати в нейронах пацієнтів із хворобою Паркінсона (ХП) і мишачих моделях ХП [8 ].

Інші дослідження повідомляли про подібні результати FTI щодо зменшення білкових агрегатів; лікування моделей клітинної культури ХП за допомогою FTI-277 відновленого -синуклеїну [28] та лонафарнібу, FDA-схваленого FTI для лікування прогерії [29], посилення лізосомальної активності та зменшення тау-включень у мишачій моделі тауопатії [ 9]. Крім того, нещодавнє дослідження показало, що генетичний нокаут нейрональної FTase у мишачій моделі AD APP/PS1 запобігає поколінню A [30]. У центрі уваги попередніх досліджень, що оцінювали FTI для протеїнопатій, була роль субстратів FTase в активності лізосом і аутофагії.

Однак також відомо, що FTI сприяють стабільності мікротрубочок (МТ) і синергізують з препаратами, що стабілізують МТ, для посилення ацетилювання тубуліну через Ras-незалежний шлях [31–33]. Стабілізація МТ пригнічує патологію AD у мишей APP/PS1 [34], і в даний час декілька агентів, що стабілізують МТ, клінічно досліджуються для лікування AD [35]. Таким чином, є суттєві дані, які свідчать про те, що FTI можуть бути корисними для захворювань, що характеризуються дисфункціональними механізмами білкового гомеостазу, таких як AD. Тим не менш, мішені та шляхи, які з’єднують фарнезилювання білка зі зниженням білкових агрегатів при нейродегенеративних захворюваннях, не повністю зрозумілі.

У цьому дослідженні ми оцінювали, чи може фармакологічне лікування FTI покращити A-асоційовану патологію AD. Ми оцінили вплив LNK-754 і лонафарнібу, двох FTI, які, як відомо, зменшують білкові агрегати при нейродегенеративних розладах, на навантаження бляшок і дистрофічні нейрити в мишачій моделі амілоїдної патології 5XFAD. Наші результати дають уявлення про шляхи, на які впливає інгібування FTase, і рішуче підтримують подальші дослідження перепрофілювання FTI як терапевтичних засобів для AD та інших нейродегенеративних захворювань, що характеризуються накопиченням білкової агрегації.

Матеріали та методи

Тварини та медикаментозне лікування

Усю роботу з тваринами проводив схвалення Комітету з догляду та використання тварин Північно-Західного університету (IACUC). Мишей годували стандартною їжею для гризунів і водою ad libitum і містили зі стандартним 12--годинним циклом світла/темряви. Мишей 5XFAD на фоні C57BL6 (Jackson Laboratories) підтримували шляхом схрещування трансгенпозитивних гемізиготних самців мишей C57BL6 з трансгеннегативними самками мишей C57BL6 (Jackson Laboratories).

У нашому протоколі хронічного лікування медикаментозне лікування було розпочато у віці 2 місяців, у віці, коли починається відкладення зубного нальоту [36, 37]. У протоколі невідкладної терапії медикаментозне лікування було розпочато у віці 5 місяців, після чого широко поширені відкладення бляшок і дегенерація аксонів [38, 39].

LNK{{0}} був синтезований Link Medicine (Массачусетс, США), а лонафарніб був отриманий від Cayman Chemical Company (Енн-Харбор, Мічиган). Для лікування тварин LNK-745 і лонафарніб готували в нагрітому розчині 0.5% карбоксиметилцелюлози (Sigma-Aldrich) як носія в концентрації 0,10 мг/мл до розчинення, після чого розчин був розведений. ясно.

Аліквоти для ін'єкцій заморожували при -20 градусах, а потім розморожували і зберігали при 4 градусах протягом кожного тижня лікування. Мишей лікували за встановленим протоколом, який, як відомо, посилює активність лізосом [8]. У протоколі тривалого лікування 2-місячним мишам 5XFAD вводили внутрішньоочеревинну (ip) ін’єкцію будь-якої носіїв, LNK754 або лонафарнібу щодня за допомогою 29-інсулінового шприца протягом 12 тижнів, поки мишам не виповнилося 5 років. місяців. У режимі невідкладного лікування 5-місячним мишам 5XFAD вводили щодня протягом 3 тижнів.

Після завершення лікування мишей анестезували та перфузували, а мозок збирали для подальшого аналізу (див. розділи нижче). Для експериментів з культурою клітин LNK-754 і лонафарніб розчиняли в ДМСО та додавали до культур первинних нейронів миші в концентрації 10 нМ на 48 годин. Обробка носія була еквівалентною кількістю ДМСО. Клітини збирали та аналізували, як описано нижче.

Антитіла

Антитілами, використаними для експериментів з імунофлуоресценцією, були щурячі анти-LAMP1 (#1D4B, DSHB), кролячі анти-A 42 (#700254, Invitrogen), кролячі анти-BACE1 (#ab108394, Abcam), кролячі анти-III тубулін (#ab18207, Abcam). Для імуноблоттингу використовувалися кролячі антитіла до актину (#926–42210, LI-COR), кролячі антитіла до p44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), кролячі антитіла до -44/42 (Erk1/2) (#CS137F5, Cell Signaling Technology), кролячий анти-LAMP1 (#CS3234, Cell Signaling Technology), мишачий анти-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), мишачий анти-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), кролячий анти-p-tau (ser404) (#CS20194, Cell Signaling Technology), мишачий анти-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), преламін-A (#MABPT858, Millipore Sigma) і мишачий анти- -HDJ-2 (#sc-59,554, Санта-Крус). Для імуноблотів використовували вторинні антитіла проти кроликів або мишей від Vector Laboratories.

Поведінкове тестування

Лікування тварин і медикаментів

Поведінковий аналіз проводився компанією reMYND, Inc. з використанням мишачої моделі hAPP/PS1 із специфічною для нейронів експресією клінічного мутанта людського білка-попередника амілоїду разом із клінічним мутантом людського пресеніліну 1 [40]. Ця подвійна трансгенна миша демонструє спонтанне, прогресуюче накопичення А в мозку, що зрештою призводить до амілоїдних бляшок у субікулумі, гіпокампі та корі головного мозку у віці 6 місяців. Для цього дослідження використовували 48 самок мишей hAPP/PS1 на фоні FVB x C57Bl/6J у віці 6 місяців у поєднанні з 12 контрольними самками дикого типу відповідного віку на фоні FVB x C57Bl/6J. Введення 0,9 мг/кг/день LNK-754 проводили перорально через зонд один раз на день протягом 12 днів поспіль. Умертвлення тварин проводили через 2 години після останнього введення дози.

Усі миші були генотиповані за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у віці 3 тижнів і отримали унікальний ідентифікаційний номер, як тільки результати ПЛР були відомі. Перед початком дослідження всіх мишей двічі перевіряли за допомогою другої ПЛР. Усі миші були рандомізовані наосліп і зіставлені за віком. Мишам було дано випадкове число за допомогою комп’ютера та випадковим чином розподілено на лікування. За 15 днів до початку дослідження тварини були переведені в клітку групи лікування, щоб дати їм змогу ознайомитися з новим контекстом клітки. Миші мали вільний доступ до попередньо відфільтрованої та стерильної води та стандартної їжі для мишей (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Зост, Німеччина). Їжу зберігали в сухих і прохолодних умовах у добре вентильованому складському приміщенні. Кількість води та їжі перевіряли щодня, постачали за потреби та стандартно поповнювали один раз на тиждень. Мишей спочатку утримували у зворотному ритмі день-ніч (14 годин світла/10 годин темряви), починаючи з 7 години вечора, у стандартних металевих клітках типу RVS T2 (площею 540 см2).

Клітки обладнані твердою підлогою та шарами підстилки. Кількість мишей у клітці була обмежена місцевим законодавством про добробут тварин. За 15 днів до початку лікування мишей повторно помістили в індивідуальні вентильовані клітини макролону Т2 і транспортували до лабораторії для адаптації до лабораторного середовища для підготовки до лікування. У лабораторії ритм день-ніч змінили на 12 годин світла/12 годин темряви, починаючи з 19:00.

Водний лабіринт Морріса

Водний лабіринт Морріса проводили на 8-12 дні лікування, і тварин умертвляли безпосередньо після тесту зондом. Басейн (біла кругла посудина діаметром 1 м) містив воду при 20 градусах з діоксидом титану як нетоксичну добавку без запаху, щоб приховати евакуаційну платформу (1 см нижче рівня води). Плавання кожної миші записували на відео та аналізували (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Нідерланди). Перед навчанням кожну мишу поміщали на платформу на 15 секунд. Для тестів навігації за місцем мишей навчали знаходити приховану платформу в семи блоках із трьох випробувань протягом чотирьох днів поспіль.

Кожне випробування складається з тесту на примусове плавання тривалістю максимум 120 секунд, після чого йде 10 хвилин відпочинку. Було виміряно час, необхідний кожній миші, щоб знайти платформу. Сім послідовних блоків призводять до кривої навчання. Через 24 години після останнього тренування кожна тварина була досліджена зондом із видаленою платформою. Мишам дозволили шукати протягом 60 секунд, і виміряли час пошуку квадранта та перетин вихідної позиції платформи. Під час останнього випробування зондом мишам дозволили шукати попереднє місце розташування платформи протягом 60 секунд після того, як платформу було видалено.

Первинна культура нейронів

Передній мозок розрізали у збалансованому сольовому розчині Хенкса (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) вагітних мишей дикого типу C57BL6 (Jackson) на E15.5 для отримання первинних нейронів. Розрізаний передній мозок розщеплювали в 2,5% трипсину при 37 градусах протягом 20 хвилин. Відшліфовану піпетку Пастера використовували для дисоціації нейронів у HBSS. Потім нейрони висівали на шестилунковий планшет, покритий полі-L-лізином, 2 × 106 нейронів на лунку в нейробазальному середовищі, доповненому 2% B-27, 500 мкМ глутаміну, 10% кінської сироватки та 2,5 мкМ глутамат (все від Thermo Fisher).

Через 2 години середовище було замінено на Neurobasal з 2% B-27, 500 мкМ глутаміну та 2,5 мкМ глутамату. Через 24 години середовище було замінено на Neurobasal плюс 2% B-27 і 500 мкМ глутаміну. Кожні 2–3 дні робили половину змін медіа. Первинні нейрони культивували протягом 7 днів і обробляли носієм (ДМСО) або LNK-754 у концентрації 10 нМ або лонафарнібом протягом 48 годин. Потім нейрони фіксували або знімали живі зображення, як описано нижче.

Для фіксації нейрони інкубували протягом 20 хвилин у 4% параформальдегіді, 0.12M сахарозі в 1XPBS, пермеабілізували в 0,5% Triton X-100, і інкубували з первинними антитілами протягом ночі, а потім ослині антимишачі Alexafuor-кон'юговані вторинні антитіла (Molecular Probes, 1:1000) і спільно забарвлені 300 нМ DAPI. Покривні скла монтували за допомогою Prolong Gold (Molecular Probes), а зображення отримували на конфокальному мікроскопі Nikon A1 з об’єктивом 60X (NA 1.4) і програмним забезпеченням NIS Elements.

Живе зображення нейронів

Для експериментів із зображенням у реальному часі нейрони готували, як зазначено вище, і поміщали в чашки зі скляним дном 35 мм (MatTek # P35G-1.5-14C) на 7 днів у культурі. Потім до кондиціонованого середовища додавали 10 нМ LNK-754 або лонафарніб, контрольні культури обробляли ДМСО як носієм. Через 48 годин обробки середовище було замінено кондиціонованим середовищем з необроблених паралельних пластинок нейронів. 25 нМ LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) додавали до кондиціонованого середовища та нейрони інкубували протягом 30 хвилин при 37 градусах.

Покадрове зображення нейронів проводили за допомогою широкопольного мікроскопа Ti2. Зображення починалося відразу через 30 хвилин і тривало не більше 30 хвилин. 1- експозицій робили щохвилини, і протягом 30 хвилин знімали 20–30 окремих ділянок на блюдо. Кількісне визначення відстані та швидкості частинок LysoTracker та аналізи кімографа були виконані за допомогою програмного забезпечення NIS Elements і детально описані нижче. В окремих експериментах до кондиціонованого середовища додавали 1 мкМ Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen), а отримані зображення живих нейронів робили не довше ніж 15 хвилин за допомогою конфокального мікроскопа Nikon A1 з об’єктивом 60X. (NA 1.4) та програмне забезпечення NIS Elements.

For more information:1950477648nn@gmail.com