Екстравірусна ДНК у препаратах аденоасоційованого вірусного вектора індукує TLR9-залежну вроджену імунну відповідь у плазмоцитоїдних дендритних клітинах людини

Аденоасоційовані вірусні (AAV) векторні суспензії, вироблені або в людських клітинах HEK, або в клітинах комах Spodoptera frugiperda (Sf9), відрізняються з точки зору залишкових компонентів клітин-господарів, а також видоспецифічних посттрансляційних модифікацій, що відображаються на капсидних білках AAV. . Тут ми проаналізували вплив цих відмінностей на імуногенні властивості вектора. Ми стимулювали плазмоцитоїдні дендритні клітини людини різними партіями векторів AAVCMV-eGFP, вироблених клітинами HEK і Sf9, отриманих від різних виробників. Ми виявили, що вектори AAV8-CMV-eGFP, а також AAV2-CMV-eGFP індукують запальні цитокінові реакції, специфічні для партії, але не специфічні для продукційної платформи чи виробника. Їх можна зменшити або скасувати шляхом блокування передачі сигналу toll-подібного рецептора 9 або шляхом ферментативного відновлення ДНК у векторних партіях за допомогою ДНКази. Успішна трансдукція клітин HEK за допомогою партій AAV, оброблених ДНКазою, і аналізи ДНК продемонстрували, що ДНКаза не впливає на цілісність вектора, але деградує позавірусну ДНК. Ми робимо висновок, що як HEK-, так і Sf{21}}-клітинні препарати AAV можуть містити імуногенні екстравірусні компоненти ДНК, які можуть викликати запальні імунні реакції, специфічні для партії. Це свідчить про те, що вдосконалені стратегії видалення екстравірусних домішок ДНК можуть бути важливими для зниження імуногенних властивостей векторних препаратів AAV.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Останнє десятиліття стало свідком величезного інтересу до розробки нових стратегій на основі рекомбінантного аденоасоційованого вірусу (AAV) як для фундаментальних досліджень, так і для клінічних застосувань1–3. Основна причина полягає в тому, що вектори AAV були надзвичайно універсальними інструментами в галузі генної терапії, враховуючи їхню здатність ефективно та безпечно доставляти терапевтичні гени до цільових тканин4. Проте все більше дослідників незалежно повідомляють про результати доклінічних і клінічних досліджень, які свідчать про місцеві та системні імунні відповіді після введення AAV5–8.

Показано, що вектори AAV активують вроджені імунні рецептори розпізнавання паттернів, такі як toll-like receptor (TLR)2 і TLR9, що призводить до вивільнення запальних цитокінів та інтерферонів типу I (IFN)9,10. Імуногенні компоненти AAV, які можуть стимулювати ці відповіді, включають капсидні білки та векторний геном9,10. Імунні відповіді після застосування AAV також можуть бути викликані домішками в суспензії вектора5,11. Ці домішки визначено як будь-який компонент, присутній в очищеній суспензії вектора AAV, окрім бажаного продукту12, і є результатом процесу виробництва вектора. Два з основних методів виробництва клінічних рекомбінантних векторів AAV включають трансфекцію плазмідної ДНК у клітини HEK та інфікування клітин комах Spodoptera frugiperda (Sf9) баколувірусом13. Відповідно, потенційно імуногенні домішки, що містяться в суспензіях вектора AAV, можуть включати ендотоксини, компоненти середовища клітинної культури, реагенти, які використовуються для очищення AAV, білки та ДНК, отримані з клітин-господарів, а також залишкову бакуловірусну ДНК або плазмідну ДНК5. Додатковими факторами, які можуть вплинути на імуногенність суспензій вектора AAV, є посттрансляційні модифікації (PTM), вдруковані на капсиді різними платформами виробництва вектора5. Важливо, що вектори AAV, отримані з клітин HEK і клітини Sf9, значно відрізняються з точки зору їх PTM, залишкових білкових домішок клітин-господарів11 і, можливо, також домішків у ДНК (ДНК клітин HEK проти ДНК клітин Sf9, а також залишкової плазмідної ДНК проти бакуловірусної ДНК)14. Плазмоцитоїдні дендритні клітини (pCD) — це спеціалізований тип клітин вродженого імунітету, який секретує велику кількість ІФН типу І та прозапальних цитокінів під час вірусних інфекцій9,15 і відіграє важливу роль у сприйнятті векторів AAV9. Відповідно, щоб проаналізувати, чи відмінності між продукованими клітинами HEK та Sf9-клітинними векторами AAV призводять до відмінностей у їхніх імуногенних властивостях, ми стимулювали pDC людини різними партіями того самого вектора AAV, отриманого з двох систем виробництва. і різних виробників. Ми виявили, що половина досліджених векторних партій викликала специфічні для партії прозапальні імунні відповіді, які не були пов’язані ні з системою виробництва вектора, ні з виробником. Ці відповіді були опосередковані передачею сигналу TLR9 і чутливі до обробки партій вектора ДНКазою. Успішна трансдукція клітин HEK як необробленими, так і обробленими ДНКазою партіями векторів AAV та аналізи ДНК препаратів AAV показали, що ДНКаза не впливає на цілісність частинок AAV, а скоріше націлюється на неінкапсульовану екстравірусну ДНК. У сукупності це свідчить про те, що препарати вектора AAV можуть містити неінкапсульовану екстравірусну ДНК, яка може впливати на імуногенні властивості препаратів вектора AAV у pDC людини.

Переваги Cistanche tubulosa- зміцнити імунну систему

Результати

AAV індукує специфічні для партії вроджені імунні відповіді в pDC людини.

Дослідження показали, що вектори AAV, отримані з клітин HEK і клітин Sf9, відрізняються за своїми PTM і домішками, що містяться у вірусних суспензіях11. Ми припустили, що ці фактори можуть призвести до відмінностей в імуногенних властивостях між партіями векторів, отриманих із клітин HEK та Sf9. Щоб перевірити цю гіпотезу, ми проаналізували загалом вісім партій векторів AAV серотипу 8 (AAV8), що містять ідентичну послідовність ДНК промотору цитомегаловірусу (CMV) та ідентичний трансген білка посиленої зеленої флуоресценції (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; п’ять партій HEK- і три клітини Sf9) і чотири партії AAV2-CMV-eGFP (дві партії HEK- і дві клітини Sf9) від трьох різних виробників [виробник A; Viral Vector Core Facility of University of Iowa (Айова, США), виробник B; Virovek (Каліфорнія, США) і виробник С; Vigene Biosciences (MD, США)]. Щоб максимізувати подібність між партіями, сім партій AAV8 від виробника A та виробника B (таблиця 1) були виготовлені з використанням тієї самої вихідної плазміди. Крім того, реєстрацію векторних геномів (vg) векторних партій AAV за допомогою крапельної цифрової ПЛР (ddPCR) проводили в паралельному вимірюванні з використанням двох різних мішеней: однієї в послідовності CMV, а іншої в послідовності eGFP вектори. Результати, отримані шляхом кількісного визначення цілі CMV, використовували для титрування партій вектора AAV у наступних експериментах (Таблиця 1). pDC — це спеціалізовані вірусні сенсори, які масово продукують IFN типу I при вірусній інфекції15, включаючи вектори AAV9. Щоб дослідити, чи відрізняються продуковані HEK-клітинами та Sf9-клітинними вектори AAV за своєю здатністю викликати вроджені імунні відповіді в імунокомпетентних клітинах, ми стимулювали pDC людини перерахованими вище партіями векторів AAV. З цією метою pDC очищали з мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) окремих здорових людей-донорів шляхом негативної селекції з використанням магнітно-активованого сортування клітин (MACS). Аналіз проточної цитометрії підтвердив чистоту ізольованих pDC понад 90% (рис. S1). Десять, pDC окремого донора висівали та стимулювали партіями векторів AAV8 та AAV2 при MOI 1:1 × 106 мкг/клітину протягом 18 годин. MOI 1:106 vg/клітина, застосована до загальної кількості 12500 клітин у 50 мкл/лунку, перетворюється на титр 2,5×1011 vg/мл. Ми використали цей титр, оскільки він знаходиться в межах діапазону, що застосовується в дослідженнях генної терапії сітківки ока на людях (наприклад, 1 × 1012 мкг/мл16 або 4 × 1011–1,3 × 1012 мкг/мл17) і приматах (наприклад, 5 × 1011–5 × 1012 вг/мл6). Контролем служила стимуляція транспортним засобом. Інкубація з партіями векторів AAV8 і AAV2 не призвела до виявлення експресії трансгену в pDC. Однак чотири з восьми лотів AAV8 (лоти A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) і два з чотири партії AAV2 (партії B-Sf9-1, B-Sf9-2) індукували реактивну проліферацію клітин у стимульованих pDC (рис. 1a). Це супроводжувалося вивільненням прозапальних цитокінів (IP-10, MIP-1 і TNF-) та IFN типу I (IFN-). І навпаки, ані проліферація клітин, ані вивільнення цитокінів не індукувалися рештою AAV8 (партії A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) і лоти AAV2 (лоти C-HEK-1, C-HEK-2). Ці результати були підтверджені в трьох-чотирьох незалежних експериментах, кожен з яких проводився з клітинами одного окремого донора (рис. 1a–c і таблиця S1). Специфічні відмінності в концентраціях цитокінів у цих незалежних експериментах були статистично проаналізовані з використанням лінійної моделі змішаного ефекту та ретроспективного тесту Даннета (Q=2.6) шляхом порівняння середніх квадратичних різних партій вектора AAV з управління транспортним засобом (таблиці S2 і S3). Це продемонструвало статистично значущі відмінності у відповідях цитокінів між партіями «імуногенних» векторів AAV (AAV8 партії A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} або партії AAV2 B-Sf9-1, B-Sf9-2 відповідно) і контроль, але немає істотних відмінностей між партіями «неімуногенного» вектора AAV (партії AAV8 A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 або AAV2 партії C-HEK-1, C-HEK-2 відповідно) і контроль (Таблиця S3). Концентрації решти виміряних цитокінів, включених до мультиплексного аналізу, були нижчими за діапазон аналізу (тобто IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN- ) або ні «імуногенний», ні партії «неімуногенних» векторів індукували будь-яке значне збільшення їх вивільнення (тобто IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (рис. S2), що свідчить про ступінь специфічності цитокінової відповіді, опосередкованої AAV. Щоб дослідити відповіді цитокінів у більш ранній момент часу, pDC стимулювали «імуногенним» вектором AAV8 A-HEK-1. Вже через 2 години після стимуляції pDC ми спостерігали значне підвищення концентрації TNF- в супернатанте. Цю модель відповіді можна було підтвердити в трьох експериментах, кожен з яких проводився з клітинами одного окремого донора (рис. S3). Щоб дослідити, чи здатна більша доза «неімуногенного» вектора AAV8 викликати імунну відповідь, ми стимулювали pDC з технічно максимально застосовним MOI (1:4,61 × 106 vg). Цікаво, що ані реактивна клітинна проліферація, ані цитокінові реакції не були виявлені після стимуляції цим підвищеним титром (рис. S4). Всупереч нашій гіпотезі, ці результати демонструють, що вроджені імунні відповіді на AAV у pDC були специфічними для партії та не пов’язані з конкретною системою виробництва чи методом виробника/очищення.

Таблиця 1. Різні партії вірусних векторів AAV8 і AAV2, використаних у цьому дослідженні.

Малюнок 1. Індукція специфічної імунної відповіді вектора AAV у pDC людини. Людські pDC стимулювали різними партіями AAV8-CMV-eGFP та AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1 × 106 vg) протягом 18 годин (a) Типові зображення світлого поля pDC, стимульованих за допомогою контроль транспортного засобу (верхнє зображення) або партія імуногенного вектора AAV (нижнє зображення). Масштабна шкала становить 100 мкм. (b) Вивільнення цитокінів IP-10, MIP-1, TNF- та IFN- 2 AAV8-стимульованими pDC. (C) Вивільнення цитокінів AAV2-стимульованими pDC. Репрезентативні графіки одного з трьох-чотирьох незалежних експериментів. Оскільки при вимірюванні IFN- 2 (b,c) і вимірюванні TNF (c) деякі значення були нижче діапазону аналізу, константу 1 було додано до всіх виміряних значень IFN- 2 і TNF- для представлення у напівлогарифмічному графіку. Показано медіани та інтерквартильні діапазони. На етикетках окремих векторних лотів три виробники позначаються літерами A, B і C; Вектори, отримані з HEK-клітин і Sf9-клітин, позначаються «HEK і «Sf9», а відповідні партії того самого виробника та тієї самої системи виробництва пронумеровані «1, 2, 3». Обведіть: HEK-похідні векторний лот; трикутник: Sf9-похідний векторний лот; чорний: векторний лот від виробника A; помаранчевий: векторний лот від виробника B; зелений: векторний лот від виробника C.

На імунну відповідь на стимуляцію AAV у pDCs не впливають відмінності у співвідношенні капсид/VG.

Доклінічні дослідження показали, що відмінності в кількості повних і порожніх частинок вектора в суспензіях вектора AAV можуть впливати на імунну відповідь18. Щоб оцінити, чи відмінності в імуногенних властивостях між проаналізованими партіями векторів були обумовлені відмінностями у співвідношенні повних і порожніх частинок вектора, ми визначили титр векторних капсидів у всіх партіях AAV за допомогою титрування AAV ELISA та розрахували капсид/VG співвідношення. Цікаво, що великі відмінності у співвідношенні капсид/vg були виявлені між усіма партіями AAV (рис. 2). Приблизно вдвічі більше капсидів, ніж vg (2:1), було знайдено в AAV8-CMV-eGFP партії A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } та AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; і вчетверо більше (4:1) у AAV8 lot A-Sf9-1. У решті лотів спостерігалося співвідношення 1:1. Однак суттєвих відмінностей між співвідношенням капсид/vg «імуногенних» і «неімуногенних» партій вектора AAV не виявлено ні в AAV8 (P=0.27), ні в AAV2 (P=0.37) векторні лоти (рис. 2). Це свідчить про те, що відмінності в імуногенних властивостях проаналізованих партій вектора AAV також не були пов’язані з відмінностями у співвідношенні повних і порожніх частинок вектора.

Переваги добавки cistanche - як зміцнити імунну систему

Розпізнавання «імуногенних» партій вектора AAV8 TLR9.

Було показано, що вроджене імунне розпізнавання AAV мишачими та людськими pDC опосередковується ДНК-сенсором TLR99. Відповідно, ми оцінили, чи бере участь TLR9 також у розпізнаванні наших «імуногенних» партій вектора AAV8. З цією метою pDC висівали, як описано, і культивували з антагоністом TLR9 H154 (50 мкМ) з подальшою стимуляцією «імуногенними» векторними партіями AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 і A-Sf9-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Через 18 годин не спостерігалося жодних доказів проліферації клітин (рис. 3a), і було виміряно значне зниження вивільнення IP-10, MIP-1, TNF- та IFN- (рис. 3б). Це вказує на те, що імунні відповіді на «імуногенні» партії вектора AAV8 у pDC людини опосередковуються передачею сигналу TLR9.

Рисунок 2. Порівняння співвідношень капсид/vg між різними партіями векторів AAV8-CMV-eGFP і AAV2-CMV-eGFP. Співвідношення капсид/vg отримано з результатів вимірювань абсорбції (ELISA) і ddPCR для (a) восьми партій вектора AAV8 і (b) чотирьох партій вектора AAV2. Пунктирні лінії відділяють «імуногенні» від «неімуногенних» векторних партій AAV. Стовпчики вказують середні значення та стандартні відхилення повторів. Статистичну значущість визначали за допомогою непарного t-критерію Стьюдента.

Рисунок 3. Розпізнавання «імуногенних» партій вектора AAV8-CMV-eGFP pDC залежить від TLR9. Людські pDC обробляли антагоністом TLR9 H154 (50 мкМ) з подальшою стимуляцією «імуногенними» партіями вектора AAV8 (MOI: 1:1 × 106 vg) протягом 18 годин. (a) Репрезентативні зображення світлого поля очищених pDC, оброблених «імуногенними» векторними партіями AAV (верхнє зображення) або «імуногенними» векторними партіями AAV і H154 (нижнє зображення). Масштабна шкала становить 100 мкм. (b) Вивільнення цитокінів IP-10, MIP-1, TNF- та IFN- 2 стимульованими pDC. Оскільки під час вимірювань IFN- 2 деякі значення були нижче діапазону аналізу, константу 1 було додано до всіх виміряних значень IFN- 2 для представлення на напівлогарифмічному графіку. Показано середні значення та стандартні відхилення. Статистичну значущість визначали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та пост-гок аналізу Холма-Сідака. Значення P: менше або дорівнює 0,05: *; Менше або дорівнює 0,01: **; Менше або дорівнює 0,001: ***.

Лікування ДНКазами знижує імунні відповіді «імуногенних» партій векторів AAV8 і AAV2.

Хоча «імуногенні» вектори AAV8 викликали TLR9-залежну імунну відповідь у pDC, жодної такої відповіді не індукували «неімуногенні» партії. TLR9 активується у відповідь на ДНК, зокрема ДНК, що містить неметильовані мотиви CpG9. Важливо, що наші вимірювання ddPCR підтвердили, що ті самі компоненти вірусної ДНК були присутні як в «імуногенних», так і в «неімуногенних» партіях векторів. У сукупності це свідчить про те, що незапакована/вільна ДНК у вірусній суспензії, а не внутрішньовірусна ДНК, може бути збудником спостережуваних імунних відповідей на «імуногенні» векторні партії AAV. Отже, якщо залишкова вільна ДНК була присутня у вірусній суспензії партій «імуногенного» вектора AAV8, вроджена імунна відповідь повинна бути послаблена ДНКазою. Щоб перевірити цю гіпотезу, «імуногенні» партії векторів AAV8 і AAV2 попередньо обробляли ДНКазою I (100 мкг/мл) протягом 30 хвилин перед стимуляцією AAV. Щоб виключити неспецифічні ефекти обробки ДНКазою на pDC або частинки AAV, при стимуляції лише AAV вектори піддавали обробці DNasemock перед стимуляцією pDC. У цих імітаційних обробках без ДНКази частинки AAV інкубували при 37 градусах в ідентичному середовищі розщеплення ДНКазою протягом того самого періоду часу, що й AAV, оброблені ДНКазою. Десять pDC були висіяні та стимульовані партіями «імуногенних» векторів AAV, попередньо оброблених ДНКазою або імітовано оброблених (MOI: 1:1 × 106 vg). pDC, які інкубували лише з ДНКазою або фіктивно обробляли носієм, служили контролем. Цікаво, що обробка ДНКазою «імуногенних» векторних партій AAV8 і AAV2 зменшувала проліферацію реактивних клітин (рис. 4a) і або повністю скасовувала (AAV8 партії A-HEK-2 і A-Sf9-1; партії AAV2 B-Sf9-1 і B-Sf9-2) або значно зменшене (AAV8 партії A-HEK-1 і A-HEK-3) вивільнення IP{{40} }, MIP-1 , TNF- та IFN- після стимуляції AAV (рис. 4b,c). Щоб підтвердити, що спостережуваний ефект ДНКази насправді був спричинений розщепленням екстравірусної ДНК, а не впливом ДНКази на цілісність вектора, ми дослідили, чи впливала обробка ДНКазою партій вектора AAV на здатність до трансдукції AAV. Оскільки застосування AAV не призвело до будь-якої виявленої трансдукції pDC, для цих аналізів використовували клітини HEK, оскільки клітини HEK є добре відомою моделлю клітин для аналізу ефективності трансдукції після трансдукції AAV19. Ми стимулювали клітини HEK293T обробленими ДНКазою та фіктивно обробленими партіями векторів AAV8 і AAV2 (MOI: 1:8 × 104 vg) і оцінили ефективність трансдукції за допомогою флуоресцентної мікроскопії через 3 дні після нанесення вектора. Як описано, вектори AAV2 показали вищу потужність трансдукції порівняно з векторами AAV8. Крім того, важливо, що попередня обробка ДНКазою не зменшила ефективність трансдукції в партіях векторів AAV8 і AAV2, отриманих з HEK і Sf9-клітин (рис. S5a,b). Ці результати надають додаткові докази того, що вплив ДНКази на імуногенні властивості партій вектора зумовлений деградацією екстравірусної ДНК. Хоча антагоніст TLR9 H154 по суті припиняв вивільнення прозапальних цитокінів для всіх чотирьох імуногенних лотів AAV8 (рис. 3), попереднє лікування ДНКазою могло також усунути прозапальну цитокінову відповідь для AAV8 лотів A-HEK{{75} } і A-Sf9-1, тоді як він не повністю видалив його для AAV8 лотів A-HEK-1 і A-HEK-3 (рис. 4). Щоб перевірити, чи може збільшений час лікування ДНКазою скасувати цю цитокінову відповідь, ми повторили експерименти з моделюванням pDC після десятикратного збільшення часу інкубації ДНКази відповідних партій (A-HEK-1 та A-HEK{{87} }). Ми спостерігали, що після обробки векторів ДНКазою протягом 5 годин середні концентрації цитокінів у надосадовій рідині AAV-стимульованих клітин ще більше знизилися, і більше не відрізнялися суттєво від концентрації контрольного носія. Цю модель відповіді можна було підтвердити в трьох експериментах, кожен з яких проводився з клітинами одного окремого донора (рис. S6). Це свідчить про те, що основною причиною TLR9-залежної прозапальної імунної відповіді в pDC є позавірусна ДНК. Щоб перевірити, чи посилює вивільнення внутрішньовірусної ДНК імуностимулюючу активність векторів AAV, ми навмисно розкрили вірусні капсиди «імуногенної» партії AAV8 A-HEK-1 шляхом термічної обробки при 95 градусах протягом 10 хвилин . Термічно оброблену партію вектора потім використовували для стимуляції pDC. Незважаючи на відсутність відмінностей у реактивній проліферації клітин після стимуляції AAV8 A-HEK-1 із термічною обробкою та без неї, спостерігалося значне збільшення вивільнення IP-10, MIP-1 , TNF- та IFN- в умовах нагрівання, що вказує на те, що вивільнення інкапсульованої вірусної ДНК у суспензію вектора може сприяти індукції імунних відповідей (рис. 5). Разом ці дані вказують на те, що векторні препарати AAV можуть містити екстравірусні забруднювачі ДНК, які можуть викликати специфічні імунні відповіді в pDC. Ці відповіді опосередковуються передачею сигналу TLR9 і можуть бути зменшені/скасовані обробкою партій вектора ДНКазою.

Рисунок 4. Попередня обробка ДНКазою знижує імунні відповіді, індуковані «імуногенними» партіями векторів AAV8-CMV-eGFP і AAV2-CMV-eGFP. Людські pDC стимулювали обробленими ДНКазою «імуногенними» векторними партіями AAV8 протягом 18 годин (MOI: 1:1 × 106 vg). (a) Типові яскраві польові зображення очищених pDC, стимульованих «імуногенними» партіями вектора AAV (верхнє зображення) та партіями «імуногенного» вектора AAV, попередньо обробленими 1{{30}}0 мкг/мл ДНКази I (нижнє зображення). Масштабна шкала становить 500 мкм. (b) Вивільнення цитокінів IP-10, MIP-1, TNF- та IFN- 2 AAV8-стимульованими pDC. (c) Вивільнення цитокінів AAV2-стимульованими pDC. Оскільки при вимірюванні IFN- 2 (b і c) і вимірюванні TNF (b), деякі значення були нижче діапазону аналізу, константу 1 додавали до всіх виміряних значень IFN- 2 і TNF- для подання в напівлогарифмічному графіку. Показано середні значення та стандартні відхилення. Статистичну значущість визначали за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та пост-гок аналізу Холма–Сідака. Значення P: менше або дорівнює 0,05: *; Менше або дорівнює 0,01: **; Менше або дорівнює 0,001: ***.

Дослідницький аналіз забруднювачів екстравірусної ДНК у векторних препаратах AAV8.

Щоб виконати першу дослідницьку характеристику екстравірусних компонентів ДНК у партіях векторів AAV, репрезентативний «імуногенний» (A-HEK-1) і «неімуногенний» (B-HEK-1) Було проаналізовано партію вектора, отриманого з клітин HEK. Ці партії або обробляли ДНКазою в середовищі pDC протягом 30 хвилин при 37 градусах, як описано вище, або піддавали імітаційній обробці та ультрафільтрації з використанням фільтруючого пристрою 100 кДа, або лише імітаційно оброблювали (рис. S7a– g). Послідовне розділення біоаналізатором LabChip та оцінка очищеної ДНК виявили наявність порівнянних кількостей векторної ДНК (рис. S7b–g) в оброблених і імітаційно оброблених зразках кожної партії, підтверджуючи, що ні ультрафільтрація, ні обробка ДНКазою не вплинули на вміст ДНК всередині капсиду. Крім того, було показано, що тільки «імуногенна» (рис. S7a–d), але не «неімуногенна» векторна партія (рис. S7a,e–g) містить додаткові молекули ДНК розміром від 100 до 450 bp (рис. S7c,d і h). Важливо те, що ці додаткові молекули ДНК можна було виявити у зразку, обробленому імітацією, і в ультрафільтрованому зразку, але вони були практично відсутні в зразку, обробленому ДНКазою (рис. S7a–d). Це вказує на те, що ці молекули ДНК представляють позавірусні забруднення ДНК, які можуть бути розщеплені ДНКазою, але не можуть бути видалені із суспензії вектора ультрафільтрацією. Твердження про те, що ці забруднювачі можуть бути виявлені лише в «імуногенній», але не в «неімуногенній» векторній партії, доводить, що поява цих екстравірусних молекул ДНК є специфічною для партії, і може додатково припустити, що ці молекули індукують або сприяють до імуностимулюючих властивостей вектора. Для оцінки потенційного джерела забруднюючої ДНК у «імуногенних» (A-HEK-1) та «неімуногенних» (B-HEK-1) партіях кількісного (q)ПЛР аналізу HEK клітинної ДНК, плазмідної ДНК та векторної ДНК AAV. ДНК-матрицю з оброблених ДНКазою, імітаційно оброблених і ультрафільтрованих і тільки імітаційно оброблених зразків кожної партії використовували для ампліфікації Alu-повтору, гена NPIP із багатокопійним ядерним геномом і послідовностей генів 16S рРНК мітохондрій (mt16S) клітинного походження HEK , для ампліфікації амплікону інвертованого кінцевого повтору AAV8 (ITR2; походження векторної та трансгенної плазмідної ДНК) і для ампліфікації амплікону для гена blah (резистентності до ампіциліну) (Amp; походження плазмідної ДНК) (Таблиця S4). Порівняння співвідношень значень ΔCt ДНК-специфічного амплікону клітини HEK проти амплікону ITR2 (тобто Alu проти ITR2, NPIP проти ITR2 та mt16S проти ITR2) та плазмідного ДНК-специфічного амплікону проти амплікону ITR2 (Amp порівняно з ITR2), відповідно, вказує на те, що дві партії містять незначну кількість ядерної та мітохондріальної ДНК клітин HEK. Навпаки, аналіз виявив пристойну кількість плазмідної ДНК як у «імуногенній», так і в «неімуногенній» векторній партії (приблизно 1/32 та 1/50, відповідно, з точки зору кількості копій відносно AAV ДНК), частка, яка знаходиться в межах діапазону значень, повідомлених для інших векторів AAV12 (рис. S7). Тим не менш, не було очевидних відмінностей у відносній пропорції векторної ДНК до плазмідної та клітинної ДНК HEK між обробленими ДНКазою та імітаційно обробленими або ультрафільтрованими та імітаційно обробленими зразками обох партій вектора (рис. S8). Це може свідчити про те, що незапакована забруднююча ДНК подібна за складом цільової послідовності до складу упакованої ДНК. Однак обмеженням аналізу КПЦР є розмір забруднюючої ДНК (100–450 bp), яка міститиме пристойну частку фрагментів із неповною цільовою послідовністю.

Рисунок 5. Вивільнення внутрішньовірусної ДНК шляхом термічної обробки векторів посилює прозапальні цитокінові відповіді в pDC. Вивільнення цитокінів IP-10, MIP-1, TNF- та IFN- 2 pDC через 18 годин після стимуляції термічно обробленим AAV8 партією A-HEK-1 (MOI: 1:1 × 106 vg). Горизонтальні лінії позначають середні значення та стандартні відхилення. Статистично значущі відмінності між цитокіновими відповідями, індукованими термообробленими та необробленими векторами, визначали за допомогою t-критерію Стьюдента. Значення P: менше або дорівнює 0.01: **; Менше або дорівнює 0,001: ***.

Обговорення

Вектори AAV є одним із найперспективніших інструментів у генній терапії. Однак накопичення доказів ставить під сумнів думку про те, що імуногенність AAV є незначною5. У світлі цього стає все більш важливим краще зрозуміти механізми, за допомогою яких виникають імунні відповіді на AAV. У цьому дослідженні ми демонструємо, що (1) AAV8 і AAV2 індукують специфічні для партії вроджені імунні відповіді в pDC людини, які не є специфічними ні для співвідношення капсид/vg, ні для виробничої платформи, ні для виробника/методу очищення; (2) вроджені імунні відповіді в pDCs залежать від сигналізації TLR9 і можуть бути знижені шляхом попередньої обробки ДНКазою; (3) Обробка ДНКазою не впливає на цілісність частинки вектора, оскільки не знижує швидкість трансдукції партій векторів AAV8 і AAV2 у клітинах HEK293T; і (4) векторні партії AAV можуть містити екстравірусні молекули ДНК, які можна видалити шляхом обробки векторної партії ДНКазою. Це свідчить про те, що як HEK-, так і Sf{15}}-клітинні препарати AAV можуть містити домішки екстравірусної ДНК, які стимулюють вроджену імунну відповідь. У недавньому дослідженні був проведений порівняльний аналіз з використанням векторів AAV з різних видів клітин-господарів (клітин HEK і клітин Sf9)11. Автори виявили, що вектори, отримані від HEK та Sf9-, відрізняються за своїми PTM та залишковими домішками білка клітини-господаря для всіх серотипів AAV та виробників, які вони тестували. Крім того, вони проаналізували цитокінову відповідь первинних фібробластів людини на трансдукцію AAV і виявили, що вектори, отримані від HEK та Sf9-, можуть відрізнятися за своїми імуногенними властивостями. У нашому дослідженні ми також порівняли ці дві основні виробничі системи, використовуючи різні партії однієї конструкції AAV від різних виробників і двох різних серотипів. Однак вектор-індуковані імунні відповіді, які ми спостерігали в нашій моделі pDC людини, не були конкретно пов’язані з певною системою виробництва, виробником або серотипом, натомість вони були специфічними для партії. Попередні доклінічні та клінічні дослідження генної терапії сітківки показали, що на імунні відповіді на вектори AAV, такі як запалення очей або інфільтрацію імунних клітин, можуть впливати відмінності у співвідношенні капсид/vg18 або відмінності в дозах5. Timmers et al.18 показали, що видалення порожніх капсидів AAV із суспензії вірусу зменшує запалення та покращує трансдукцію вірусу в доклінічному дослідженні з приматами. Тим не менш, наші результати показали, що підвищене співвідношення капсид/vg було присутнє як серед «імуногенних», так і «неімуногенних» партій вектора AAV, що означає, що більша кількість капсидів (порожніх капсидів) у вірусній суспензії не відповідає за індукцію векторні специфічні імунні відповіді в нашій моделі pDC людини. Крім того, ми раніше показали, що AAV8 індукує імунні відповіді залежно від дози у приматів 6,8. Однак збільшення дози «неімуногенних» векторів AAV у цьому дослідженні було недостатнім для запуску імунної відповіді в pDC людини. Тому, щоб зрозуміти причину відмінностей в імуногенних властивостях векторів, ми дослідили механізм, задіяний у розпізнаванні «імуногенних» партій AAV. Використання моделей імунокомпетентних клітин in vitro дозволило вченим точніше вивчити роль шляхів TLR у вроджених імунних реакціях, спричинених векторами AAV9,10. Zhu et al.9frst описав, що pDC, але не звичайні DC або не-pDC, вивільняють велику кількість IFN типу I та прозапальних цитокінів у відповідь на стимуляцію AAV і продемонстрували участь шляху TLR9 у розпізнаванні AAV8 та AAV2 за допомогою миші pDC. Автори також помітили, що AAV2 індукує TLR9-залежні імунні відповіді в pDC людини. У нашому дослідженні з використанням одного з найбільш специфічних антагоністів TLR9, H1549,21–24, ми опосередковано показали, що не лише AAV2, а й вектори AAV8 індукують TLR9-залежні вроджені імунні відповіді в pDC людини, але в дуже специфічній манері. Оскільки TLR9 є рецептором ДНК, це свідчить про те, що імунні відповіді на «імуногенні» партії вектора AAV були індуковані компонентами ДНК. Однак, хоча наші вимірювання ddPCR підтвердили, що однакові упаковані компоненти ДНК були присутні як в «імуногенних», так і в «неімуногенних» партіях векторів, «неімуногенні» партії не викликали імунної відповіді в pDC. Крім того, обробка ДНКазою або зменшувала, або скасовувала імуностимулюючі властивості «імуногенних» векторних партій AAV, але не зменшувала потужність трансдукції цих векторів у клітинах HEK, що свідчить про те, що обробка AAV ДНКазою була спрямована на неінкапсульовану екстравірусну ДНК у клітинах HEK. суспензія вектора, але не вплинула на цілісність генома вектора в інтактному капсиді. Це було додатково підтверджено порівняльними аналізами ДНК репрезентативних партій векторів, оброблених ДНКазою та імітовано оброблених «імуногенних» і «неімуногенних».

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

У сукупності всі ці експерименти вказують на те, що імунна відповідь на «імуногенні» партії векторів у pDC була організована не ДНК, що міститься в частинках AAV (тобто геном вектора або потенційні домішки ДНК, упаковані в капсиди AAV), а доступною позавірусною ДНК компоненти, що містяться у вірусних суспензіях (тобто ДНК поза вірусним капсидом або незахищена ним). Ми також спостерігали, що коли ДНК, що міститься у вірусних капсидах партії "імуногенного" вектора, піддавалася впливу клітин шляхом термічної обробки вектора, спостерігалося посилення імунної відповіді. Незрозуміло, чи було підвищення імуностимулюючої активності після відкриття капсидів за рахунок одноланцюгової ДНК вектора чи за рахунок потенційних забруднень, упакованих у капсидах AAV, таких як залишкові нуклеїнові кислоти клітини-господаря, залишкові послідовності допоміжної ДНК, каркасна послідовність фрагменти, упаковані разом із касетою, або зворотне праймування з ITR, що призводить до невеликих фрагментів магістралі, упакованих у AAV12,25. Точний механізм поглинання екстравірусної ДНК pDC залишається невідомим. Чуйність pDC на олігонуклеотиди CpG демонструє, що pDC можуть реагувати на вільну ДНК26. Це свідчить про те, що імунна відповідь у pDC може бути викликана поглинанням вільної забруднюючої ДНК, що міститься у суспензії вектора. Крім того, було показано, що pDC можуть приймати вектори AAV27, альтернативно припускаючи, що потенційна пов’язана з капсидом ДНК може бути транспортована в клітину під час поглинання частинок AAV. Наявність екстравірусного зараження ДНК у векторних препаратах AAV може бути або невід’ємною властивістю відповідної партії вектора, що є результатом виробництва та процесу очищення векторів, або це може бути пов’язано з вивільненням інкапсульованої ДНК через невідповідні умови зберігання . Усі векторні партії, досліджені в цих експериментах, були отримані протягом того самого періоду часу (5 із 8 досліджених векторних партій AAV8, з яких дві були «імуногенними» (A-HEK-2; A-HEK-3) і три були «неімуногенними» (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) навіть вироблялися паралельно спеціально для цього дослідження), партії з кожного виробника відправляли в одних і тих самих транспортних коробках, і після отримання всі партії зберігалися поруч в одній шухляді морозильника з температурним захистом від температури -80 градусів, перш ніж аліквоти всіх партій були розморожені одночасно та застосовані до pDC у паралельних експериментах. Це переконливо свідчить про те, що процес виробництва та очищення AAV, а не неправильне зберігання, відповідальний за відмінності у вмісті екстравірусної ДНК та імуностимулюючі властивості цих партій. У минулому партії векторів клінічного класу AAV, виготовлені для генної терапії (alipogene tiparvovec, Glybera), більше не були дозволені через велику кількість домішок, включаючи потенційно імуногенну залишкову ДНК клітин-господарів28. Видалення домішок ДНК з вірусних суспензій зазвичай виконується в процесі виробництва. Тут регулярно застосовують обробку бензоназою 29 або ДНКазою 30 для видалення залишкової ДНК із остаточної вірусної суспензії. Ця обробка, залежно від протоколу, триває від 30 хвилин до 3 годин, а потім фермент інактивується хімічними речовинами, такими як солі хлориду цезію30. У наших експериментах було виявлено, що чотири з п’яти партій AAV8, отриманих з Центру вірусних векторів Університету Айови, і обидві партії векторів AAV2 від Virovek були імуногенними для pDC. Як описано в розділі «Матеріали та методи», процес очищення векторних партій обох цих виробників включає кілька етапів очищення, деякі з яких значно відрізняються один від одного. Таким чином, процес очищення на Core Facility в Айові включає обробку турбонуклеазою з подальшим ультрацентрифугуванням у градієнті йодиксанолу, аніонообмінною колонковою хроматографією, флаттер-стерилізацію та обмін буфера з використанням відцентрових фільтрів. Навпаки, Virovek застосовує обробку бензоназою, ультрацентрифугування в CsCl з наступним знесоленням і фільтраційною стерилізацією. З іншого боку, процес очищення Vigene не включає обробку ДНКазою, але, як це використовується Core Facility в Айові, включає ультрацентрифугування в градієнті йодиксанолу. Дивно, однак, що жоден з трьох векторів, отриманих з Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 і 2), не індукував імунну відповідь у pDC, що свідчить про те, що «неімуногенні " Векторні партії також можуть бути створені за допомогою виробничих процесів, які не передбачають обробки ДНКазами.

Переваги добавки cistanche - як зміцнити імунну систему

Загалом, частково схожі та частково різні етапи очищення, які використовуються трьома виробниками, ускладнюють зв’язок імуногенних властивостей векторів, що спостерігаються в pDC, з одним етапом у виробничому процесі. У клінічних випробуваннях використовуються вектори класу належної виробничої практики (GMP), які піддаються суворому контролю якості. Жоден із векторів від трьох виробників, використаних у цьому дослідженні, не відповідає належній лабораторній практиці (GLP) і тому може мати нижчу чистоту, ніж вектори клінічного класу. Таким чином, важливо визнати, що вектори GMP, які використовуються в клінічних випробуваннях на людях, можуть або не проявляти відмінності, які ми спостерігали в цьому дослідженні, і що актуальність наших висновків для клінічного використання генної терапії не є ясною. Однак, згідно з нашим власним досвідом, значні специфічні для партії відмінності в концентрації забруднюючих компонентів, таких як білки клітин-господарів, можуть виникати навіть у векторах класу GMP, і навіть у векторах класу GMP немає узгоджених специфікацій щодо того, які рівні прийнятний5. У сукупності покращення процесу виробництва векторів AAV є ключовим для уникнення присутності залишкових домішок у вірусних суспензіях, щоб мінімізувати потенціал для ненавмисних імунних відповідей. На закінчення ми продемонстрували, що екстравірусні домішки ДНК можуть впливати на імуногенні властивості векторів AAV у pDC людини. Потрібні подальші дослідження, щоб дослідити наслідки цих висновків для безпеки AAV-опосередкованої генної терапії на моделях тварин або пацієнтів-людей.

Список літератури

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Геномна інженерія з використанням аденоасоційованого вірусу: базові та клінічні дослідження. мол. тер. 24, 458–464 (2016).

2. Гаріта-Ернандес М. та ін. AAV-опосередкована доставка генів до тривимірних органоїдів сітківки, отриманих з індукованих плюрипотентних стовбурових клітин людини. Міжн. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Рассел С. та ін. Ефективність і безпека воретигену непарвовека (AAV2-hRPE65v2) у пацієнтів із RPE65-опосередкованою спадковою дистрофією сітківки: рандомізоване, контрольоване, відкрите дослідження фази 3. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. He, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Розвиток терапевтичних засобів, які доставляють AAV, до остаточного лікування. J. Mol. Мед. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Імунні відповіді на генну терапію сітківки з використанням аденоасоційованих вірусних векторів — наслідки для успіху та безпеки лікування. Прог. Сітківка. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF та ін. AAV8 може індукувати вроджені та адаптивні імунні реакції в оці приматів. мол. тер. 25, 2648–2660 (2017).

7. Бойд Р. Ф. та ін. Зменшення трансдукції сітківки та посилення трансген-спрямованої імуногенності з інтравітреальною доставкою rAAV після задньої вітректомії у собак. ген тер. 23, 548–556 (2016).

8. Родрігес-Боканегра Е. та ін. Поздовжня оцінка гіпервідбиваючих фокусів у сітківці після субретинальної доставки аденоасоційованого вірусу у приматів. переклад Vis. Sci. технол. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te Шлях TLR9-MyD88 є критичним для адаптивної імунної відповіді на вектори генної терапії аденоасоційованого вірусу у мишей. Дж. Клін. Розслідувати. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. та ін. Toll-подібний рецептор 2-опосередковує вроджену імунну відповідь у непаренхіматозних клітинах печінки людини на аденоасоційовані вірусні вектори. Гепатологія 55, 287–297 (2012).

11. Румачик Н. Г. та ін. Методи мають значення: стандартні виробничі платформи для рекомбінантних AAV виробляють хімічно та функціонально різні вектори. мол. тер. Методи Клін. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Райт, Дж. Ф. Домішки, пов’язані з продуктом, у рекомбінантних векторах AAV клінічного класу: характеристика та оцінка ризику. Біомедицина 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Виробництво рекомбінантних аденоасоційованих вірусних векторів для клінічних випробувань. мол. тер. Методи Клін. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Фармакологія виробництва рекомбінантних аденоасоційованих вірусів. мол. тер. Методи Клін. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Плазмоцитоїдна дендритна клітинна біологія та її роль в імуноопосередкованих захворюваннях. Clin. переклад Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD та ін. Ефективність і безпека генної терапії сітківки з використанням аденоасоційованого вірусного вектора для пацієнтів з хоріоідеремією: рандомізоване клінічне дослідження. JAMA Офтальмол. 137, 1247–1254 (2019).

17 Велебер Р. Г. та ін. Результати через 2 роки після генної терапії для RPE65-вродженого амаврозу Лебера та важкої дистрофії сітківки в ранньому дитинстві. Офтальмологія 123, 1606–1620 (2016).

18. Тиммерс А.М. та ін. Очна запальна реакція на інтравітреальну ін'єкцію аденоасоційованого вірусного вектора: відносний внесок геному та капсиду. гудіння ген тер. 31, 80–89 (2020).

19. Ран Г. та ін. Сайт-спрямований мутагенез покращує ефективність трансдукції рекомбінантних векторів AAV, отриманих із капсидної бібліотеки. мол. тер. Методи Клін. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Елліс Б. Л. та ін. Дослідження ефективності трансдукції ex vivo/in vitro первинних клітин і клітинних ліній ссавців з дев’ятьма природними аденоасоційованими вірусами (AAV1-9) і одним сконструйованим аденоасоційованим серотипом вірусу. Вірол. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. et al. Вплив супресивної ДНК на CpG-індуковану імунну активацію. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Чжан П. та ін. Антагоніст Toll-подібного рецептора 9 пригнічує гуморальний імунітет при експериментальній аутоімунній міастенії. мол. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK та ін. Створення аденоасоційованих вірусних векторів для уникнення вроджених імунних і запальних реакцій. Sci. переклад Мед. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM. Структура, механізм і терапевтична корисність імуносупресивних олігонуклеотидів. Pharmacol. рез. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA та ін. 547. Препарати AAV містять забруднення з послідовностей ДНК у продукційних плазмідах безпосередньо за межами ITR. мол. тер. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. та ін. TLR9 подає сигнал після транслокації з ER на CpG ДНК у лізосомі. Нац. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. et al. Основні підгрупи дендритних клітин людини ефективно трансдукуються самокомплементарними аденоасоційованими вірусними векторами 1 і 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Оцінка: Глибера. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Доступ 03 березня 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Недорогий, незалежний від серотипу протокол очищення природного та біоінженерного рекомбінантного аденоасоційованого вірусу. J. Biol. Методи 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Виробництво та характеристика аденоасоційованих вірусних векторів. Нац. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Кімура Т. та ін. Виробництво аденоасоційованих вірусних векторів для застосувань in vitro та in vivo. Sci. Доповідь 9, 13601 (2019).

32. Аюсо Е. та ін. Висока чистота вектора AAV забезпечує незалежне від серотипу та тканини підвищення ефективності трансдукції. ген тер. 17, 503–510 (2010).