Експресія нейронної синтази оксиду азоту та реніну в диспластичних нирках молодих собак

АНОТАЦІЯ.

Ренін інейрональна синтаза оксиду азотув нирці контролюютьренін-ангіотензинітубулогломерулярні системи зворотного зв'язку. У цьому дослідженні досліджували експресію реніну та нейронівсинтаза оксиду азотувдиспластичні ниркитрьох молодих собак. Імунореактивність реніну, яка виникає в юкстагломерулярних і тубулярних клітинах дисплазованих нирок, не відрізнялася від такої в нормальних нирках молодих собак. Клітини з щільною макулою в нормальних нирках показали нейрональну імунореактивність до синтази оксиду азоту, але клітини з диспластичними нирками не показали явних сигналів. Це спостереження може корелювати з патологічними механізмами ниркової недостатності у молодих собак.

КЛЮЧОВІ СЛОВА: хронічні захворювання нирок, диспластична нирка, імуногістохімія, нейрональна синтаза оксиду азоту, ренін

Ниркова недостатністьіноді зустрічається у молодих собак. У таких випадках гістологічне дослідження часто демонструє диспластичне ураження нирок. Однак патофізіологічні механізми, які відбуваються в диспластичних нирках собак, залишаються неясними. Нещодавно ми продемонстрували ослаблення циклооксигенази (ЦОГ)-2 при хронічних захворюваннях нирок у молодих собак із дисплазією нирок за допомогою імуногістохімічного аналізу [19].

Підтримка добавки CistancheДобавка для функції нирок

ЦОГ-2 є індуцибельним запальним ферментом, необхідним для нормального розвитку нирок у плода та неонатального періоду [12, 15]. Після народження ЦОГ -2 конститутивно експресується в нирках і концентрується в обмеженій зоні macula densa (MD) товстих висхідних кінцівок [1, 4, 22]. MD є спеціалізованою областю, що прилягає до судинного полюса клубочка. Він контролює секрецію реніну та систему тубулогломерулярного зворотного зв’язку (TGF). ЦОГ-2, що експресується в клітинах MD, регулює ці механізми [6, 8]. Окрім ЦОГ-2, відомо, що нейрональна синтаза оксиду азоту (nNOS), яка також експресується в клітинах MD, є основним регулятором системи TGF [3, 18]. Відомо, що ці дві молекули, які коекспресуються в MD, взаємодіють одна з одною [2, 5, 9]. У цьому дослідженні ми досліджували експресію реніну та nNOS у нирках з дисплазією за допомогою імуногістохімії, щоб визначити, чи спричиняє ослаблення ЦОГ-2 у нирках з дисплазією порушення ренін-ангіотензинової системи та системи TGF у молодих собак

Фіксовані формаліном парафінові блоки диспластичних нирок молодих собак (n=3), нормальних нирок молодих собак (n=3) і нормальних нирок дорослих собак (n=4) були досліджені. ті самі, що використовувалися в нашому попередньому дослідженні, в якому клінічна історія та підготовка тканин були описані раніше [19]. Дослідження було схвалено Комітетом з експериментів на тваринах Університету Кагосіма, Японія (VM15020). Готували зрізи товщиною 3- мкм і проводили імуногістохімічний аналіз реніну та nNOS згідно з такими протоколами: (1) депарафінізація; (2) відновлення антигену шляхом мікрохвильового нагрівання в 10 мМ цитратного буфера (pH 6,0) для nNOS; (3) інкубація з 3% H2O2 протягом 30 хв; (4) блокування 3% бичачого сироваткового альбуміну (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) для реніну або 0,25% казеїну (Sigma-Aldrich) для nNOS, розведених у фосфатно-сольовому буфері, протягом 30 хв; (5) інкубація протягом ночі при 4 градусах з розведенням 1:3,000 кролячої антирекомбінантної поліклональної антиренінової антисироватки (надається доктором Муракамі, Університет Цукуби, Японія) або 1:3,{{32 }} розведення кролячої анти-nNOS поліклональної антисироватки (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) у блокуючому розчині; (6) інкубація протягом 30 хвилин при кімнатній температурі з пероксидазно-полімерним кон’югованим універсальним антитілом (анти-мишачий імуноглобулін (Ig) G та анти-кролячий IgG; проста фарба MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Токіо, Японія) ; та (7) виявлення імуносигналу за допомогою 3,3'-діамінобензидинової системи (3,3'-діамінобензидиновий буферний планшет; Merck, Дармштадт, Німеччина). Для зрізів негативного контролю замість первинного антитіла використовували нормальний кролячий IgG (Lab Vision, Fremont, CA, США).

Рис. 1. Імуногістохімія реніну в диспластичній нирці собаки. A: Ренін-позитивні сигнали спостерігалися в юкстагломерулярних клітинах поблизу судинних полюсів і деяких клубочкових клітинах (стрілки). Плитка: 50 мкм. B: Інша область розрізу показана на панелі A. Канальці в неідентифікованому сегменті нефрону демонструють ренін-імунореактивність. Плитка: 50 мкм.

Рандомізований морфометричний аналіз ренінової імунореактивності проводили згідно з раніше описаним методом [20]. Коротко, реніновий індекс визначався як відношення загальної кількості ренін-позитивних артеріол до загальної кількості клубочків і виражався на 100 клубочків. Відмінності між групами аналізували за допомогою методу множинного порівняння Бонферроні з SPSS версії 24 (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Патогістологічну діагностику проводили згідно з мікроскопічними критеріями дисплазії нирок собак за Picut і Lewis [14]. Гістологічні зрізи всіх трьох випадків показали асинхронну диференціацію, що вказує на наявність уражень плодових/незрілих клубочків. У зрілих ниркових тканинах спостерігалися вторинні зміни різного ступеня тяжкості, такі як пошкодження канальців, інтерстиціальний фіброз і склеротичні клубочки.

У диспластичних нирках сигнали ренін-імунореактивності спостерігалися в юкстагломерулярних клітинах (JGC) (рис. 1A), а тубулярні клітини були розташовані в дистальних відділах нефронів (рис. 1B). У деяких клубочках кілька клітин показали ренін-позитивні сигнали поблизу судинних полюсів (рис. 1A). У молодих контрольних нирках сигнали реніну також були виявлені як в JGC, так і в дистальних канальцях, включаючи клітини MD. У дорослих контрольних нирках ренін-позитивні сигнали були обмежені JGCs. Статистично кількість ренін-позитивних ділянок у диспластичних нирках не показала істотних відмінностей від таких у молодих і дорослих нирках.

Відомо, що стимуляція вироблення реніну відіграє важливу роль у передачі сигналів ЦОГ-2, і попередні дослідження показали, що активність і концентрація реніну в плазмі знижуються після введення інгібітора ЦОГ-2 або при нокауті ЦОГ -2 ген [10, 11]. Оскільки нирки з дисплазією, досліджені в цьому дослідженні, не виявили експресії ниркової ЦОГ-2 [19], спочатку підозрювали зниження імуносигналів реніну в JGC як можливу фізіологічну аномалію в дисплазованих нирках. Однак поточний імуногістохімічний аналіз не міг підтвердити цю гіпотезу, і не було запропоновано явного зниження реніну в JGC. Хоча фізіологічна роль канальцевого реніну не була з’ясована раніше, ниркова обробка натрію може бути можливою роллю канальцевого реніну, оскільки посилення експресії реніну було індуковано в дистальному нефроні після годування щурів дієтою з низьким вмістом солі. [16], і диспластичні нирки собак, досліджених у цьому дослідженні, могли підтримувати цю тубулярну функцію.

ЦОГ-2 також важливий для регуляції системи TGF, яка важлива для підтримки швидкості клубочкової фільтрації. Дослідження на щурах із застосуванням методу мікропунктури продемонструвало пригнічення відповіді TGF після лікування інгібітором ЦОГ-2 [2]. Відповідь TGF у диспластичних нирках може бути ослаблена через відсутність ниркової експресії ЦОГ-2. Однак раніше не повідомлялося про відповідні висновки. У нирках nNOS експресується в клітинах MD і допомагає регулювати систему TGF [18].

У цьому аналізі nNOS не було виявлено явних сигналів у ділянках MD у всіх випадках (рис. 2). Це зниження nNOS вважалося етіопатогенним явищем у диспластичних нирках, а не набутим після ниркової недостатності у випадках. Наше попереднє дослідження з використанням щурів OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) як моделі діабету 2 типу продемонструвало, що nNOS була надмірно експресована в MD та навколо нього канальцевих клітинах на пізній стадії діабетичної нефропатії [21]. У регуляції системи TGF функція nNOS подібна до ЦОГ-2 і взаємодіє з нею. Деякі дослідження показали, що nNOS розташовується перед сигнальним шляхом і стимулює експресію ЦОГ-2 [5, 9]. З іншого боку, інші дослідження показали протилежне, що ЦОГ-2 розташована вище за NOS [2, 13]. Незалежно від різниці в сигнальному шляху, відсутність nNOS-імуносигналів у MD-клітинах може викликати зниження експресії ниркової ЦОГ-2 у диспластичних нирках.