Експеримент 4 Вплив фенілетанол глікозиду Cistanche Deserticola на модель депресії перименопаузального синдрому мишей Матеріали та методи 1 Експериментальні матеріали
Apr 17, 2024
1.1 Піддослідні тварини
Миші класу SPF, породи Куньмін, самки, 18~22 г, надані Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., номер сертифіката цієї партії мишей: 0016003; лабораторний сертифікат номер SYXK (Ю) 2010-001. 1.2 Експериментальні препарати
Цистанхе фенілетанол глікозидготували згідно з методом експерименту 1, і вміст досягав 66,47%. Капсула Gengnian'an, інгредієнти: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, кора півонії, Poria cocos, перламутр, curculigo, Schisandra chinensis, магнетит, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, floating wheat, polygonum multiflorum . Функції та показання:Живіть Інь і приборкуйте Ян, позбавити від неприємностейізаспокоїти розум. Використовується при клімактеричних припливах і пітливості, запамороченнях, шумі у вухах, дратівливості та безсонні. Технічні характеристики: 0,3 г на капсулу. Застосування та дозування: перорально по 3 капсули за раз 3 рази на день. Виробник: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Номер виробничої партії: 121104. Номер дозволу: National Drug Approval No. Z14021848.
Соєві ізофлавони та вітамін Е в м’яких капсулах, список інгредієнтів: порошок соєвих ізофлавонів, вітамін Е, соняшникова олія, желатин, гліцерин, вода, тартразин, діоксид титану. Знакові інгредієнти та вміст: кожні 100 г містять 55,2 мг ізофлавонів сої (в перерахунку на геністеїн) і 608,5 мг вітаміну Е. Функції для здоров’я: збільшують щільність кісток. Інструкція та дозування: Приймати по 1 капсулі 2 рази на день, запиваючи теплою водою. Технічні характеристики: 500 мг × 100 капсул. Виробник: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Номер партії виробництва: 13070302. Номер дозволу: Guoshijianzi G20080032. 1.3 Експериментальні реактиви
Натрій карбоксиметилцелюлоза, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., номер партії: 20120418; пеніцилін натрію для ін’єкцій, North China Pharmaceutical Co., Ltd., специфікація: 4 млн одиниць, номер виробничої партії: c1206807; розчин формальдегіду (ЧДА), Yantai City Shuangshuang Chemical Co., Ltd., номер виробничої партії: 20130902; 0,9% розчин натрію хлориду для ін’єкцій, Chenxin Pharmaceutical Co., Ltd.; специфікація: 250мл, номер виробничої партії: 1301265303;
Хлоралгідрат, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, номер партії 20120827; mouse E2 ELISA detection kit, R&D Company, номер партії: 20140101A; mouse T ELISA detection kit, R&D Company, номер партії: 20140101A; mouse LH ELISA detection Kit, R&D Company, номер партії: 20140101A; Mouse FSH ELISA detection kit, R&D Company, номер партії: 20140101A;
Mouse DA ELISA detection kit, R&D Company, номер партії: 20140101A; Mouse 5-Набір для виявлення HT ELISA, R&D Company, номер партії: 20140101A. 1.4 Експериментальний прилад
Електронні ваги, Shanghai Minqiao Medical Instrument Co., Ltd., модель: JY601; електронні аналітичні ваги, Ohaus (Shanghai) Company, модель: AR1140/C; високошвидкісна настільна центрифуга, Shanghai Anting Scientific Instrument Factory, модель: TGL-168 ; Електрична термостатична водяна баня, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd., модель: HWS12; Тестер автономної активності миші, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., модель: ZZ-6; Вимірювач темряви миші, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., модель: BA-200; тестер хвостової підвіски, Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd., модель: TS-200; високошвидкісна охолоджувана центрифуга, Zhongjia Branch of HKUST Innovation Co., Ltd., модель: KDC-160HR; регульований інструмент для дозування, Shanghai Leibo Analytical Instrument Co., Ltd.;
Рідер для мікропланшетів, американська компанія BIO-RAD, модель: 680;
Електричний мікроскоп, японська компанія OLYMPUS, модель: BX61.
2 Експериментальні методи
2.1 Моделювання та введення ліків
Було відібрано 90 самок мишей Куньмін з масою тіла 23-25г, і 10 були випадковим чином обрані як порожня група та пройшли фіктивну операцію, а решту мишей використовували для створення перименопаузальні моделі. Після зважування мишей анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції 10% хлоралгідрату (0,03 мл/10 г) і фіксували положення на животі. Потім волосся зрізали зі спини миші під останнім ребром, на перетині середньої пахвової лінії та приблизно на 1 см від зовнішнього боку хребта, а потім надрізали після дезінфекції. Ширина шкіри та м’язів спини становить близько 0.{9}} см. В області розрізу видно молочно-білий блискучий жировик, в нього закладений яєчник. Маленьким пінцетом обережно візьміть жирову масу та витягніть її з розрізу, відокремте жирову масу, і ви побачите групу тонких неправильних жовто-червоних яєчників. При розрізанні спочатку тонкими нитками перев'язують маткові труби (включаючи жир) під яєчниками, а потім видаляють яєчники. Після операції роги матки повертають в черевну порожнину, зшивають м'язи і шкіру, таким же чином видаляють обидва яєчника. Після операції тварин обережно вирощували і внутрішньом’язово вводили пеніцилін 200,000 од/кг (по 0,1 мл) для запобігання інфекції протягом 3 днів поспіль 1 раз на добу. Через 5 днів після операції проводили дослідження вагінального мазка на кожній миші по черзі один раз на день протягом 5 днів поспіль, щоб визначити, чи повністю видалено яєчники. Мишей, які показали реакцію на тічку в мазку, викинули, а 60 повністю кастрованих мишей випадковим чином і порівну розділили на 6 груп для експериментальних цілей, а саме модельну групу, групу Mengnianan, групу ізофлавонів сої, велику, середню та групу.Низькі дози Cistanche групи фенілетанол глікозидів. Тваринам кожної групи на 10 добу після операції вводили відповідні препарати. Через 6 днів введення мишей у порожній групі вирощували по 5 особин на клітку, з нормальною їжею та водою, без будь-якої стимуляції. Усі 6 модельних груп вирощували по 1 миші в клітці та отримували різні стимуляції випадковим чином щодня. Сім факторів стресу застосовували випадковим чином протягом 18 днів: волога підстилка (1 г підстилки/1 мл води); плавання в крижаній воді (4 град., 5 хв); тепловий стрес (45 градусів, 5 хв); нічне освітлення (24 години); затискання хвоста (1 хв); водна депривація (24 год); голодування (24 години). Стимул давався випадковим чином кожен день, і кожен стимул не міг з’являтися безперервно протягом 18 днів.
Спосіб приготування: 0.5% CMC Спосіб приготування: зважте 4 г натрію карбоксиметилцелюлози та змішайте з дистильованою водою, щоб отримати 800 мл.
Дози великих, середніх і малих доз групи фенілетанол глікозидів Cistanche становили 200мг/кг, 10{{20}}мг/кг і 50мг/кг відповідно (об’єм введення 0,1 мл/10 г). Спосіб приготування: зважте відповідно 2000 мг, 1000 мг і 500 мг фенілетаноїд глікозиду Cistanche, розчиніть їх у невеликій кількості 0,5% CMC, потім доведіть об’єм до 100 мл, добре перемішайте, і все. Капсули Gengniangan (675 мг/кг, змішані з дистильованою водою до 67,5 мг/мл, 0,1 мл/10 г, еквівалентно 15-кратній клінічній дозі); Спосіб приготування: візьміть 9 капсул Gengnianan, спочатку використовуйте невелику кількість 0,5% CMC Dissolve, потім доведіть об’єм до 40 мл і добре перемішайте, щоб отримати дозу капсульної суспензії Gengnianan (675 мг/кг). М’яка капсула з ізофлавоном вітаміну Е з сої (250 мг/кг, використовуйте дистильовану воду, щоб отримати 25 мг/мл, 0,1 мл/10 г, що еквівалентно 15-кратній клінічній дозі); Спосіб приготування: Візьміть 2 м’які капсули вітаміну Е ізофлавону сої, використайте їх спочатку. Розчиніть невелику кількість 0,5% CMC, потім доведіть об’єм до 40 мл і добре перемішайте, щоб отримати дозу суспензії м’яких капсул ізофлавону сої вітаміну Е (250 мг/кг). ). Спосіб зберігання: охолоджувати, під час використання зберігати в теплі.
Спосіб введення: Тваринам кожної групи на 10 добу після операції вводили відповідні препарати. Групі Gengnian'an перорально вводили суспензію капсул Gengnian'an 675 мг·кг-1, групі ізофлавонів сої перорально вводили 250 мг·кг-1 суспензії м'яких капсул ізофлавонів сої вітаміну Е, а великі, середній імалі дози цистанхифенілетанол. Групі глікозидів перорально вводили великі, середні та малі дози фенілетанол глікозиду Cistanche 200мг·кг-1, 10мг·кг-1, 50мг·кг{{ 5}}, 0,1 мл/10 г відповідно. Групі холостого зразка та групі моделі вводили через зонд однаковий об’єм 0,5% розчину CMC один раз на день протягом 30 днів поспіль.
2.2 Об’єкти спостереження та методи виявлення
Примусове плавання: у перший день після закінчення хронічної стресової стимуляції час нерухомості мишей у кожній групі протягом 6 хвилин вимірювали протягом 2-6 хвилин. (Помістіть мишей у кожній групі в склянку об’ємом 2000 мл. Температура води становить 25 градусів. На додаток до необхідного мінімального руху, необхідного для підтримки плавання, кінцівки тварин перестають рухатися та реєструються як нерухомі. Запишіть загальний час нерухомості з 2 до 6 хвилин протягом 6 хвилин) Тест довільної активності: на другий день після закінчення хронічної стресової стимуляції вимірювали кількість спонтанних активностей мишей у кожній групі протягом 5 хвилин.
Метод уникнення темряви: на 3-й день після закінчення хронічної стресової стимуляції помістіть хвіст миші в вимірювальну коробку обличчям до невеликого отвору в темну кімнату та проведіть навчання. Через 24 години повторно виміряйте затримку миші, яка вперше ввійшла в темну кімнату, і час, потрібний для входу в темну кімнату протягом 5 хвилин. Кількість ударів електричним струмом.
Тест на підвішування хвоста: на 5-й день після закінчення хронічної стресової стимуляції вимірювали час нерухомості мишей у кожній групі протягом 6 хвилин протягом 2-6 хвилин.
Через 2 години після останньої дози (12 годин без їжі та води) мишей зважили, очні яблука витягли, відібрали кров, відокремили сироватку та визначили вміст Е2, Т, ЛГ та ФСГ у сироватці крові. вимірюваний; потім мишей вбивали шляхом вивиху шийних хребців і мишей розсікали. , видаліть тимус, селезінку та тканину матки, зважте їх вологу вагу та обчисліть індекс органу (індекс органу=волога вага органу мг/вага миші г), потім видаліть мозок, відріжте половину та підготуйте мозок гомогенат тканини. Імуноферментним методом визначали вміст моноамінових нейромедіаторів 5-HT і DA в гомогенаті тканини мозку. Тканини тимуса, селезінки, матки і головного мозку фіксували в 10% розчині формальдегіду, заливали в парафін, розрізали і фарбували ВІ. Морфологічні зміни кожної групи спостерігали під світловим мікроскопом. 2.3 Метод визначення набору
Отримайте зразки сироватки: використовуйте пробірки, які не містять пірогенів та ендотоксинів. Уникайте будь-якої стимуляції клітин під час операції. Після збору крові відцентрифугуйте її при 3000 об/хв протягом 10 хвилин, щоб швидко та обережно розділити сироватку та еритроцити. Отримайте зразки гомогенату тканини: додайте відповідну кількість фізіологічного розчину до тканини та розімніть її. Центрифугувати при 3000 об/хв протягом 10 хвилин і взяти супернатант.
Метод визначення мишачого естрадіолу (E2) ELISA такий самий, як і в експерименті 2. Концентрації стандартних продуктів (S0-55) такі: 0, 4, 8, 16, 32 і 64 пмоль/л.
Метод визначення мишачого тестостерону (T) ELISA kit такий самий, як і естрадіолу (E2). Концентрації стандартних продуктів (S0-55) такі: 0, 50, 100, 200, 400, 800 пг/мл.
Метод визначення мишачого фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) ІФА-набору такий самий, як і естрадіолу (Е2). Концентрації стандартних продуктів (S0-55) такі: 0, 5, 10, 20, 40 і 8{{30} } мМО/мл. Метод визначення мишачого (Mouse) лютеїнізуючого гормону (ЛГ) ELISA-набору такий самий, як і естрадіолу (E2). Концентрації стандарту (S0-55) становлять: 0, 0,5, 1, 2, 4 і 8 мМО/мл. Метод визначення мишачого 5-гідрокситриптаміну (5-HT) ELISA-набору такий самий, як і естрадіолу (E2). Концентрації стандартних продуктів (S0-55) складають: 0, 15, 30, 60, 120, 240 нг/мл. Метод визначення мишачого (Mouse) дофаміну (DA) ELISA-набору такий самий, як і естрадіолу (E2). Концентрації стандартних продуктів (S0-55) складають: 0, 7,5, 15, 30, 60 і 120 пг/мл.
З таблиці 21 і рисунка 25 видно, що порівняно з холостою групою час нерухомості мишей у модельній групі значно збільшився в експериментах із примусовим плаванням і підвішуванням хвоста (P<0.01), indicating that perimenopausal model mice with depression Increased levels of despair about adverse circumstances. Compared with the model group, the forced swimming immobility time and tail suspension immobility time of mice in each drug group were significantly reduced (P<0.01).
2 Вплив на автономну діяльність у мишей моделі перименопаузальної депресії
Результати тесту на автономну активність мишей у кожній експериментальній групі показані в таблиці 22 і на малюнку 26.
З таблиці 23 і малюнків 27 і 28 видно, що порівняно з холостою групою латентний період у мишей у модельній групі був значно зменшений, а кількість електричних ударів значно збільшилася (P<0.01), reflecting the decline in memory of the perimenopausal depression model mice. . Compared with the model group, the number of electric shocks received by mice in each administration group was significantly reduced (P<0.01), and the latency of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Mengnianan group, and soybean isoflavones group was significantly reduced (P<0.01). extension (P<0.01). The latent period of mice in the medium and small doses of Cistanche phenylethanoid glycoside group was significantly prolonged (P<0.05).
4 Вплив на індекс органів у мишей моделі перименопаузальної депресії
З таблиці 24 і рисунка 29 видно, що порівняно з холостою групою індекс тимуса, індекс селезінки та індекс матки в модельній групі були значно знижені (P<0.01), indicating that the perimenopausal depression mouse model had thymus, spleen, and uterus index. Shrinkage of the organization. Compared with the model group, the thymus index, spleen index, and uterine index of mice in the high-dose Cistanche phenylethanol glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group could be significantly increased (P<0.01). The medium-dose Цистанхе фенілетанол глікозидгрупа Тимусний індекс та матковий індекс мишей можуть бути значно збільшені (P<0.01), and the spleen index can be significantly increased (P<0.05).
