Експеримент 3 Вплив фенілетанол глікозиду Cistanche Deserticola на модель перименопаузи щурів Ⅲ

Експеримент 3 Вплив фенілетанол глікозиду Cistanche deserticola на модель перименопаузи у щурів

1 Експериментальні матеріали

1.1 Піддослідні тварини

Щури Wistar, клас SPF, самки, надані Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., номер сертифіката щурів для цієї партії: 0017216; лабораторний сертифікат номер SYXK (Ю) 2010-001.

1.2 Експериментальні препарати

Фенілетанол глікозид Cistanche deserticolaготували згідно з методом експерименту 1, і вміст досягав 66,47%. Gengnian'an Capsule, інгредієнти: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, кора півонії, Poria cocos, перламутр, curculigo, Schisandra chinensis, магнетит, Polygonum multiflorum vine, Uncaria, floating wheat, polygonum multiflorum . Функції та показання:Живіть Інь і приборкуйте Ян, позбавити від неприємностейі заспокоїти розум. Використовується при клімактеричних припливах і пітливості, запамороченнях, шумі у вухах, дратівливості та безсонні. Технічні характеристики: 0,3 г на капсулу. Застосування та дозування: перорально по 3 капсули за раз 3 рази на день. Виробник: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Номер виробничої партії: 121104. Номер дозволу: National Drug Approval No. Z14021848.

Соєві ізофлавони та вітамін Е в м’яких капсулах, список інгредієнтів: порошок соєвих ізофлавонів, вітамін Е, соняшникова олія, желатин, гліцерин, вода, тартразин, діоксид титану. Знакові інгредієнти та вміст: кожні 100 г містять 55,2 мг ізофлавонів сої (в перерахунку на геністеїн) і 608,5 мг вітаміну Е. Функції для здоров’я: збільшують щільність кісток. Інструкція та дозування: Приймати по 1 капсулі 2 рази на день, запиваючи теплою водою. Технічні характеристики: 500 мг × 100 капсул. Виробник: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Номер виробничої партії: 13070302. Номер дозволу: National Food Health G20080032.

СКІЛЬКИ ЧАСУ ДІЄ CISTANCHE?

1.3 Експериментальні реактиви

Карбоксиметилцелюлоза натрію, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., номер партії: 20120418; пеніцилін натрію для ін’єкцій, North China Pharmaceutical Co., Ltd., специфікація: 4 млн одиниць, номер виробничої партії: c1206807;

Розчин формальдегіду (аналітично чистий), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., номер виробничої партії: 20130902; 0,9% розчин натрію хлориду для ін’єкцій, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; специфікація: 250 мл, номер виробничої партії: 13082405B;

Хлоралгідрат, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, номер партії 20120827; Набір для виявлення щурів E2 ELISA, R&D Company, номер партії: 20140101A; Набір для виявлення щурів T ELISA, R&D Company, номер партії: 20140101A; Набір для виявлення LH ELISA у щурів, R&D Company, номер партії: 20140101A; Набір для виявлення FSH щурів ELISA, R&D Company, номер партії: 20140101A;

2 Експериментальні методи

2.1 Моделювання та адміністрування ліків

Метод моделювання: візьміть 100 самок щурів лінії Вістар з масою тіла 210~230 г, випадково виберіть 12 щурів як порожню групу та пройдіть імітаційну операцію, а решту щурів використайте для створення менопаузи моделі. Після зважування щурів анестезували шляхом внутрішньочеревної ін’єкції 10% хлоралгідрату (0,3 мл/100 г) і фіксували положення на животі. Потім щурам підстригали з-під останнього ребра на спині на перетині середньої пахвової лінії та приблизно на 2 см від латеральної сторони хребта, а потім дезінфікували. Шкіру і м’язи спини розрізають приблизно на 1 см, і в полі зору розрізу видно молочно-білу блискучу жирову масу, в яку вкладається яєчник. Маленьким пінцетом обережно візьміть жирову масу та витягніть її з розрізу, відокремте жирову масу, і ви побачите групу тонких неправильних жовто-червоних яєчників. При розрізанні спочатку тонкою ниткою перев'яжіть маткову трубу (включаючи жир) під яєчником, повністю видаліть лівий яєчник і видаліть 80% правого яєчника. Після операції роги матки повернули в черевну порожнину, зашили м'язи і шкіру, так само видалили обидва яєчника. Після операції тварин обережно вирощували та внутрішньом’язово вводили 200,000 ОД/кг пеніциліну (по 0,1 мл) для запобігання інфекції один раз на день протягом 3 днів поспіль. Через 5 днів після операції починали дослідження вагінальних мазків у щурів по черзі 1 раз на добу протягом 5 днів поспіль. Щурів з естральними реакціями в мазку відкидали. Було відібрано 72 повністю кастрованих щура, які випадковим чином розділили на 6 груп. Для експериментальних цілей це модельна група, група Gengnianan, група ізофлавонів сої та група фенілетанол глікозидів у великих, середніх і малих дозах Cistanche deserticola.

Метод приготування: Метод приготування: {{0}}.5% CMC Метод приготування: Зважте 4 г натрію карбоксиметилцелюлози та змішайте з дистильованою водою, щоб отримати 800 мл. Дози великих, середніх і малих доз групи фенілетанол глікозидів Cistanche deserticola становили 133,33 мг/кг, 66,67 мг/кг і 33,33 мг/кг відповідно (об’єм введення 1 мл/100 г). Спосіб приготування: зважте відповідно 1333,3 мг, 666,7 мг і 333,3 мг загальних флавоноїдів малини, розчиніть їх у невеликій кількості 0,5% CMC, потім доведіть об’єм до 100 мл, добре перемішайте, і все. Капсули Gengniangan (450 мг/кг, змішані з дистильованою водою до 45 мг/мл, 1 мл/100 г, еквівалентно 10-кратній клінічній дозі); Спосіб приготування: Візьміть 15 капсул Gengnianan, спочатку розчиніть їх у невеликій кількості 0,5% CMC, потім доведіть об’єм до 100 мл і добре перемішайте, що є дозою капсульної суспензії Gengnianan (450 мг/кг). М’які капсули з ізофлавоном вітаміну Е з сої (166,67 мг/кг, використовуйте дистильовану воду, щоб отримати 16,67 мг/мл, 1 мл/100 г, що еквівалентно 10-кратній клінічній дозі); Спосіб приготування: візьміть 4 м’які капсули вітаміну Е ізофлавонів сої, спочатку розчиніть у невеликій кількості 0,5% CMC, потім доведіть об’єм до 120 мл і добре перемішайте, щоб отримати дозу суспензії м’яких капсул ізофлавонів сої вітаміну Е (16,67 мг/кг). ).

Спосіб введення: Тваринам кожної групи вводили відповідні препарати на 10-й день після операції. Порожній групі та групі моделі вводили через зонд однаковий об’єм 0,5% розчину CMC (об’єм через зонд становив 1 мл/100 г), а групі Gengnianan — капсульну суспензію Gengnianan (450 мг/кг, що еквівалентно 10-кратній клінічній дозі). ). ), групі ізофлавонів сої перорально вводили суспензію м’яких капсул вітаміну Е ізофлавонів сої (166,67 мг/кг, що еквівалентно 10-кратній клінічній дозі), а також великі, середні та малі дозиФенілетанол глікозид Cistanche deserticolaгрупам вводили перорально відповідно до групи. Великі, середні та малі дози глікозиду фенілетанолу Cistanche deserticola (дозування 133,33 мг/кг, 66,67 мг/кг та 33,33 мг/кг відповідно, об’єм дози 1 мл/100 г), що вводяться 1 раз на добу шляхом внутрішньошлункового введення безперервно. . ліки протягом 30 днів.

2.2 Об’єкти спостереження та методи виявлення

Оцінки горизонтально-вертикального руху щурів у кожній групі вимірювали через 29 днів після введення. Через 2 години після останнього введення в шлунок (натщесерце протягом 15 годин) видаліть очні яблука, щоб взяти кров, відокремити сироватку таплазма, вимірюють вміст Е2, Т, ЛГ, ФСГ, ГнРГ, БГП у сироватці крові та вміст -ЕП у плазмі; щурів розсікли. Видаліть тимус, селезінку, матку та решту 20% тканини яєчника, зважте їх вологу вагу та обчисліть індекс органу тимуса, селезінки та матки (індекс органу=волога вага органу мг/маса щура г) , а потім видаляють мозок. Для гіпоталамуса та гіпофіза гомогенати тканини готували з гіпоталамуса, гіпофіза та 1/2 матки, а вміст рецепторів естрогену в гомогенатах тканини гіпоталамуса, гіпофіза та матки та андрогену визначали вміст рецепторів у гомогенатах тканини гіпоталамуса. Тимус, селезінку, матку і яєчник фіксували в 10% розчині формальдегіду, заливали в парафін, розрізали і фарбували ВІ. Theгістоморфологічні зміниу кожній групі спостерігали під світловим мікроскопом.

2.2.1 Випробування методом відкритого поля

Експериментальний пристрій являє собою кубічний відкритий ящик висотою 40 см, довжиною і шириною 80 см. Навколишні стінки та дно чорні. Нижня частина складається з 25 блоків однакової площі, розділених білими лініями. Під час експерименту щура поміщали в квадрат у центрі відкритої коробки, і оцінка горизонтальної активності кількості блоків, які щур перетнув на дні протягом 5 хвилин (можна підрахувати квадрати з усіма чотирма лапами), і кількість разів, коли задні кінцівки стояли вертикально (дві передні лапи були в повітрі). (або чіпляючись за стіну) оцінка вертикальної активності. Фекалії повинні бути повністю видалені після кожного експерименту, і кожного щура вимірюють один раз через 2 години після введення. Цей експеримент проводився в тихій кімнаті.

2.2.2 Метод визначення набору

Отримайте зразки сироватки: використовуйте пробірки, які не містять пірогенів та ендотоксинів. Уникайте будь-якої стимуляції клітин під час операції. Після збору крові відцентрифугуйте її при 3000 об/хв протягом 10 хвилин, щоб швидко та обережно розділити сироватку та еритроцити. Отримайте зразки плазми: антикоагулянтні пробірки з гепарином. Центрифугувати при 3000 об/хв протягом 30 хвилин і взяти супернатант. Отримайте зразки гомогенату тканини: додайте відповідну кількість фізіологічного розчину до тканини та розімніть її. Центрифугувати при 3000 об/хв протягом 10 хвилин і взяти супернатант.

Метод визначення естрадіолу щурів (E2) ELISA такий самий, як і в експерименті 2. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 4, 8, 16, 32 і 64 пмоль/л.

Метод аналізу щурів тестостерону (T) ELISA Kit такий самий, як метод аналізу естрадіолу ELISA Kit. Концентрації стандартів (S{{0}}S5) становлять {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 і 320 пг /мл. Метод визначення в наборі для визначення лютеїнізуючого гормону (ЛГ) щурів (ЛГ) ELISA такий самий, як метод визначення в наборі для визначення естрадіолу ELISA. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 3, 6, 12, 24 і 48 мл/мл. Метод аналізу фолікулостимулюючого гормону щурів (ФСГ) ELISA-набору такий самий, як і метод ELISA-набору естрадіолу. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 0,75, 1,5, 3, 6 і 12 МО/л. Метод визначення набору для визначення ELISA гонадотропін-рилізинг-гормону (GnRH) у щурів такий самий, як і метод визначення набору для визначення естрадіолу ELISA. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 5, 10, 20, 40 і 80 мл ОД/мл.

Метод визначення щурів (Rat) остеокальцину (BGP/OCN) ELISA-набору такий самий, як і метод визначення естрадіолу ELISA-набору. Концентрації стандартів (S{{0}}S5) становлять 0, 0.75, 1,5, 3, 6 і 12 нг/мл. Метод визначення щура (Rat) -ендорфіну (-EP) ELISA-набору такий самий, як метод визначення естрадіолу ELISA-набору. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 3, 6, 12, 24 і 48 пг/мл. Метод визначення набору для визначення ELISA рецептора естрогену (ER) у щурів такий самий, як і метод визначення набору для визначення естрадіолу ELISA. Концентрації стандартів (S{{20}}S5) становлять 0, 4, 8, 16, 32 і 64 пг/мл. Метод визначення щурів (Rat) андрогенного рецептора (AR) ELISA-набору такий самий, як метод визначення естрадіолу ELISA-набору. Концентрації стандартів (S0-S5) становлять 0, 25, 50, 100, 200 і 400 пг/мл.

2.3 Методи статистичної обробки

Для аналізу даних використовувався медичний статистичний пакет SPSS17.0 для статистичної обробки даних. Дані вимірювань виражали як середнє ± стандартне відхилення (-x±s). Для порівняння між групами використовували односторонній дисперсійний аналіз. Для перевірки однорідності дисперсій використовувався метод LSD. , тест Games-Howell використовувався для нерівномірних дисперсій, а тест Ridit використовувався для даних оцінки.

З таблиці 11 і рисунка 14 видно, що порівняно з холостою групою індекс тимуса, індекс селезінки та індекс матки щурів у модельній групі були значно знижені (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Вплив на рівні біохімічного індексу крові у модельних щурів у перименопаузі

Вміст E2, T, LH, FSH, GnRH і BGP у сироватці крові та вміст -EP у плазмі крові щурів у кожній групі наведено в таблицях 12-13 і малюнках 15-17.

З таблиць 12-13 і малюнків 15-18 видно, що порівняно з холостою групою сироваткові рівні Е2 і Т у щурів у модельній групі були значно знижені (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Таблиця 14. Вплив глікозиду фенілетанолу Cistanche deserticola на рівень GnRH у сироватці крові та рівні -EP у щурах у перименопаузі (-x±s)

З таблиці 14 і малюнків 19-20 можна побачити, що порівняно з холостою групою рівень GnRH у сироватці щурів у модельній групі значно підвищився, а рівень -EP у плазмі значно знизився (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Вплив на вміст ER та AR у тканинах модельних щурів у перименопаузі

Вміст ER і AR у відповідних тканинах щурів у кожній групі показано в таблицях 16-17 і малюнках 22-23.

З таблиці 17 і рисунка 23 видно, що порівняно з холостою групою рівень АР в гіпоталамусі модельної групи був значно нижчим (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5. Вплив на морфологію тканини органів у модельних щурів у перименопаузі

Результати патолого-гістологічного дослідження матки, тимуса та селезінки щурів кожної дослідної групи є наступними. Патологічні фотографії наведені в Додатку 1 для патологічних фотографій модельних щурів у перименопаузі.

5.1 Вплив на морфологію тканини матки у модельних щурів у перименопаузі

Відповідно до різного ступеня змін в ендометрії, залозах і міометрії щурів у кожній експериментальній групі використовували напівкількісні стандарти для розділення патологічної морфології тканини на чотири рівні, а матки щурів у кожній дослідній групі проводили за допомогою напівкількісних стандартів. вимірюваний. Результати спостереження наведено в таблиці 18.

"-" Епітеліальні клітини ендометрію, залози, міометрій і серозна оболонка в нормі; «+» ендометріальні епітеліальні клітини і залози атрофовані, а міометрій і серозна оболонка нормальні; "++" ендометріальний епітелій Клітини та залози частково атрофовані, м'язовий шар незначно атрофований, серозна оболонка нормальна; «+++» епітеліальні клітини та залози ендометрію значно атрофовані, а серозна оболонка нормальна.

Після тесту Ridit з таблиці 18 видно, що порівняно з холостою групою матка щурів у модельній групі показала значні патологічні ураження тканин (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Вплив на морфологію тканини яєчників у модельних щурів у перименопаузі

Відповідно до різного ступеня змін фолікулів, жовтого тіла, гранульозних клітин і кровоносних судин яєчників щурів у кожній групі дослідів використовували напівкількісні еталони, які розділяли патологічну морфологію тканини на чотири рівні. Яєчники щурів у кожній групі дослідів вимірювали та спостерігали. Результати наведено в таблиці 19.

Таблиця 19 Вплив фенілетанол глікозиду Cistanche deserticola на патологічні зміни яєчників у модельних щурів у перименопаузі Одиниця: тільки

«-» може показувати зростаючі фолікули, зрілі фолікули та жовте тіло на всіх рівнях. Жовте тіло добре розвинене, з багатьма шарами гранульозних клітин, багатою фолікулярною рідиною та багатими кровоносними судинами; «+» може показувати зростаючі фолікули, зрілі фолікули та жовте тіло, але кількість зрілих фолікулів і жовтого тіла невелика. фолікули менші, а гранульозні клітини менш шаруваті; «++» може показувати зрілі фолікули та жовте тіло з більшою кількістю жовтого тіла, меншою кількістю гранульозних клітин і меншою кількістю кровоносних судин; "+++" не має фолікулів, більше жовтого тіла, а яєчник атрофічний, безсудинний.

Після тесту Ridit з таблиці 19 видно, що порівняно з холостою групою яєчники щурів модельної групи показали значні патологічні ураження тканин (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Вплив на морфологію тканини тимуса та селезінки у модельних щурів у перименопаузі

За допомогою мікрометра виміряйте товщину найтовстіших і найвужчих частин кори тимуса кожного щура в кожній експериментальній групі, щоб отримати середнє значення; використовуйте базову лінію мікрометра, щоб потрапити на селезінкові вузлики, виміряйте товщину селезінкових вузликів з обох сторін з центральною артерією як центром і обчисліть середнє значення. Результати вимірювань наведено в таблиці 20 і на малюнку 24.

З таблиці 20 і рисунка 24 видно, що порівняно з контрольною групою товщина кори тимуса та об’єм селезінкових вузликів у модельній групі були значно зменшені (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).