Естрогенна активність глікозидів з Cistanche deserticola як ад'ювант рецепторів естрогену in vitro
Mar 05, 2022
Контактна особа: Одрі Ху Ватсапп/к.с.: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Хуей Сон, Вень-Лань Лі , Сян-Мін Сун , Ян Ху , Цзін-Сінь Дін, Ю-Бін Цзі, Цзін-Я Ван
ВВЕДЕННЯ
Cistanche deserticola(«Rou Cong Rong» китайською мовою), традиційне китайське ліки від трав, яке вперше було зафіксовано в ShenNongBenCaoJing, протягом тисячоліть використовується для лікування дефіциту нирок, імпотенції, старечих запорів і дефіциту крові. [1] В основному поширений в пустельних районах Північно-Західного Китаю, таких як Ганьсу і Сіньцзян. [2] Сучасні дослідження фармакології показали, що C. deserticola може просувати широкі лікарські функції, такі як регуляція гормонів, імуномодулююча, антиоксидантна, нейропротекторна, протизапальна та естрогенна активність. [3,4] Глікозиди cistanches (GCs) розглядалися як один з основних активних компонентів з різними біологічними ефектами. [5,6]
Рецептори естрогену-α (ERs-α) і ERβ є підтипами ЕРс, які могли б регулювати фізіологічні функції. [7] Ці білки можуть регулювати транскрипцію генів-мішеней шляхом зв'язування з пов'язаними регуляторними послідовностями ДНК в ядрі клітини. Обидва підтипи помітно виражені в серцево-судинній і центральній нервовій системах. [8,9] ERα існує в основному в молочній залозі, матці, яєчнику, кістці, чоловічому репродуктивному органі та простаті. ERβ присутній в основному в простаті, яєчниках і сечовому міхурі. [10,11] Крім того, існують деякі загальні фізіологічні ролі для двох підтипів, такі як у розвитку та функції яєчників та в захисті серцево-судинної системи. [12,13] Попередні дослідження в нашій групі виявили естрогеноподібний механізм ГК методом метаболомічного аналізу. [14] У безперервному дослідженні ми проаналізували механізм естрогенної активності ГК на клітинних лініях MCF-7, пов'язаних з ЕРс.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Інструменти
Інкубатор ECO-170P-230 був з New Brunswick Scientific (Китай) Co., Ltd., зчитувач мікропластин Bio-Rad 680, а апарат електрофорезу - від Bio-Rad Laboratories, Inc., мікроскоп CX21 був з Olympus Co., Ltd., GIS-2019 гель-система візуалізації була від Tanon Science and Technology Co., Ltd., плоска нижня пластина - від Corning Inc., проточна цитометрія EPICS-XL - з Beckman-Coulter Inc., і StepOnePlus Система полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в реальному часі була з Thermo Fisher Scientific.
Хімічні речовини та реактиви
ГК були підготовлені в нашій лабораторії, як повідомляв раніше метод[14], а чистота ГК була визначена в 52% (актеозид використовувався як маркер для визначення ГК) за допомогою ультрафіолетової спектрофотометрії. Естрадіол (Е2) був придбаний у компанії Yuanye Biotechnology Co., Ltd.(Шанхай, Китай). Фетальна бичача сироватка (FBS) і RPMI-1640 були від Gibco Co., Ltd., 96-лункова плоска нижня пластина була у Corning Inc., а диметилсульфоксид (DMSO) і 3-[4,5-диметил-2-тіазоліл]-2,5-дифенілтетразолій бромід (MTT) були придбані у корпорації Sigma-Aldrich. Реагент TRIzol, набір зворотної транскрипції (RT) та tb Green™ RT-PCR Kit були придбані у taKaRa Co., Ltd., Далянь, Китай. Anti-ERα Rabbit pAb, anti-ERβ Rabbit pAb і антитіла β-актину були придбані у Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Всі інші поширені хімічні речовини були придбані у стандартних комерційних постачальників.
підготовка зразків
Приготування глікозидів маточного розчину «Сістанчес»
Екстракт ГК розчинили в ДМСО для приготування маточного розчину з концентрацією 0,1051 г/мл і зберігали при 4°С. Фенол безредметний РПМІ-1640 перед застосуванням використовувався для розрідження маточного розчину в різних концентраціях.
Приготування маточного розчину естрадіолу
Екстракт Е2 розчинили в ДМСО для приготування маточного розчину концентрацією 0,27 мг/мл і зберігали при температурі 4°С. Фенол безредметний РПМІ-1640 перед застосуванням використовувався для розрідження маточного розчину в різних концентраціях.
Приготування деревного вугілля декстрану, обробленого сироваткою плодового великого рогатої худоби
Сотні мілілітрів ФБС змішували з 250 мг порошку активованого вугілля і 25 мг декстрану. Після інкубації протягом 45 хв при температурі 55°C суміш центрифугували при температурі 4°C, 1000 об/хв. Супернатант фільтрувався за допомогою мембрани Millipore Express PES для отримання обробленого вугіллям (CDT)-FBS і зберігався при −20 °C.
Культура клітини
Клітинні лінії раку молочної залози людини MCF-7 були отримані з колекції культури американського типу (ATCC). Крім того, клітини культивувалися середовищем RPMI-1640, що містить 10% FBS і 1% пеніцилін-стрептоміцин при 37 °C під зволоженою 5% атмосферою CO2. Клітини культивувалися в середовищі фенолу без червоного кольору RPMI-1640, що містить 5% CDT-FBS за 4 дні до МТТ-аналізу, щоб естроген в клітинах був очищений.
Аналіз проліферації клітин естрадіолу на клітинних лініях MCF-7
Проліферація клітин вимірювалася за допомогою аналізу MTT для клітин MCF-7. [15,16] Е2 був розпущений в культуральних середовищах РПМІ-1640, що містять 0,1% ДМСО при кінцевих концентраціях 0,1, 1, 10, 100 і 1000 нМ. Клітинні лінії MCF-7 культивувалися в середовищі фенолу без червоного кольору RPMI-1640 протягом 4 днів. Після промивання фосфатно-буферним фізіологічним розчином (ПБС) тричі в 96-лункові пластини по 1,5 × 104 на лунку додавали 100 мкл середовища без FBS РПМІ-1640 і інкубували при 37°С протягом 24 год. Згодом клітини оброблялися різними концентраціями розчину Е2 протягом 72 год. Потім в кожну лунку додавали 100 мкл розчину МТТ (0,5 мг/мл). Клітини інкубували по 4 год. Нарешті, було додано 150 мкл DMSO для розчинення кристалів формазану. Поглинання вимірювалося в 570 нм мікропластинним зчитувачем, і розраховувалася швидкість поширення (ПР).
Аналіз проліферації клітин глікозидів Сістанчів на клітинних лініях MCF-7
Проліферація клітин вимірювалася за допомогою аналізу MTT для клітин MCF-7. ГК були розчинені в культуральних середовищах РПМІ-1640, що містять 0,1% ДМСО при кінцевих концентраціях 0,0175, 0,175, 1,75, 17,5 і 175 мкг/мл. Клітинні лінії MCF-7 культивувалися в фенолі безредневого середовища РПМІ-1640, що містить 5% CDT-FBS протягом 4 днів. Після промивання ПБС тричі в 96-лункові пластини по 1,5 × 104 на свердловину по 1,5 × 104 на свердловину додавали 100 мкл середовища без FBS RPMI-1640 і інкубували при температурі 37°C протягом 24 год. Згодом клітини оброблялися різними концентраціями розчину ГК по 24, 48 і 72 год відповідно. Потім в кожну лунку додавали 100 мкл розчину МТТ (0,5 мг/мл). Клітини інкубували по 4 год. Нарешті, було додано 150 мкл DMSO для розчинення кристалів формазану. Поглинання вимірювалося в 570 нм мікропластинним зчитувачем, і був розрахований ПР. Фенол червоний-вільний РПМІ-1640 і середній, що містить Е2 (2,725 × 10−3 мкг/мл), були негативною і позитивною групами відповідно.
Аналіз проліферації клітин глікозидів сістантів з фульвестрантом на клітинних лініях МКФ-7
Проліферація клітин вимірювалася за допомогою аналізу MTT для клітин MCF-7. ГК були розчинені в культуральних середовищах РПМІ-1640, що містять 0,1% ДМСО при кінцевих концентраціях 1,75, 17,5 і 175 мкг/мл. Клітинні лінії MCF-7 культивувалися в феноловому безредневому середовищі RPMI-1640, що містить 5% CDT-FBS протягом 4 днів. Після промивання ПБС тричі в 96-лункові пластини по 1,5 × 104 на свердловину по 1,5 × 104 на свердловину додавали 100 мкл середовища без FBS RPMI-1640 і інкубували при температурі 37°C протягом 24 год. Згодом клітини обробляли різними концентраціями розчину ГК і інкубували фульвестрантом (6,06 × 10−5 мкг/мл) протягом 48 год. Потім в кожну лунку додавали 100 мкл розчину МТТ (0,5 мг/мл). Клітини інкубували по 4 год. Нарешті, було додано 150 мкл DMSO для розчинення кристалів формазану. Поглинання вимірювалося в 570 нм мікропластинним зчитувачем, і був розрахований ПР. Фенол безредневий РПМІ-1640 і середовище, що містить Е2 (2,725 × 10−3 мкг/мл), були негативною і позитивною групами відповідно.
Аналіз клітинного циклу
ГК були розчинені в культуральних середовищах РПМІ-1640, що містять 0,1% ДМСО при кінцевих концентраціях 1,75, 17,5 і 175 мкг/мл. МКФ-7-клітинні лінії культивувалися в фенолі безредневого середовища РПМІ-1640, що містить 5% CDT-FBS протягом 4 днів. Після промивання ПБС тричі 1 мл середовища RPMI-1640 без FBS додавали в 6-лункові пластини по 2,5 × 105 на свердловину і інкубували при 37°C протягом 24 год. Згодом клітини обробляли різними концентраціями розчину ГК і інкубували фульвестрантом (6,06 × 10−5 мкг/мл) протягом 48 год. Згодом клітини збирали і промивали ПБС тричі, центрифугували при температурі 4°C, 1000 об/хв протягом 10 хв і фіксували 70% етанолом при −20°C, протягом ночі. Після промивання ПБС двічі клітини фарбували розчином ПІ (50 мг/мл), що містив 1 мг/мл RNase A і 0,1% тритона Х-100 протягом 30 хв у темряві при 4°С. Клітинний цикл був виявлений за допомогою проточної цитометрії, а індекс проліферації (PI) розраховувався наступним чином. Фенол червоний-вільний РПМІ-1640 і середній, що містить Е2 (2,725 × 10−3 мкг/мл), були негативною і позитивною групами відповідно. PI = (S + G2 M)/(G0 /G1 + S + G2 M) × 100%
Виділення РНК та аналіз кількісної полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу
Для вимірювання рівня мРНК був використаний ЗТ-кількісний ПЛР (qPCR) аналіз. Загальна клітинна РНК була витягнута за допомогою реактиву TRIzol. Для qPCR РНК була зворотно транскрибована в cDNA з 4 мкг загальної РНК за допомогою комплекту RT. ЗТ-ПЛР-аналізи проводилися з використанням tb Green™ RT-PCR Kit. Всі протоколи виконувалися згідно з інструкцією виробника. Пара праймерів, яка використовувалася для посилення ERα, була 5'-GGGAAGTATGGCTATGGATGGAATCTG-3' (передня) і 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (реверс); пара праймерів, яка використовувалася для посилення ERβ, була 5'-AGTGCCGCTTGGAGAGCTG-3' (вперед) і 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (реверс). Умови ПЛР для ERα та ERβ становили 94°C протягом 3 хв, а потім 37 та 40 циклів відповідно 94°C протягом 30 с, 58°C протягом 2 хв та 72°C протягом 2 хв. Пара праймерів, яка використовувалася для посилення GAPDH, була 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (вперед) і 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCTGG-3' (реверс). Умови ПЛР для GAPDH становили 94°C протягом 3 хв, а потім 30 циклів 94°C протягом 30 с, 58°C протягом 2 хв і 72°C протягом 2 хв. Кожен раз експеримент RT-qPCR повторювався більше двох разів. Для цього в якості внутрішнього контролю використовувався ГАПДГ. Розраховано відносну експресію генів ERα/ERβ трансфектантів по відношенню до контрольних клітин: 2−(∆∆Ct).
Західний блатінг
Експресія білків ERα і ERβ була виявлена за допомогою західного блотового аналізу як зареєстрованого методу з незначними модифікаціями. Коротко клітини МКФ-7 вирощували в 6-лункових пластинах по 2,5 × 105 клітин на лунку і обробляли ГК в кінцевій концентрації 1,75, 17,5 і 175 мкг/мл по 48 год відповідно. Після інкубації цільноклітинні витяжки готували з використанням буфера RIPA, що містить 1 мМ ПМСФ. Білки в екстрактах цільноклітинних клітин були розділені 12% додецилсульфат-поліакриламідним гель-електрофорезом натрію, а потім перенесені в полівінілідендифторидні мембрани. Мембрана була заблокована 5% (ж/в) знежиреним молоком, розчиненим в буфері TBST і інкубованим первинними і вторинними антитілами в свою чергу. Спостерігалися зв'язані антитіла.
Статистичний аналіз
Результати були виражені як засоби і стандартні відхилення, а статистична значимість була виконана з використанням т-тесту Студента з програмним забезпеченням SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was="" considered="" statistically="">
РЕЗУЛЬТАТІВ
Після 24 год лікування Е2 проліферація клітин МКФ-7, очевидно, була посилена [рис. 1а]. 10 нМ розчину Е2, очевидно, могли б стимулювати ріст клітин (123,89%). Однак зі збільшенням концентрації Е2 здатність до проліферації клітин слабшала. Отже, 10 нМ була оптимальною концентрацією Е2 в цьому експерименті.
Група ГК при концентраціях 1,75, 17,5 і 175 мкг/мг могла б посилити проліферацію клітинних ліній МКФ-7 з часом і залежним від дозування способом і виявила значну різницю з негативною групою [Рис. 1б]. У порівнянні з негативною групою група Е2 демонструвала явне поширення (120,06%).
Об'єднана лікарська група (ЦМГ) (фульвестрант з Е2 або ГК) в середовищі CDT-FBS інкубувалися клітинами MCF-4. Після 72 год інкубації ЦМГ може призвести до схильності до піару в порівнянні з індивідуальною групою ліків (IMG) (P< 0.01)="" [figure="">
Аналіз проточної цитометрії показав, що ГК може дещо збільшити значення PI, що свідчить про те, що ГК можуть просунути фазові клітини G0/G1 до фаз S та G2/M [рисунок 2 та таблиця 1] та сприяти синтезу ДНК клітин. Результат, який вказує на те, що механізм ГК на МКФ-7 був аналогічний механізму Е2. У CMG (фульвестрант з GCs) значення PI клітини PI було знижено до значення IMG незначно (P<>
ЗТ-ПЛР-аналіз показав, що вирази ERα і ERβ мРНК були збільшені в порівнянні з контрольною групою (P< 0.01)="" in="" a="" dose‑dependent="" manner="" after="" being="" treated="" by="" different="" concentrations="" of="" gcs="" for="" 48="" h="" [figure="" 3a="" and="">
Вестерн-блот результат, який вказує на те, що після лікування різними концентраціями ГК протягом 48 год вміст білків ERα і ERβ в МЦФ-7 збільшується разом з ГК збільшується як дозельно-залежний спосіб [Рис. 3с-е]
ВИСНОВОК
У цьому дослідженні вплив ГК на проліферацію і клітинний цикл МКФ-7 було проведено аналіз методом МТТ і проточної цитометрії відповідно. ГК можуть збільшити проліферацію клітин MCF-7 при концентрації 1,75, 17,5 і 175 мкг/мл після інкубації протягом 72 год. Однак збільшення, як правило, сповільнюється, коли ОТГ та фульвестрант використовувалися разом. ГК могли б збільшити значення PI клітин MCF-7, зменшити комірку фази G1 і збільшити комірку фаз S і G2.
Фульвестрант є ЕР-специфічним антагоністом, який блокує ядерну локалізацію ЕР шляхом порушення димеризації рецепторів і енергозалежного ядерного транспорту. [17] У цьому дослідженні висновок підтвердив, що фульвестрант може послабити проліферацію ГК на клітинах MCF-7, і це може вплинути на трансформацію клітинного циклу. Отже, це дослідження показало естрогенну активність ГК, а також, ЕР є мішенню ГК. В експерименті RT-PCR і western blot мРНК і білкові експресії ERα і ERβ в клітинах MCF-7 збільшувалися з підвищенням концентрації ГК. Отже, ГК можуть відігравати певну роль у естрогенній активності відповідно до регульованої мРНК та білків ERα та ERβ.
