Посилення біосинтезу фенілетаноїдних глікозидів у культурах клітин Cistanche Deserticola шляхом осмотичного стресу

Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Чунь-Чжао Лю. Сі-Ю Ченг

АнотаціяВплив осмотичного стресу на ріст клітин і біосинтез фенілетаноїдних глікозидів (PeG) досліджували на суспензійних культурах клітинCistanche deserticolaYC Ma, пустельна лікарська рослина, вирощена в західному регіоні Китаю. Різні початкові концентрації сахарози суттєво впливали на ріст клітин і біосинтез PeGs у суспензійних культурах, а найвища суха маса та накопичення PeGs досягали 15,9 г–1-DW та 20,7 мг g–1-DW відповідно на початковому осмотичному рівні. стрес 300 мОсм кг–1, де концентрація сахарози становила 175,3 мМ. Стехіометричний аналіз з різними комбінаціями сахарози та неметаболічного цукру (маніту) або нецукрових осмотичних агентів (ПЕГ і NaCl) показав, що осмотичний стрес сам по собі є важливим фактором для посилення біосинтезу ПеГ у суспензійних культурах клітинCistanche deserticola. Максимальний вміст PeGs 26,9 та 23,8 мг g–1-DW було отримано через 21 день при комбінаціях 87,6 мМ сахарози з 164,7 мМ маніту (303 мОсм кг–1) або 20 мМ PEG відповідно, що було вище, ніж культур клітин C. deserticola, вирощених при початковій концентрації сахарози 175,3 мМ через 30 днів. Стимульоване накопичення PeGs у суспензійних культурах клітин корелювало зі збільшенням активності фенілаланін-амоній-ліази (PAL), індукованої осмотичним стресом.

Ключові слова Cistanche deserticola, Пустельна лікарська рослина, Фенілетаноїдні глікозиди, Осмотичний стрес, Фенілаланін-аміак-ліаза

Цистанхеtubulosaмає багато ефектів, натисніть тут, щоб дізнатися більше

вступ

Cistanche deserticolaYC Ma, дорогоцінна китайська трава, паразитує на коренях Haloxylon ammodendrun і росте в пустельних районах західного Китаю. Фенілетаноїдні глікозиди (PeG), основні біологічно активні компоненти, виділені з C. deserticola, виявляють помітну активність у поглинанні вільних радикалів, посиленні імунітету, покращенні сексуальної функції тощо (Zong та ін., 1996; Lu, 1998; Wang та ін., 2001). Внаслідок неконтрольованої експлуатації та утилізаціїCistanche deserticola, природний ресурс сCistanche deserticola була на межі виснаження. З огляду на ці проблеми, виробництво PeGs суспензійними культурами клітин C. deserticola розглядається як багатообіцяюча альтернатива для вирішення проблеми дефіцитуCistanche deserticolaрослинні матеріали (Lu and Mei 2003; Ouyang et al. 2003; Cheng et al. 2005a).

Осмотичний стрес є важливим фактором, що впливає на ріст, розвиток, морфогенез і утворення вторинних метаболітів рослин. Повідомлялося про посилене виробництво вторинних метаболітів із культур тканин in vitro за оптимального осмотичного стресу у кількох видів лікарських рослин (Kim та ін. 2001; Wang та ін. 1999; Wu та ін. 2005). Сахароза є звичайним агентом осмотичного стресу, який використовується в цих випадках, а також служить життєво важливим джерелом вуглецю та енергії. Тому дуже важко відокремити вплив осмотичного стресу та поживну роль цукру як джерела вуглецю. Підвищення початкового осмотичного стресу за допомогою неметаболічного маніту, сорбіту та ПЕГ також покращувало накопичення паклітакселу в культурах клітин Taxus Chinensis, накопичення сапоніну та полісахаридів у культурах клітин Panax notoginseng та накопичення елеутерозидів у ембріогенних культурах Eleutherococcus sessiliflorus (Zhang et al. 1995; Kim). та ін., 2001; Shohael та ін., 2006). Їхні результати показали, що ефекти концентрації вуглеводів і осмотичного стресу були різними залежно від виду рослин і вторинних метаболітів.

Мета цього дослідження зосереджена на осмотичному впливі сахарози, маніту, PEG і NaCl на ріст клітин і біосинтез PeGs вCistanche deserticolaклітинні суспензійні культури. Активність PAL у суспензійних культурах досліджували за різних комбінацій початкових осмотичних агентів, а також обговорювали можливий механізм покращення накопичення PeG за рахунок підвищення осмотичного стресу.

Матеріали та методи

Рослинна сировина та індукція калюсу

НасінняCistanche deserticolaYC Ma були зібрані в пустельних районах китайської провінції Сіньцзян і зберігаються в 4C перед використанням. Ботанічна ідентичність була підтверджена порівнянням з еталонними стандартами в Інституті ботаніки Китайської академії наук, КНР. Насіння поверхнево стерилізували шляхом занурення в 70% етанол на 30 с, потім занурювали в 20% водний розчин 5,4% гіпохлориту натрію у воді на 20 хв, після чого тричі промивали стерильною дистильованою водою. Каллуси були індуковані з поверхнево стерилізованого насінняCistanche deserticolaна середовищі MS (Murashige and Skoog 1962) з додаванням 1.0 мг л–1 нафталіноцтової кислоти (NAA), 2.0 мг л–1 6-бензиладеніну ({{7} }BA), 0.25 мг л–1 2, 4-дихлорфеноксіоцтова кислота (2, 4-D), 6 гл–1 агар (PhytoTechnology LaboratoriesTM, ID продукту: A181) і 30 г/л сахарози протягом 60 днів у шафі для вирощування в темряві при 25 °C. Культури калюсу, індуковані з експлантів насіння, згодом субкультивували у вищевказане тверде середовище з інтервалом у 30 днів (Cheng et al. 2005a).

Створення та підтримка клітинних суспензійних культур

Суспензійні калюсні культури (3.0 г свіжої ваги), які були відфільтровані через сито з вічками 1,000 лм і витримані на ситі з вічками 200 лм, пересівали в 500- мл Ерленмейєра колбу, що містить 100 мл вищезазначеного рідкого середовища, на ротаційному шейкері при 110 об/хв при 25°C у темряві з інтервалом субкультивації 18 днів. Перед автоклавуванням рН середовища доводили до 5,8 за допомогою 1 М NaOH або 1 М HCl. Суспензійні калюсні культури, пересіяні після десяти разів, використовували як інокулят для наступної експериментальної культури в колбі. Усі експерименти в колбах проводили в колбах Ерленмейєра об’ємом 250 мл, що містили 50 мл рідкого середовища з 30 г–1 сахарози та інокульували 1,5 г свіжої ваги 18-денних суспензійних культур клітин. Ці колби Ерленмейєра інкубували на ротаційному шейкері (110 об/хв) при 25°C у темряві.

Експеримент з осмотичним стресом

Дослідити вплив початкової концентрації сахарози наріст клітин і накопичення PeGs,Cistanche deserticolaсуспензійні культури культивували в середовищі MS з 87,6,175,3 і 262,9 мМ сахарози. Для умов осмотичного стресу,Cistanche deserticolaсуспензійні культури інкубували в MSсередовище, що містить 87,6 мМ сахарози в поєднанні з164,7 мМ маніту. Інші осмотичні агенти (ПЕГ 4, 000 іNaCl) додавали в еквіваленті осмолярності87,6 мМ сахарози. Осмотичні еквівалентні концентраціїосмотичних агентів експериментально визначали як ПЕГ4,000 20 мМ і NaCl 50 мМ відповідно. У всіх експериментах і всіх значеннях використовували потрійні колбибули середні значення трьох повторних колб ± SD.

Аналіз

Cistanche deserticolaкультивовані клітини під різним осмотичним стресом спостерігали за допомогою світлового мікроскопа Nikon AFX-DX (Nikon, Японія) при збільшенні 400·. Осмолярність культурального середовища вимірювали за допомогою осмометра тиску пари (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). Для визначення свіжої ваги (FW)Cistanche deserticolaклітини обережно пресували на фільтрувальний папір для видалення надлишку води та зважували. Згодом клітини сушили в печі при 60°C протягом 24 годин і реєстрували суху вагу (DW). Концентрацію залишкового цукру визначали за допомогою фенолу та концентрованої сірчаної кислоти, використовуючи глюкозу як стандарт (Dubois et al. 1956).

ПЕГ екстрагували з висушених клітин метанолом протягом 15 хв при 60°С на ультразвуковій водяній бані (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Китай) з частотою 40 кГц і потужністю 100 Вт. Фільтрат концентрували. і залишок розчиняли в дистильованій воді, а потім пропускали через колонку з макроретикулярною смолою (AB-8, хімічний продукт Університету Нанкай, Тяньцзінь, Китай). Метаноловий елюат збирали, а загальний вміст PeGs аналізували при 333 нм, використовуючи ехінакозид як стандарт (Du and Liu 1993a; Du et al. 1993b).

Життєздатність клітин оцінювали шляхом відновлення 2,3,5-трифенілтетразолій хлориду (TTC) (Steponkus and Lanphear 1967). Індекс життєздатності визначається як абсорбція, виміряна на грам свіжої тканини. Визначення активності PAL базувалося на методі Koukol і Conn (1961). Одна одиниця активності PAL (U) визначається як величина варіації абсорбції 0.01.

Результати і обговорення

Вплив початкової концентрації сахарози на ріст клітин і біосинтез PeGs у суспензійних культурах клітинCistanche deserticola.ВідповідьCistanche deserticolaсуспензійних культур клітин до початкової концентрації сахарози між 87,6 і 262,9 мМ. Як показано на рис. 1, клітини швидко росли та накопичували PeG при низькій початковій концентрації сахарози 87,6 мМ, а ріст клітин і накопичення PeG були явно пригнічені при високій початковій концентрації сахарози 262,9 мМ. Співвідношення свіжої маси до сухої маси зменшилося, коли початкова концентрація сахарози збільшилася з 87,6 з 262,9 мМ (дані не показані). Максимальна суха маса 15,9 г/л і вміст PeGs 20,7 мг/г–1-DW були отримані на 30 день при початковій концентрації сахарози 175,3 мМ, осмолярність якої становила приблизно 300 мОсм/кг. Під мікроскопічним спостереженням клітинні стінки відокремлювали від цитоплазми при найвищому осмотичному стресі 388 мОсм кг–1, де початкова концентрація сахарози становила 262,9 мМ (рис. 2), і найвищий осмотичний стрес міг порушити метаболізм клітин і призвести до серйозне пригнічення росту та зниження біосинтезу PeG. Подібне явище також спостерігалося в суспензійних культурах суспензійних культур клітин T. Chinensis, і оптимальна концентрація сахарози для продукції паклітакселу становила 175,3 мМ (Kim et al. 2001). Однак початкова концентрація сахарози 204,5 мМ була сприятливою для росту клітинних культур E. sessiliflorus. Вища концентрація сахарози 262,9 мМ посилила біосинтез елеутерозидів, фенолу та флавоноїдів у культурах Eleutherococcus (Shohael et al. 2006). Зрозуміло, що початкова концентрація сахарози важлива для росту та накопичення вторинних метаболітів рослинних клітинних культур, і її ефект пов’язаний із конкретною клітинною лінією.

Вплив різних осмотичних агентів на клітинний ріст і біосинтез PeGs у клітинних суспензійних культурах C. deserticola

Зрозуміти осмотичну роль метаболічної сахарози та інших неметаболічних хімічних субстратів у біосинтезі PeGs у суспензійних культурах клітинCistanche deserticolaбуло проведено серію експериментів з використанням сахарози в поєднанні з неметаболічними осмотичними агентами (маніт, ПЕГ і NaCl). У цих експериментах 164,7 мМ маніту, 20 мМ ПЕГ і 50 мМ NaCl додавали до середовища, що містило 87,6 мМ сахарози, і створювали початкову осмолярність близько 300 мОсм кг–1, що було еквівалентним осмотичним станом, порівнянним із середовищем із 175,3 мМ. сахарози.

Як показано на рис. 3a, b, додавання маніту (неметаболічний цукоросмотичний агент) і PEG (непроникний осмотичний агент) трохи пригнічує швидкість росту клітин, але значно посилює біосинтез PeGs уCistanche deserticolaклітинні суспензійні культури. Максимальний вміст PeGs 26,9 та 23,8 мг г–1-DW було отримано відповідно на 21 день, коли клітини вирощували в комбінаціях 87,6 мМ сахарози з 164,7 мМ маніту (303 мОсм кг–1) або 20 мМ ПЕГ (299 мОсм кг–1). Суми PeGs були вищими, ніж уCistanche deserticolaкультури клітин, вирощені в рідкому середовищі MS з початковою концентрацією сахарози 175,3 мМ на 30-й день. Цукор споживався поступово протягомCistanche deserticolaклітинної культури, а потім індукований цукром осмотичний стрес відповідно впав (рис. 3c, d). Осмотичний стрес рідкого середовища з початковою концентрацією сахарози 175,3 мМ знизився з 280 до 110 мОсм кг–1, коли PeGs у клітинних культурах почали накопичуватися на 9 день і досягли максимуму на 30 день (дані не показані). Неметаболічні осмотичні агенти (маніт і ПЕГ) не витрачалися в процесі культивування клітин, що дозволяло підтримувати осмотичний стрес рідкого середовища між 200 і 280 мОсм кг–1, що є сприятливим для біосинтезу ПЕГ осмотичним тиском. Ці результати показали, що сам осмотичний стрес відіграє важливу роль у посиленні біосинтезу PeGs уCistanche deserticolaкультури клітин.

Повідомлялося, що додавання NaCl покращує біосинтез алкалоїдів індолу та сапоніну відповідно в клітинних культурах Catharanthus roseus та Panax ginseng (Smith та ін., 1987; Wu та ін., 2005), але обробка NaCl пригнічує ріст клітин T. Chinensis. не виявивши різниці в біосинтезі палітакселу (Kim et al. 2001). Тому для кожного випадку необхідне детальне розслідування. Додавання осмотичного еквівалента 50 мМ NaCl пригнічувало ріст клітин і біосинтез PeG. Цей результат може бути пов’язаний з проникною природою NaCl, яка не є корисною для клітинних культур цього виду пустельних рослин, які можуть дуже добре переносити стрес від посухи.

Рис. 3 Вплив комбінацій сахарози та інших неметаболічних осмотичних агентів на ріст клітин (а), накопичення PeGs (b), споживання цукру (c) і зміну осмотичного стресу (d) у процесі клітини C. deserticola культури. Значення є середніми для трьох колб ± SD

Вплив різних осмотичних агентів на життєздатність клітин і активність PAL у суспензійних культурах клітин Cistanche deserticola

У наших попередніх дослідженнях (Cheng et al. 2005b, 2006) додавання еліситорів різко стимулювало біосинтез PeGs уCistanche deserticolaклітинних культур, і стимуляція корелювала з підвищенням активності PAL, першого ключового ферменту в біосинтезі PeGs (Hahlbrock and Grisebach 1979). Як показано на рис. 4, додавання неметаболічного 164,7 мМ маніту або 20 мМ ПЕГ у рідке середовище MS, що містить 87,6 мМ сахарози, дещо знизило життєздатність клітин, але значно підвищило активність PAL, яка була вищою, ніж індукована початковою концентрацією сахарози 175,3 мМ. Посилене накопичення ПеГ вCistanche deserticolaСуспензійних культур клітин було пов'язано з підвищенням активності PAL, стимульованої самим осмотичним стресом. Початкова концентрація сахарози 175,3 мМ у рідкому середовищі MS викликала зниження життєздатності клітин через 15 днів і пригнічувала активність PAL через 21 день. Після періоду споживання цукру зростаєCistanche deserticolaклітинних культур, як життєздатність клітин, так і активність PAL культивованих клітин зросли і досягли свого максимуму на 24 і 30 день відповідно. Також спостерігалося підвищення активності PAL через осмотичний стрес для покращення біосинтезу сапоніну в культурах клітин P. ginseng і накопичення алкалоїдів у культивованих клітинах C. roseus (Godoy-Hernandez та ін. 2000; Wu та ін. 2005). Однак додавання проникного NaCl до рідкого середовища MS, що містить 87,6 мМ сахарози, знижувало життєздатність клітин і пригнічувало активність PAL протягом усього періоду культивування. В результаті як ріст клітин, так і біосинтез PeG були явно пригнічені.

Рис. 4 Зміна життєздатності клітин (а) та активності PAL (б) у культурах клітин C. deserticola за різного осмотичного стресу під часCistanche deserticolaкультура клітин. Значення є середніми для трьох колб ± SD

Cistanche deserticolaє пустельним видом, і дослідження клітинних культур пустельного виду in vitro створило нові виклики та можливості для розуміння фізіології рослин та екологічних адаптацій. У цьому дослідженні ми розробили систему з потенціалом для вивчення шляху біосинтезу трансдукції сигналу, опосередкованого осмотичним стресом, і система забезпечила основу для великомасштабного виробництва PeG з використаннямCistanche deserticolaклітинних культур за допомогою нової стратегії, що регулюється осмотичним стресом.

Подяки

Автори висловлюють вдячність за фінансову підтримку Програми інноваційних досліджень Китайської академії наук.

З: «Посилення біосинтезу фенілетаноїдних глікозидів у клітинних культурах Cistanche deserticola шляхом осмотичного стресу» Чун-Жао Лю. Сі-Ю Ченг

---Представник рослинної клітини (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Список літератури

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolaклітинні суспензійні культури: біосинтез фенілетаноїдних глікозидів та антиоксидантна активність. Process Biochem 40:3119–3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Повторне виявлення посилює накопичення фенілетаноїдних глікозидів у суспензійних культурах клітинCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Поліпшення біосинтезу фенілетаноїдних глікозидів у суспензійних культурах клітин Cistanche deserticola за допомогою хітозанового еліситора. J Biotech 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Визначення фенілетаноїдних глікозидів уCistanche deserticolaспектрофотометрією макроретикулярної смоли. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Виділення та ідентифікація фенілетаноїдних глікозидів зCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Колориметричні методи визначення цукру та споріднених речовин. Анальна хімія 28:350–357

Godoy-Hernandez GC, Vasquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Вплив транс-коричної кислоти на осмотично стресовані клітини Catharanthus roseus, культивовані в біореакторі 14-l, збільшує накопичення алкалоїдів. Biotechnol Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Ензимний контроль у біосинтезі лігіну та флавоноїдів. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Кім С.І., Чой Х.К., Кім Дж.Х. (2001) Вплив осмотичного тиску на виробництво паклітакселу в культурах суспензійних клітин Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Метаболізм ароматичних речовин і властивості фенілаланіндезамінази Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692–2698
Lu MC (1998) Дослідження седативного ефектуCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Поліпшення виробництва фенілетаноїдних глікозидів грибковим еліситором у суспензійній культурі клітинCistanche deserticola. Biotechnol Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Переглянуте середовище для швидкого росту та біотести з культурами тканин тютюну. Фізіологія рослин 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Вплив рідкоземельних елементів на рістCistanche deserticolaклітин і вироблення фенілетаноїдних глікозидів. J Biotechnol 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Посилення виробництва елеутерозидів в ембріогенних культурах Eleutherococcus sessiliflorus у відповідь на індукований сахарозою осмотичний стрес. Process Biochem 41:512–518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Використання органічних і неорганічних сполук для підвищення накопичення алкалоїдів індолу в суспензійних культурах клітин Catharanthus roseus (L.) Don. J Exp Bot 38:1507–1511
Степонкус П.Л., Ланфеар Ф.О. (1967) Удосконалення методу трифенілтетразолію хлориду для визначення холодової травми. Plant Physiol 42:1423–1426 Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Значне покращення виробництва таксанів у суспензійних культурах Taxus Chinensis за допомогою стратегії годування сахарозою. Process Biochem 35:479–483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Ефект поглинання глікозидівCistanche deserticolaна вільні радикали та його захист від OH-індукованого пошкодження ДНК in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Посилення виробництва сапоніну в культурі клітин Panax ginseng шляхом осмотичного стресу та годування поживними речовинами. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Вплив осмотичного тиску на ріст клітин і виробництво сапоніну і полісахариду женьшеню в суспензійних культурах Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Порівняння міжCistanche deserticolaYC Ma і Cistanche tubulosa (Scheak) мають деякі фармакологічні дії. Tradit Chin Med J 21:436–438