Вплив водного екстракту Cistanche Tubulosa на мікробіоту кишечника мишей із кишковими розладами

1. Введення

Кишкові мікроорганізми в основному колонізують просвіт кишечника та слизовий шар і взаємодіють з хазяїном через обмін матеріалами та енергією, трансформацію та інші процеси [1]. Вони є центрами сигналізації, які об’єднують сигнали навколишнього середовища, такі як дієта, з генетичними та імунними сигналами, що, відповідно, впливає на метаболізм, імунітет, нервову систему та відповідь на інфекції [2]. У нормі існує динамічна рівновага між кишковою флорою та господарями; однак дисбактеріоз кишечника може призвести до змін у балансі здоров’я/захворювання, імунних розладів та багатьох захворювань [3]. Помірні зміни мікробіоти кишечника прийнятні для господаря; однак це все ще може надати можливості для посилення змін інших обтяжуючих факторів, таких як бактеріофаги, бактеріоцини та окислювальний стрес [4].

CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ МІКРОБІОТИ КИШЕЧНИКА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Це показали попередні дослідженняетанольний екстракт Cistanche tubulosa(CT), традиційна китайська трав’яна формула, може регулювати мікробний склад кишечника у щурів [5], а загальні глікозиди CT регулюють невпорядковану мікробіоту кишечника [6]. Види Cistanche, які в основному паразитують на коренях видів Tamarix, також називають «женьшенем пустелі», а тонік, що складається зі стебел Cistanche deserticola (CD) і Cistanche tubulosa (CT), використовується як рослинний засіб [7]. ].чтВстановлено, що основні хімічні компоненти СТ фенілетанолглікозиди (ПГГ), які є антиоксидантами [8, 9], покращують репродуктивну дисфункцію [10], пригнічують активацію зірчастих клітин печінки, блокують проведення сигнальних шляхів у TGF{{3} }/ SMAD [11], а також запобігати індукованому бичачим сироватковим альбуміном фіброзу печінки у щурів [12]. Серед більш ніж 100 компонентів СТ полісахарид також є однією з важливих речовин із високим вмістом [13, 14]. Попередні дослідження продемонстрували, що полісахариди C. deserticola індукують меланогенез у меланоцитах, зменшують окислювальний стрес [15], полегшують когнітивну дисфункцію шляхом регуляції антиоксидантних і протизапальних процесів у щурів [16], захищають клітини PC12 від пошкоджень, спричинених OGD/RP [17]. ],посилюють всмоктування ехінакозиду in vivo, і впливають на мікробіоту кишечника [18].

Пробіотики — це живі непатогенні мікроорганізми, які мають користь для здоров’я та забезпечують мікробний баланс у шлунково-кишковому тракті при введенні в адекватних кількостях [19].чтВони можуть посилювати неспецифічні клітинні імунні відповіді, що характеризуються активацією макрофагів, природних клітин-кілерів (NK) і антиген-специфічних цитотоксичних Т-лімфоцитів і вивільненням різних цитокінів залежно від штаму та залежно від дози [20]. Пробіотичні штами покращують властивості кишкового епітелію через модуляцію TJ, і було продемонстровано, що конкретні пробіотичні штами регулюють експресію муцину, тим самим впливаючи на властивості слизового шару та опосередковано регулюючи імунну систему кишечника [21]. Штами молочнокислих бактерій (LAB) і Bifidobacterium є основними пробіотиками, які використовуються в багатьох областях [22–26].чтїхня користь для здоров’я є численною, причому їх антиоксидантна здатність є важливим фактором у їхніх функціях, пов’язаних зі здоров’ям [27]. Пробіотики можуть хелатувати іони металів, щоб запобігти каталізу окислення [28, 29]; вони також можуть збільшувати експресію антиоксидантних ферментів [30, 31], продукувати різні метаболіти з антиоксидантною активністю [32, 33], опосередковувати антиоксидантні сигнальні шляхи [34–36] і регулювати ферменти, що продукують активні форми кисню (АФК) і реакція кишкових мікроорганізмів на окислювальний стрес [37].

Недавнє дослідження показало, що полісахариди CD можутьстимулюють ріст деяких молочнокислих бактерій, що може принести користь здоров’ю людини [38]. Проте вміст полісахаридів у КР відрізняється від такого в СТ [7, 39], і ця різниця може призводити до різного впливу на кишкові мікроорганізми. Крім того, хоча полісахариди CD можуть зменшувати окислювальний стрес шляхом активації шляху NRF2/HO-1 [15], ефекти одного полісахариду можуть відрізнятися від загального ефекту кількох композицій у CT.чтДля нас необхідно точно визначити вплив водних екстрактів ХТ на кишкові мікроорганізми. Крім того, PHG також можуть протистояти окислювальному стресу [40] і пригнічувати опосередковані ліпополісахаридами запальні реакції шляхом активації шляху Keap1/Nrf2/HO-1 [41].чттому визначення ефекту водного екстракту КТ має велике значення. Крім того, вплив деяких компонентів водного екстракту CD на окислювальний стрес і кишкову флору свідчить про те, що стійкість до окислювального стресу може корелювати зі змінами кишкової флори.

Щоб заповнити прогалини в знаннях із зазначених вище тем, ми дослідили вплив водного екстракту CT на мікробіоту кишечника мишей із порушеннями кишкової флори.чтЦі результати нададуть цінну інформацію про можливі механізми, за допомогою яких КТ змінює кишкову флору та забезпечує стійкість кишечника до окислювального стресу.

2. Матеріали та методи

2.1. Піддослідні тварини.

Загалом 18 самців мишей C57BL/6J класу SPF вагою 18–22 г були придбані в Центрі експериментальних тварин Сіньцзянського медичного університету з номером ліцензії SCXK (нова) 2018-0003.чтЇх утримували в клітках за стандартизованих умов: 12 годин світло/темрява, температура 23 ± 2 градуси та вологість 55 ± 5%.чтТварин годували комерційною дієтою (51% екстракту без азоту, 25% сирого протеїну, 4,6% сирого жиру, 6,5% сирої золи, 4.0% сирої клітковини та 8,9% вологи) і водопровідною водою.чтТварин лікували відповідно до рекомендацій, описаних у Посібнику з догляду та використання лабораторних тварин Національного інституту здоров’я.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ ІМУНІТЕТУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Екстракція водного екстракту.

Висушені шматочки C. tubulosa, надані компанією Hotan Dichen Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd., подрібнювали в порошок і відбирали гранули з розміром частинок від 20 до 40 меш.чтУмови екстракції були наступними: співвідношення тверда рідина 1:19, температура 80 градусів, час мікрохвилі 6 хв, час ультразвуку 16 хв, потужність мікрохвиль 400 Вт і потужність ультразвуку 400 Вт.чтВміст основних компонентів водного екстракту вимірювали методом ВЕРХ (Agilent 1260 Infinity II, Каліфорнія, США). Коротше кажучи, стандартні речовини ехінакозид (0,2 мг/мл) і актеозид (0,2 мг/мл) розчиняли в 50% метанолі, щоб служити розчином речовини порівняння.чтen, 1 г водного екстракту CT розчиняли в 100 мл 50% метанолу і залишали для застигання протягом 30 хв.чтРозчин екстракту обробляли ультразвуком при 250 Вт і 35 кГц протягом 10 хв, а потім центрифугували при 12,000 об/хв.чтСупернатант фільтрували за допомогою мікропористої фільтрувальної мембрани 0.45 мкм.чтРозчин еталонної речовини та фільтрат потім були виявлені за допомогою ВЕРХ у таких умовах: силікагель, зв’язаний октадецилсиланом, як наповнювач, метанол як рухома фаза A та 0.1% мурашина кислота як рухома фаза B.чтТемпературу колонки встановлювали як 30 градусів, довжину хвилі детектування встановлювали як 330 нм, а об’єм ін’єкції становив 10 мкл.

2.3. Експерименти.

Після одного тижня адаптації 18 мишей випадковим чином розділили на шість груп: A (нормальні з додаванням середньої дози водного екстракту CT), B (нормальні без водного екстракту CT), C (модель без водного екстракту), D (модель без водного екстракту CT). модель із додаванням високої дози водного екстракту CT), E (модель із додаванням середньої дози водного екстракту CT) і F (модель із додаванням низької дози водного екстракту CT).чтГрупи обробляли наступним чином: нормальна група була змочена фізіологічним розчином, модельна група була змочена цефіксимом (30 мг/кг, Shiyao Group Ouyi Pharmaceutical Co., Ltd., Шицзячжуан, Китай) і фізіологічним розчином, високим групу з низькою дозою вводили цефіксимом і 221,14 мг/кг водного екстракту CT, групу із середньою дозою вводили цефіксимом і 165,54 мг/кг водного екстракту, групу з низькими дозами вводили цефіксимом і 110,57 мг/кг. водного екстракту.чтe Групу пролили 165,54 мг/кг водного екстракту, але цефіксим не додавали. Цефіксим вводили щодня о 12:00 год, а інші речовини — о 15:{3}} год. Під час експериментів групи C, D, E, F перебували в модельному стані кишкових розладів.чтФекалії збирали кожні сім днів на стерильний операційний стіл і зберігали при температурі -20 градусів.

2.4. Патогістологічне спостереження товстої кишки мишей.

Наприкінці експерименту мишей вбивали через вивих шийки матки, а вміст їх товстої кишки збирали на стерильний операційний стіл і зберігали при -80°C; при цьому зразки тканин товстої кишки фіксували в 10% нейтральному формаліні.чтen, зразки зневоднювали за допомогою градієнта концентрації етанолу, гіалінізували за допомогою ксилолу, заливали в парафін, розрізали та фарбували гематоксилін-еозином. Морфологічні зміни слизової оболонки товстої кишки спостерігали та порівнювали за допомогою оптичного мікроскопа. Вимірювали довжину ворсинок і глибину крипт в товстій кишці, а також розраховували співвідношення довжини ворсинок до глибини крипт (значення V/C) (51).

2.5. Виділення ДНК і створення бібліотеки.

ДНК екстрагували з фекалій за допомогою набору EZNA ®Soil DNA Kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) згідно з протоколом виробника. Якість ДНК визначали за допомогою флуорометра (QuantiFluor™–ST, Promega Corporation, США). Парні праймери в області V3-V4 16s рДНК були розроблені для ампліфікації області та отримання фрагментів ДНК довжиною 466 bp.чтПрямий праймер був 341F (-5- CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), а зворотний праймер був 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). Кожен об’єм ПЛР становив 25 мкл, містив 2,5 мкл буфера 10 × ПЛР, 2 мкл dNTP, 1 мкл кожного праймера та 20–30 нг матричної ДНК.чтen, індексовані адаптери були приєднані до кінця ампліконів для створення бібліотек секвенування.чтБібліотеки перевіряли за допомогою флуорометра QuantiFluor™ і кількісно визначали до 10 нмоль.

2.6. Секвенування гена 16s рРНК та аналіз мікробного співтовариства.

чтПлатформа Illumina (Illumina MiSeq) була використана для отримання даних парного кінця 2 × 250 bp. Оперативні таксономічні одиниці (OTU) були отримані за допомогою програмного забезпечення Uparse шляхом стандартної кластеризації з 97% схожістю.чтНаивний байєсівський алгоритм призначення класифікатора RDP використовувався для узгодження OTU з базою даних Greengene версії 13.5 і виконання анотації видів.чтАльфа-різноманітність кишкової мікробіоти розраховували за допомогою індексів Шеннона та Сімпсона, а відмінності між групами аналізували за допомогою лінійного дискримінантного аналізу розміру ефекту (LEfSe).чтБета-різноманіття було проаналізовано за допомогою аналізу головних координат (PCoA) відмінностей Брея-Кертіса. PICRUSt2 використовувався для оцінки мікробної метаболічної здатності мікробіому кишечника [42].

2.7. Аналіз статистичних даних.

SPSS 20 використовували для одностороннього дисперсійного аналізу, а експериментальні дані виражали як X ± S; X позначає середнє значення, а S позначає стандартне відхилення.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗНА ДЛЯ МОДЕРАЦІЇ МЕТАБОЛІЧНИХ ЗМІН PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Результати

3.1. 8e Вплив водного екстракту CT на морфологію товстої кишки.

чтe типові сполуки (ехінакозид і актеозид) та їхні концентрації в екстракті CT були перевірені за допомогою ВЕРХ (рис. S1). Щоб визначити вплив водного екстракту на кишечник, ми досліджували довжину ворсинок товстої кишки та глибину заглиблень після обробки водним екстрактом CT.чтВорсинки товстої кишки в групах нормальної та високої дози (A, B та D) були довшими та схожими на пальці, тоді як ворсинки товстої кишки в модельних групах та групах із низькими дозами (C та F) були короткими, а кінчики товстої кишки ворсинки були зламані (рис. 1). Відповідно, високі дози водного екстракту CT значно збільшили довжину ворсинок товстої кишки та зменшили глибину рецесусу у мишей із кишковими розладами порівняно з мишами в модельній групі (P < 0.01). Навпаки, глибина рецесусу істотно не відрізнялася між групою високої дози та нормальною групою (P > 0,05) (Таблиця S1).чтЦі результати показали, що висока доза водного екстракту CT може покращити морфологію всередині товстої кишки мишей з кишковими розладами.

3.2. 8e Вплив водного екстракту CT на різноманітність кишкової мікробіоти.

Ми виконали секвенування гена 16s рРНК, щоб дослідити потенційну причину морфологічних змін всередині товстої кишки та дослідити зміни мікробіоти кишечника після обробки водним екстрактом CT. З необроблених даних було отримано в середньому 100 553 ефективних тегів у діапазоні від 77 734 до 125 144 (Таблиця S2).чтЦі теги були згруповані в 4932 OTU (Таблиця S3). Потім ми проаналізували різноманітність мікробіоти кишечника на основі цих OTU.чтe Індекси Шеннона та Сімпсона не показали різниці між групою А (норма з водним екстрактом CT) і групою B (норма без водного екстракту CT) (рис. 2(a)).чтПоказано, що у мишей без лікування цефіксимом водний екстракт CT міг не мати додаткового корисного чи шкідливого впливу на різноманітність мікробіоти кишечника. Однак різноманітність у модельній групі (C) показала тенденцію до зменшення порівняно з такою у звичайних групах.чтМиші, які отримували високі та середні дози водних екстрактів CT, показали ознаки відновлення різноманітності, тоді як таке явище не спостерігалося у мишей, які отримували низькі дози водного екстракту CT (рис. 2(a)). Тим часом PCoA показало, що нормальні групи (A і B) і групи кишкових розладів, яким вводили високі дози (D) і середні дози (E) водних екстрактів CT, як правило, мали менші відстані між зразками, ніж у групі моделі та в групі дослідження. група добавок водного екстракту CT з низькими дозами (F) (рис. 2(b)).чтЦі результати показали, що водний екстракт CT може допомогтипокращує різноманітність мікробіоти кишечникау мишей з кишковими розладами.

3.3. Зміни в складі кишкової мікробіоти, обробленої водним екстрактом CT.

чтПрофілі складу мікробіоти порівнювали між різними групами. На рівні типу відносна кількість протеобактерій у модельній групі була вищою, ніж в інших групах (рис. 3(a)).чтЗбільшення Proteobacteria свідчить про те, що цефіксим змінив мікробіом модельних мишей і що водний екстракт CT може принести користь кишковій мікробіоті, оскільки підвищена поширеність Proteobacteria є основним маркером невпорядкованої кишкової флори [43–45]. Крім того, на рівні роду відносна кількість Lactobacillus у модельній групі зменшилася порівняно з такою в групах нормальної та високої дози; однак він збільшився порівняно з групою середньої та низької дози (рис. 3(b)).чтЦі результати показали, що високі дози водного екстракту CT можуть сприяти росту деяких бактерій з роду Lactobacillus.

Диференціальну мікробіоту між досліджуваними групами далі визначали за допомогою аналізу LEfSe.чтЦей аналіз показав, що після лікування цефіксимом відносна кількість Turicibacter, Alphaproteobacteria, Acidobacteria, Betaproteobacteriales і Chloroflexi значно зросла, тоді як відносна кількість Lactobacillus, групи Eubacterium_nodatum_, Pseudonocardiales , і Christensenellaceae_R-7_група значно зменшилася порівняно з групою нормальної групи (рис. 4(a)). Вражаюче те, що коли модельну групу доповнювали високими дозами водного екстракту CT, відносна кількість Muribaculaceae, Lactobacillus, Kineosporiaceae, групи Eubacterium nodatum і Pedobacter значно зросла порівняно з показниками в групі моделі. Тим часом відносна чисельність Rhodobacter, Ruminococcaceae UCG_013, Roseburia, Ruminiclostridium_9 і Candidatus Stoquefichus значно зменшилася порівняно з показниками в модельній групі (рис. 4(b)).

3.4. Функції кишкової мікробіоти, пов’язані з лікуванням водним екстрактом CT.

Ми використовували програмне забезпечення PICRUSt2 для прогнозування метаболічних шляхів кишкової мікробіоти, а нормальну групу використовували як еталон для аналізу змін в інших групах. Під час лікування цефіксимом відносна кількість розпаду етилбензолу, біосинтез нерибосомальних пептидів сидерофорної групи та метаболізм ксенобіотиків шляхом цитохрому Р450 збільшилися; після обробки високими та середніми дозами водних екстрактів CT їх відносна кількість повернулася до нормального рівня. Тим часом відносна кількість метаболічного шляху ціаноамінокислоти зменшилася під час лікування цефіксимом; однак він збільшився після лікування високими дозами водного екстракту CT. Крім того, загалом зміни в різних метаболічних шляхах після лікування цефіксимом були значними порівняно з такими у групі нормального лікування; однак додавання водного екстракту CT змогло запобігти надмірним змінам (рис. 5).

4. Обговорення

Морфологія товстої кишки може бути змінена ростом, травленням і всмоктуванням, імунною регуляцією та відновленням пошкоджень кишечника [46–50].чтСпіввідношення V/C може всебічно відображати стан травлення кишкового тракту та прямо пропорційне травній та всмоктувальній здатності кишкового тракту [51, 52]. У цьому дослідженні біопсія ворсинок і заглиблень і статистичні дані показали, що високі дози водного екстракту можуть частково покращити дефектну морфологію всередині товстої кишки.

Щоб дослідити, як водний екстракт змінює морфологію кишечника та впливає на кишкову мікробіоту, ми працювали у зворотному напрямку від змін у кишковій флорі. Ми виявили, що відносна кількість протеобактерій, основного маркера порушення кишкової флори, зросла під час лікування цефіксимом порівняно з таким без лікування цефіксимом.чтВідносна кількість інших хаб-маркерів, Bacteroidetes і Firmicutes, не зазнала істотних змін, хоча ці

групи переважають у кишечнику людини; Було виявлено, що співвідношення Bacteroidetes/Firmicutes було знижене у людей з ожирінням порівняно з таким у худих людей, і було виявлено, що це співвідношення збільшується із втратою ваги у людей, які дотримуються двох типів низькокалорійної дієти [38, 41, 43–45, 48, 53, 54]. Тим часом Turicibacter, який асоціюється з ожирінням [55], був значно підвищений у модельній групі порівняно з іншими групами. Примітно, що різноманітність кишкової мікробіоти у модельних мишей було покращено завдяки додаванню водного екстракту CT. Ми відзначили деякі специфічні кишкові бактерії у мишей під різними методами лікування; наприклад, Lactobacillus і Muribaculaceae були двома основними родами бактерій, кількість яких зросла в групі, яка отримувала високі дози водного екстракту CT, порівняно з групою моделі (рис. 4). Останні дослідження показали, що полісахариди водних екстрактів CT мають значну

зростання деяких молочнокислих бактерій, які можуть принести користь здоров’ю господаря [43]. Паралельно Muribaculaceae є пробіотичними організмами, пов’язаними з довголіттям [57].чтВони припустили, що механізм, за допомогою якого водний екстракт CT покращує мікробіоту кишечника, може полягати в стимулюванні або захисті росту пробіотичних організмів. Ще однією бактерією, яку варто відзначити, була бактерія YE57. Хоча високі дози водного екстракту CT сприяли відносній кількості бактерії YE57 у цьому дослідженні (рис. 4), попередні дослідження показали, що її кількість була вищою в нормальному кишечнику, ніж у кишечнику, обробленому висококонцентрованим залишком трав’яного чаю. [58] і що його кількість зменшилася після втручання Bacillus licheniformis у поєднанні з XOS (ксилоолігосахаридами) [59].чтРоль цієї бактерії в мікробіоті кишечника заслуговує на подальше вивчення. Крім того, відносно невелика кількість зразків у цьому дослідженні може стати причиною хибнопозитивних і хибнонегативних результатів, і пропонується проведення майбутніх досліджень на більших зразках для підтвердження ідентифікованих бактеріальних маркерів.

Композиція водного екстракту CT може бути важливою через її вплив на склад і функціональні зміни мікробіоти кишечника мишей з кишковими розладами. PHGs є звичайними активними компонентами, виявленими при CD та CT, і ехінакозид визначено як основний PHG при CT [60]. В останні десятиліття було показано, що ехінакозид володіє багатьма фармакологічними діями, такими як антистаріння та нейропротекторний ефект, покращення серцевої функції, зниження гіперліпідемії та гіперглікемії, а також запобігання спричиненого ожирінням діабету та метаболічного синдрому [53, 61–65] . Ми виявили зміни в метаболічних шляхах мікробіоти кишечника.чтОбробка цефіксимом призвела до збагачення бактерій, пов’язаних з деградацією етилбензолу та біосинтезом нерибосомальних пептидів групи сидерофорів, у той час як обробки водним екстрактом CT у високих і середніх дозах могли пом’якшити ці зміни, вказуючи на те, що цей екстракт сповільнював пов’язану з бактеріальною спільнотою дію. до цих функцій. Крім того, підвищене бактеріальне збагачення, пов’язане з метаболічним шляхом ціаноамінокислоти під час лікування високими дозами водного екстракту, і його зниження у модельних мишах показали, що водний екстракт CT може сприяти метаболізму ціаноамінокислоти.чтЗміни відповідних метаболітів можуть надати цьому водному екстракту фармакологічну активність.

Хоча механізм, за допомогою якого водний екстракт CT змінює склад і функцію кишкової мікробіоти, є складним, є деякі підказки, які дозволяють припускати потенційний механізм. Повідомлялося, що як молочнокислі бактерії, так і водні екстракти CT можуть протидіяти окислювальному стресу. Окислювальний стрес, що виникає під час запалення, є поширеним фактором, який загострює кишкові розлади шляхом значного зменшення мікробного різноманіття кишечника та сприяння сплеску специфічних бактерій (4). Навпаки, активні форми кисню також сприяють селективному росту бактеріальних груп через нітратне та тетратіонатне дихання [66–68]; наприклад, бактерії з сімейства Enterobacteriaceae можуть швидко рости внаслідок змін у складі кишкової флори в окисних умовах під час запалення [69, 70]. Більшість живих організмів розвивають ферментативний захист, неферментативний антиоксидантний захист і механізми відновлення для поглинання радикалів кисню [71]. Однак цих природних антиоксидантних систем, як правило, недостатньо для запобігання окисного пошкодження живих організмів. Кілька додаткових синтетичних антиоксидантів, включаючи бутильований гідроксіанізол і бутильований гідрокситолуол, широко використовувалися для зниження окислення, але їх безпека була під сумнівом [72, 73]. Тому дослідники звернулися до пошуку безпечніших і більш природних антиоксидантів, отриманих із природних речовин. Завдяки здатності як полісахаридів, так і молочнокислих бактерій усувати окислювальний стрес, визначення точного антиоксидантного механізму дії водних екстрактів СТ на мікробіоту кишечника потребує подальших досліджень у майбутньому.

На завершення ми виявили, що водний екстракт CT здатнийпокращує кишкову мікробіотуу мишей з кишковими розладами шляхом сприяння різноманітності,сповільнення метаболічних змін, а також реконструкція структури кишкової мікробіоти, і ці результати можуть дати посилання на розробку відповідних ліків у майбутньому.

НАТУРАЛЬНА CISTANCHE TUBULOSA ДЛЯ РЕМОДЕЛЮВАННЯ СТРУКТУРИ КИШЕЧНОЇ МІКРОБІОТИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%