Вплив глієозидів цистанхе на когнітивне навчання та синаптичну пластичність у щурів моделі депривації сну

АНОТАЦІЯ

Мета: «Дослідити, чи єглікозиди цистанхиможе покращитинавчання та когнітивні функції депривації снумоделі щурів порегуляція синаптичної пластичності. Методи: 50 самців щурів Wistar випадковим чином розділили на контрольну групу (контроль), контрольну групу платформи (ПК), модельну групу (модель),глікозиди групи цистанх(GCs), та групи естазоламу (Est). Модель депривації сну щурів була підготовлена ​​модифікованим методом мультиплатформенного водного середовища. Для виявлення щурів використовували водний лабіринт Морріса та тест у відкритому полі.просторова когнітивна функція aй емоційні зміни. Для спостереження за змінами використовували фарбування за Нісслемморфологія та кількість нервових клітинв області CAl гіпокампу щурів. Вестерн-блот і R'T-PCl використовували для визначення рівнів експресії синаптофізину (SYN), щільної субстанції постсинаптичної мембрани 95 (PSD - 95) і нейротрофічного фактора мозку (BDNF). Результати: Результати водного лабіринту Морріса показали, що порівняно з контрольною групоюнавчання та пізнавальні здібностіщурів у групі моделі значно зменшилася ( P<0. 05 ), and theнавчання та функція пам'яті щурівбуло покращено лікування ГК (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Висновок: Глікозиди цистанхиможе впливати на синаптичну пластичність, регулюючи експресію синаптичних маркерів, тим самим покращуючи навчання та когнітивні функції щурів моделі позбавлення сну.

КЛЮЧОВІ СЛОВАглікозиди цистанхи; гіпокамп; Позбавлення сну; Навчання і пам'ять; тривога; Синаптична пластичність

ПРОДАЖ ГЛІКОЗИДІВ ВИСОКОГО РІВНЯ ЦИСТАНХИ

Розлад сну (SD)є aфункціональний розлад снувикликані рядом складних факторів, таких як безсоння, часті сновидіння та легке пробудження. Захворюваність на СД в останні роки поступово зростає. Відповідні дослідження показали, що SD може спричинитисерцево-судинні захворювання, метаболічна дисфункція, імунні захворюваннята дегенеративні захворювання центральної нервової системи, такі як хвороба Альцгеймера [1]. СД може викликати окислювальне пошкодження нейронів гіпокампу, викликати когнітивну дисфункцію та викликати зміни настрою, такі як тривога та депресія [2]. Cistanche deserticola - дорогоцінний китайський лікарський матеріал, який можна використовувати як ліки та їжу. Він тонізує нирки та відновлює ци, зволожує кишечник, сприяє випорожненню та зміцнює ян. Основний екстракт цистанки пустерної, глікозиди цистанки (ГК), має антиоксидантну, антиапоптозну, печінкопротекторну та нейропротекторну дію [3]. Наше попереднє дослідження показало, що ГК можуть покращувати навчання та когнітивні функції мишей SAMP8, відіграючи антиоксидантну та антиапоптозну роль [4]. Відповідні дослідження показали, що когнітивна дисфункція, спричинена SD, тісно пов’язана із синаптичною пластичністю [5]. Однак є небагато повідомлень про механізм, за допомогою якого ГК регулюють синаптичну пластичність і покращують навчання та погіршення пам’яті та когнітивне зниження у щурів, викликане депривацією сну. Таким чином, це дослідження має на меті дослідити, чи впливають GC на синаптичну пластичність, регулюючи експресію синаптичних маркерів, тим самим покращуючи навчання та когнітивні функції щурів у моделі депривації сну, а також надаючи нові ідеї та плани лікування для лікування навчання та когнітивні порушення, спричинені розладами сну при ГК.

1 Матеріали та методи

1. 1 Піддослідні тварини

Самці щурів Wistar віком від 6 до 8 тижнів, вагою від 280 до 300 г, були придбані в Beijing Sibeifu з ліцензією на виробництво тварин [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Усіх тварин утримували в експериментальному центрі медичного коледжу Баотоу за таких умов: температура (24 ± 1) градус, вологість від 50% до 55%, 12 годин світла та 12 годин темряви, без обмежень щодо їжі та води. Цей експеримент був схвалений шкільним комітетом з етики [Baoyi Lunshen 2022 № (63)].

1. 2 Основні реактиви та прилади

Загальні глікозиди Cistanche deserticola були придбані у Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (номер партії: KSM20220609011); Таблетки естазоламу були придбані у CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (номер партії: 044220343); буфер для завантаження білка (P1015), буфер для лізису RIPA (R0010), хемілюмінесцентний розчин (PE0010) тощо були придбані в Beijing Solebao; антитіло постсинаптичної щільності 95 (PSD-95) (AB192757), антитіло до синаптофізину (SYN) (ab32127), придбане у Abcam, США; нейротрофічний фактор мозку (BDNF) (48503-2), -актин (52901), придбаний у SAB, США; вторинне антитіло кози проти кролика IgG (SA00001-20), придбане у Proteintech, США; мелатонін щурів (MT), набір ELISA (MM-0657R1), придбаний у Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Paraffin slicer (Leica, Німеччина); оптичний мікроскоп (Leica, Німеччина); Водний лабіринт Морріса, тестова коробка відкритого поля (Шанхай Сіньруань); прилад для вертикального електрофорезу

(Beijing Liuyi Company); шейкер для знебарвлення (Beijing Liuyi Company); система аналізу зображень білка (Shanghai Tanon Technology); прилад для кількісної ПЛР флуоресценції (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Експериментальна методика

1. 3. 1 Групування тварин і введення препарату

50 самців щурів лінії Вістар випадковим чином розділили на контрольну групу (контрольна група), контрольну групу платформи (контрольна платформа, група ПК), модельну групу (модельна група), групу загальних глікозидів Cistanche deserticola (група GCs , 50 мг/кг) і група естазолу (група Est, 0,54 мг/кг), по 10 щурів у кожній групі. Контрольній групі та групі ПК вводили 0,9% фізіологічний розчин через зонд. Усім групам проводили зондування о 7 ранку кожного дня після початку моделювання, і зондування тривало 21 день.

1. 3. 2. Підготовка тваринної моделі депривації сну

Модель депривації сну була створена за допомогою модифікованого методу мультиплатформенного водного середовища [6]. Експериментальне обладнання являло собою прямокутний резервуар для води з поліетиленової смоли розміром 130 см × 50 см × 45 см. У резервуар для води помістили невелику платформу діаметром 5 см і висотою 20 см. Платформа групи ПК мала діаметр 10 см і висоту 20 см. Резервуар для води заповнювали водою на глибину приблизно 18 см, а температуру води підтримували на рівні (20 ± 1) градус. За тиждень до початку експерименту щурів щодня поміщали в бокс депривації сну на 60 хвилин для ознайомлення з навколишнім середовищем. Після встановлення моделі, за винятком контрольної групи, щурів кожної групи поміщали на невелику платформу вчасно з 8 ранку до 8 вечора щодня для позбавлення сну протягом 21 дня поспіль. Усім щурам дозволяли вільно їсти та пити, а також вільно пересуватися на платформі, щодня змінювали світло й темряву протягом 12 годин.

1.3.3 Експеримент з водним лабіринтом Морріса

Водний лабіринт Морріса був розділений на 4 зони, заповнені водою, а платформа була розміщена в 4-му квадранті. Рівень води був приблизно на 2 см над платформою. Харчовий харчовий меланін додавали у воду, і температуру води підтримували на рівні (25 ± 1) градусів. (1) Експеримент з навігацією позиціонування: центр кожної області був обраний, і щурів обережно помістили у воду. Їм дозволили вільно досліджувати. Був зафіксований час, який знадобився щурам, щоб знайти цільову платформу протягом 60 секунд. Щури, які не знайшли платформу, направлялися на платформу і залишалися на 20 секунд. Навчання тривало 5 днів. (2) Тест просторового дослідження: на 6-й день платформу видаляли, а щурів поміщали у воду від центру 2-го квадранта до стіни. Записували кількість разів, коли щури проходили платформу протягом 120 с, і час, протягом якого вони залишалися в 4-му квадранті.

1.3. 4 Відкритий польовий експеримент

Була використана експериментальна коробка розміром 100 см × 100 см × 50 см, а дно коробки було розділено на 9 сіток. Кожну групу щурів заздалегідь поміщали у відкриту експериментальну кімнату для адаптації до внутрішнього середовища на 60 хв. На початку експерименту досліджуваних щурів по черзі поміщали у фіксовані кути експериментальної коробки відкритого поля, і за допомогою програмного забезпечення аналізу поведінки реєстрували кількість часу стояння, відстань руху та статичний час щурів протягом 5 хв. . Середовище повинно було бути тихим під час експерименту, а експериментальний пристрій протирали відповідно чистою водою та спиртом між двома експериментами, щоб уникнути впливу запаху попереднього щура на оцінку поведінки наступного щура.

1. 3. 5 Імуноферментний аналіз (ELISA)

Виявлення сироваткових рівнів МТ у щурів. Щурів анестезували шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції та відбирали 5 мл крові з черевної аорти. Після очікування протягом 30 хвилин при кімнатній температурі кров центрифугували для отримання сироватки. До кожної лунки додавали 40 мкл розріджувача зразка, а потім додавали 10 мкл зразка для тестування. Після запечатування герметизуючою плівкою інкубуйте при 37 градусах протягом 30 хвилин. Промийте 5 разів, додайте 50 мкл розчину для мічення ферменту та інкубуйте при 37 градусах протягом 30 хвилин після запечатування плівкою для запечатування. Промийте 5 разів, потім додайте по черзі розчин для проявлення кольору та розчин для зупинки реакції. Значення ОП кожної лунки вимірювали приладом для мічення ферментів при довжині хвилі 450 нм.

１. ３. ６ Фарбування за Нісслем

З кожної групи брали по три щури, і тканину мозку видаляли шляхом декапітації. Тканина головного мозку була фіксована 4% розчином поліметилметакрилату, і тканина була зневоднена, занурена в розчин воску і залита, і тканина була нарізана звичайними методами. Зрізи зберігали товщиною 5 мкм, промивали PBS, фарбували 0. 1% толуїдинового синього для 0. 5 год, диференційований 95% спиртом, зневоднений 100% спиртом, прозорий ксилолом і запечатаний нейтральною смолою. Зміни в морфології та кількості нейронів в області CA1 гіпокампу щурів спостерігали під мікроскопом і збирали зображення.

１. ３. 7 Вестерн-блот експеримент

З кожної групи було відібрано по чотири щури, і гіпокамп був виділений шляхом декапітації. Тканини гіпокампу змішували з буфером для лізису RIP A в крижаній бані та центрифугували для отримання супернатанту. Концентрацію білка визначали методом ВСА. 20 мкг білка додавали з буфером для завантаження білка для електрофорезу. Після завершення електрофорезу білка мембрану переносили при постійному потоці 300 мА, блокували 5% сухим знежиреним молоком, первинне антитіло інкубували при 4 градусах протягом ночі, а вторинне антитіло інкубували при кімнатній температурі протягом 2 годин. Після використання розчину для прояву кольору, систему хемілюмінесцентного аналізу зображень використовували для статистичного аналізу білкових смуг.

1. 3. 8 ОТ-ПЛР експеримент

З кожної групи було відібрано по три щури для приготування гомогенату тканини гіпокампу. Сумарну РНК із тканинної рідини екстрагували методом Тризоля та вимірювали концентрацію. Для зворотної транскрипції використовували набір для синтезу кДНК натщесерце, а реакцію кількісної ампліфікації флуоресценції використовували для виявлення відносного рівня експресії синаптично пов’язаної білкової мРНК за допомогою набору для кількісного флуоресценції. Результати аналізували за допомогою 2-ΔΔCt, а послідовності праймерів наведено в таблиці 1.

1.4 Статистичні методи

Результати даних, які відповідали нормальному розподілу, виражали як середнє ± стандартне відхилення (x ± s), а статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 9.5. Однофакторний дисперсійний аналіз використовувався для порівняння між декількома зразками, і P < 0.05 показав, що різниця була статистично значущою.