Вплив екстрактів Cistanche Tubulosa на репродуктивну функцію самців у стрептозотоцин-нікотинамід-індукованих діабетичних щурів-Ⅱ

3.2. Аналіз in vivo

3.2.1. Вплив CTE на масу тіла та споживання калорій

Після 6 тижнів експерименту група діабетиків (HFD-DM) показала більшу масу тіла, ніж контрольна група. Група HFD-DME4 продемонструвала нижчу масу тіла, ніж групи HFD-DM і HFD-DMER (рис. 7а). Споживання калорій контрольної групи було значно нижчим, ніж в інших групах. Не було істотної різниці між споживанням калорій в інших п’яти групах (рис. 7b).

3.2.2. Пероральний тест на толерантність до глюкози (OGTT) для визначення успішної індукції діабету

Оральний тест на толерантність до глюкози (ОГТТ) використовується як перспективний інструмент для виявлення цукрового діабету. Підвищення рівня глюкози в крові свідчить про цукровий діабет. Як показано на малюнку 8a, рівень глюкози в плазмі крові був нижчим у групах CTE, ніж у групі DM на 0, 30, 90 та 120 хв. Крім того, площа під кривою (AUC) концентрації глюкози в плазмі показала, що в групах CTE і RSG швидкість поглинання глюкози в крові була збільшена (рис. 8b).

3.2.3. Загальний вміст глюкози, холестерину та тригліцеридів у плазмі

Рівень глюкози в плазмі крові натще був вищим у групі DM і нижчим у групі DME2 (за винятком контролю), ніж в інших. Не було істотної різниці в загальному холестерині між групами, за винятком групи DME4. У групі DME4 рівень холестерину був нижчим, ніж в інших. Рівень тригліцеридів був вищим у групі DM і нижчим у групі DME4, а вміст тригліцеридів знижувався зі збільшенням концентрації CTE (табл. 2). Результати показують, що рівень глюкози, холестерину та тригліцеридів у плазмі був вищим у групі СД, а рівень значно знизився під час лікування CTE.

3.2.4. Рівні інсуліну в плазмі, рівень лептину в плазмі та оцінка моделі гомеостазу–інсулінорезистентність (HOMA-IR)

Рівні плазмового інсуліну, лептину та значення HOMA-IR наведено в таблиці 3. У групі СД були вищі рівні інсуліну та лептину в плазмі, ніж у контрольній групі. Індекс HOMA-IR також був значно вищим у групі ЦД. Значення інсуліну, лептину та HOMA-IR у плазмі знижувалися зі збільшенням концентрації КТР. Лептин плазми був значно знижений у групах CTE, але група препаратів RSG (DMR) не виявила жодної суттєвої різниці з групою DM.

3.2.5. Вплив КТР на рівень ЛГ і тестостерону в плазмі у щурів з діабетом

Як показано в таблиці 4, концентрації тестостерону у щурів з цукровим діабетом (СД) були значно знижені, тоді якконцентрація тестостерону була значно підвищенапри різних дозах КТР. Крім того, результати показали незначне зниження рівня ЛГ у групі DM порівняно з DMR, DME1, DME2 і DME4. Виробництво LH було вищим у групі DME4.

3.2.6. Вплив CTE на параметри сперми діабетичних щурів

Експериментальні результати показали, що в групі СД спостерігалося значне зниження кількості та рухливості сперматозоїдів, ніж у контрольній групі, тоді як рівень аномалій сперматозоїдів був значно підвищений у групі СД. Цікаво, що кількість сперматозоїдів, рухливість сперматозоїдів і рівень аномалій сперматозоїдів у групі DMR покращилися, але рухливість сперматозоїдів не досягає значного рівня порівняно з DME4. DME2 показав кращу кількість сперматозоїдів, ніж усі, і рівень рухливості був значно підвищений у групі DME4. Не було значної різниці між кількістю аномальних сперматозоїдів між групами, які отримували RSG і CTE (таблиця 5).

3.2.7. Вплив CTE на морфологію сім'яних канальців у діабетичних щурів

На рисунку 9 показано фарбування H&E зрізу яєчка. Чорна стрілка позначає клітину Лейдіга, а біла стрілка позначає клітину Сертолі. І клітини Лейдіга, і клітини Сертолі в групі СД показали значну атрофію, а в просвіті спостерігалася порожнина. Структура клітин Лейдіга та Сертолі була відновлена ​​в групах, які отримували CTE та RSG. Товщина сім'яного канальця була вищою в групах CTE та RSG, ніж у групі DM.

3.2.8. Вплив CTE на МРНК KiSS1, GPR54, SOCS-3 і SIRT1 у гіпоталамусі діабетичних щурів

Експресія KiSS1 (Малюнок 10a), GPR54 (Малюнок 10b), SOCS-3 (Малюнок 10d) і SIRT1 (Малюнок 10c) показана на Малюнку 10. Експресія мРНК KiSS1 і рецептора GPR54 у діабетичних щурів була значно нижче, ніж у контрольній групі. Рівні експресії мРНК KiSS1 і GPR 54 у DMR, DME1, DME2 і DME4 були значно підвищені. Зокрема, експресія мРНК GPR54 була значно підвищена в DME4 і була майже подібною до контрольної групи.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЗАХИСТУ ВИРОБНИЦТВА ТЕСТОСТЕРОНУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Цей експеримент додатково дослідив кількість мРНК SOCS-3 і SIRT1 у гіпоталамусі щурів. Експресія SOCS-3 мРНК у діабетичних щурів була значно збільшена, що вказує на те, що імпеданс лептину був більш серйозним. Групи DMR, DME1, DME2 і DME4 продемонстрували значні покращення порівняно з групою діабетиків. Експресія мРНК SIRT1 у групі DM була значно знижена та значно збільшена в групах DME1 та DME4.

3.2.9. Вплив CTE на антиоксидантні ферменти в плазмі та яєчках діабетичних щурів

Таблиця 6 показує, що активність SOD у плазмі крові, активність GPx і активність каталази щурів із діабетом значно знижувалися, а активності збільшувалися в групах, які отримували CTE та RSG. На додаток до цього, DME4 продемонстрував значні покращення активності GPx, ніж інші. Результати показали, що активність СОД і каталази у щурів з діабетом значно знизилися через шість тижнів. Активність СОД і каталази групи DMR не досягає значного рівня. Групи, які отримували CTE, продемонстрували значні покращення активності SOD і каталази. Підвищення активності каталази та СОД у групах CTE також спостерігалося в яєчках (табл. 7). Найвища активність СОД та каталази спостерігалась у групі DME1 та DME2 відповідно.

3.2.10. Вплив CTE на окислювальний стрес і запалення в плазмі та яєчках діабетичних щурів

Виробництво оксиду азоту (NO) у плазмі (Малюнок 11а) і яєчках (Малюнок 11b) показано на Фігурі 11. Виробництво NO в групі СД було значно збільшене як у яєчках, так і в плазмі порівняно з контрольною групою. Поступове зниження продукції NO спостерігалося в групах DME1, DME2 і DME4 (у плазмі). Група DMR також продемонструвала значне зниження виробництва NO. У випадку яєчка спостерігалося невелике зниження виробництва NO в групах CTE, тоді як у групі DMR не спостерігалося значного зниження виробництва NO.

Як показано на малюнках 12 і 13, рівні TNF- та IL-6 були значно підвищені у щурів з діабетом (як у плазмі, так і в яєчках), що вказує на те, що запалення є більш серйозним. У плазмі рівень TNF- подібний у групах, які отримували CTE та RSG (рис. 12a). Групи CTE значно (особливо DME2) знизили рівень TNF- в яєчку (рис. 12b). Рівень IL-6 був значно знижений у плазмі груп CTE та RSG (рис. 13a). У яєчку спостерігалася тенденція до зниження рівня IL-6, але це не досягло значного рівня (рис. 13b).

3.2.1.1. Вплив CTE на окислювальний стрес і запалення в сперматозоїдах щурів з діабетом, викликані дієтою з високим вмістом жирів

На малюнку 14 показано вміст аніону супероксиду в спермі щурів. Результати показали, що виробництво аніону супероксиду в спермі щурів з діабетом значно збільшилося, а в групі DMR не спостерігалося значного поліпшення. Групи DME1 і DME4 продемонстрували значно знижене виробництво супероксид-аніону.

3.2.12. Вплив CTE на перекисне окислення ліпідів у сперматозоїдах діабетичних щурів, викликане дієтою з високим вмістом жирів

Дослідження показали, що перекисне окислення ліпідів посилюється як у хворих на цукровий діабет 1, так і 2 типу [19]. Рівень малонового диальдегіду (МДА) у плазмі, спермі та яєчках наведено в таблиці 8. Рівень МДА у плазмі, яєчках та спермі групи DM був значно вищим, а лікування CTE та RSG зменшувало вироблення MDA. Значне зниження спостерігалося в групах DME4 і DMEI у плазмі. Це дослідження показало, що у хворих на цукровий діабет щурів не тільки підвищився ступінь перекисного окислення ліпідів у плазмі, а й у яєчках і спермі. Значне покращення спостерігалося при різних дозах КТР.

4. Обговорення

Цукровий діабет - хронічне захворювання, пов'язане з високим рівнем цукру в крові. Дисбаланс між рівнями антиоксидантів і ROS призведе до стану, який називається окислювальним стресом. Супероксид, гідроксильний радикал, пероксид водню, оксид азоту та синглетний кисень є одними з прикладів АФК, які сприятимуть розвитку діабету через окислювальний стрес [20].Цистанка трубчастаце рослина пустелі, яка містить активні компоненти, такі якполісахариди, олігосахариди, фенілетаноїдні глікозиди (ехінакозид, вербаскозид)пальмітинова кислота, лінолева кислота, іридоїди, альдити та лігнани. Ця рослина здатна виявляти протизапальну, нейропротекторну, антибактеріальну, противірусну, антиоксидантну, протипухлинну та імуномодулюючу дію [21]. Літературні дослідження показують, що фенілетаноїдні глікозиди з Cistanche tubulosa є основною причиною антиоксидантної активності [22]. Ресвератрол (RES) і розиглітазон (RSG) були взяті як позитивний контроль для досліджень in vitro та in vivo відповідно. RSG є потужним інсуліновим сенсибілізатором і має спорідненість із ізоформою рецептора, що активується проліфератором пероксисом (PPARc). Він контролює гіперглікемію у хворих на діабет [23]. РЕЗ має природну антиоксидантну активність і діє як судинорозширювальний засіб, регулюючи метаболізм ліпопротеїнів, пригнічуючи агрегацію тромбоцитів і запобігаючи раку [24,25]. Наше дослідження показало, що ECH демонструє кращу активність поглинання радикалів, ніж CTE та RES (рис. 1). Також зрозуміло, що ECH не викликає значної токсичності для клітин Лейдіга LC-540 і TM3 (рис. 2).

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЧОЛОВІЧОЇ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGE були використані для індукування стресових станів у клітинах Лейдіга. Виробництво AGEs, запалення, окислювальний стрес і діабет взаємопов’язані. Гіперглікемічний стан діабету сприяє пошкодженню клітин через вироблення AGEs і окислювальний стрес. AGE викликають токсичність клітин, що додатково сприяє рекрутуванню імунних клітин і загибелі клітин. Підвищений рівень AGEs сприяє експресії двох типів рецепторів, які називаються RAGE та AGER1 [26]. Стікання та подальша передача електрона з дихального ланцюга мітохондрій до молекулярного кисню під час окислювального стресу призводить до утворення супероксидного аніону. Наші результати показують, що виробництво супероксид-аніону, викликане AGEs, було збільшено в контрольній групі, а подальші покращення спостерігалися як при лікуванні ECH, так і RES. Відповідно до нашого дослідження було зрозуміло, що виробництво супероксиду (рис. 3) і H2O2 (рис. 4), індуковане AGEs, зменшувалося в присутності ECH і RES.

NF-κB відомий як важливий медіатор запалення, пов’язаного з діабетом [27]. Експресія NF-κB призводить до клітинної дисфункції та загибелі клітин. Активація NF-κB окисним стресом стимулює прозапальну відповідь, активацію ендотеліну та апоптоз [28]. Експресія RAGE і NF-κB була збільшена в групах, стимульованих AGE, і подальше зниження спостерігалося в клітинах, оброблених ECH і RES (рис. 5).

Тестостеронє анаболічним стероїдом і основнимчоловічий статевий гормонсинтезується з холестерину. Процес починається з окислювального розщеплення бічного ланцюга холестерину геном розщеплення бічного ланцюга холестерину (CYP11A). Цей ген локалізований у мембрані мітохондрій і перетворює холестерин у прегненолон. Далі ген CYP17A1 з ендоплазматичного ретикулуму видаляє два додаткових атома вуглецю та виробляє кілька стероїдів C19. На додаток до цього, прегненолон окислюється з утворенням андростендіону/прогестерону гідроксистероїддегідрогеназою (3- -HSD). Нарешті, тестостерон утворюється шляхом відновлення кетогрупи в 17-му положенні вуглецю андростендіону 17-бета-гідроксистероїддегідрогеназою (17- -HSD). Клітини Лейдіга беруть участь в основному виробництві тестостерону. Перенесення холестерину у внутрішню мітохондріальну мембрану вимагає дії стероїдогенного гострого регуляторного білка (StAR). Сучасні дослідження показують, що експресія StAR, CYP11A1, CYP17A1 і HSD17 3 була знижена в клітинах, оброблених AGE (контроль), і спостерігалося значне збільшення в клітинах, оброблених ECH і RES (рис. 6). . Таким чином, результати показують, що виробництвотестостерон був підвищений у групах лікування ECH та RES. 

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПІДВИЩЕННЯ СЕКСУАЛЬНОЇ СИЛИ PHGS75% ECH 30% ДІЯ 12%

Під час діабетичного стану транспорт глюкози до органів обмежений, і в результаті рівень глюкози підвищується [29]. Таким чином, гіперглікемічний стан є одним із важливих маркерів для виявлення діабету. Наші дослідження показують, що рівень глюкози в плазмі був підвищений у групах діабетиків, а AUC у групі ЦД була значно вищою, ніж в інших групах (рис. 8). У групі СД поряд із глюкозою плазми достовірно підвищувався вміст загального холестерину та тригліцеридів (табл. 2). Атеросклерозу сприяє підвищений рівень холестерину і тригліцеридів [30]. Проте рівень холестерину та тригліцеридів був знижений у групах, які отримували CTE та RSG. Вміст тригліцеридів у групі DME4 досяг майже таких же значень, як і в контрольній групі.

Інсулін - це гормон, який виробляється клітинами підшлункової залози та функціонує для контролю рівня цукру в крові в організмі, тоді як лептин - це гормон, який виробляється адипоцитами, які здатні регулювати споживання їжі та використання енергії. Дослідження показали, що лептин бере участь у патофізіології ожиріння і існує позитивна взаємодія між лептином та інсуліном [31]. Наші дослідження показують, що рівень інуліну та лептину в плазмі був вищим у групі ЦД, а рівень інсуліну знижувався зі збільшенням концентрації КТР. Група RSG не демонструє істотних відмінностей від групи DM. Інсулінорезистентність і функцію клітин оцінювали методом HOMA-IR. Значення HOMA-IR зросло в групі СД і значно відрізнялося від інших груп (табл. 3).

ЦД впливає на репродуктивну функцію через гормональні зміни в осі HPG, і дослідження показали, що на експресію інсуліну в яєчках також впливає діабет. Він характеризується вакуолізацією клітин Сертолі, підвищеною фрагментацією ДНК, порушенням сперматогенезу та підвищеним виснаженням зародкових клітин. Оксидативний стрес також сприяє порушенням репродуктивної функції [32]. Процес утворення сперми в чоловічому репродуктивному органі (яєчках) називається сперматогенезом. Яєчко складається з щільно згорнутих канальців, які називаються сім'яними канальцями. Клітини Сертолі видно в стінках сім’яних канальців і забезпечують живлення незрілих сперматозоїдів. Дослідження параметрів сперми показало, що кількість сперматозоїдів і рухливість зменшилися, а аномалії збільшилися в групі СД (табл. 5). Протилежний ефект спостерігався в групах, які отримували CTE та RSG. І клітини Лейдіга, і клітини Сертолі в групі СД показали значну атрофію, а в просвіті спостерігалася порожнина. У групі ЦД також зменшилась товщина сім’яного канальця. Поліпшення результату спостерігалося в групах, які отримували CTE та RSG (рис. 9). На додаток до цього, рівень ЛГ і тестостерону знизився в групі СД, а рівні підвищилися в групах, які отримували КТР (табл. 4). У чоловіків низький рівень тестостерону в сироватці крові та нижча частота пульсу ЛГ часто асоціювалися з ожирінням і цукровим діабетом 2 типу [33].

Кіспептини, кодовані геном KiSS1, відомі як потужний стимулятор осі HPG, і будь-яка мутація в гені кіспептину призведе до зниження рівня статевих стероїдів і гонадотропіну. Дослідження показують, що у STZ-індукованих діабетичних щурів рівні мРНК Kiss1 були знижені [33]. Початок і підтримка безпліддя у ссавців пов'язані з рецептором 54, пов'язаним з G-білком (GPR54). Мутація в GPR 54 характеризується відсутністю статевого дозрівання і низьким рівнем гонадотропних гормонів (ЛГ і ФСГ). Прозапальні цитокіни, такі як IL-6 і TNF-, посилюють експресію супресора сигналізації цитокінів 3 (SOCS3), який бере участь у опосередкованій запаленням резистентності до інсуліну в печінці та адипоцитах [34]. SIRT 1 - це ген, пов'язаний з регуляцією кількох захворювань старіння. Цей ген помітно експресується в клітинах підшлункової залози та регулює секрецію інсуліну та запобігає апоптозу. Сучасні дослідження показали, що експресія KiSS1, GPR54 і SIRT1 зменшилася в групі СД, але експресія зросла в групах, які отримували CTE (рис. 10). Збільшення експресії SOCS-3 у групі DM вказує на запальний стан. Першим молекулярним зв’язком між ожирінням і запаленням був TNF-. Отже, підвищений рівень TNF- є показником запалення. Знижений рівень прозапальних цитокінів, таких як TNF- та IL-6, спостерігався в групах, які отримували CTE (рис. 12 і 13).

Дисбаланс між АФК і антиоксидантами призводить до діабетичного стану. Супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT) і глутатіонпероксидаза (GPX) відомі як основні антиоксиданти, відповідальні за підтримку оптимального рівня ROS [35]. З результатів було виявлено, що активність антиоксидантів була значно нижчою в групі СД. Групи, які отримували КТ, показали покращення у виробництві антиоксидантів. Група, яка отримувала RSG, не показала значних покращень антиоксидантної активності (таблиці 6 і 7).

Оксид азоту (NO) відомий як важливий ROS, який сприяє запаленню. Наші дослідження вказують на те, що рівень NO був знижений у групах, які отримували CTE (рис. 11). Результати показали, що вміст аніону супероксиду в спермі щурів з цукровим діабетом значно збільшився, і не було значного поліпшення після введення RSG. Продукція супероксиду була знижена в групах CTE.

Визначення MDA є дуже корисним для оцінки перекисного окислення ліпідів. Перекисне окислення ліпідів - це процес окислення ліпідів, який, нарешті, призводить до пошкодження клітин. MDA утворюється в результаті перекисного окислення ліпідів поліненасичених жирних кислот. Дослідження показують, що рівень MDA корелює з віком і рівнем глюкози в крові натще [36]. Поточне дослідження показало, що КТР покращує перекисне окислення ліпідів у плазмі, яєчках і спермі (табл. 8).

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПОКРАЩЕННЯ СТАТЕВОЇ ФУНКЦІЇ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Висновки

Окислювальний стрес під час діабетичних станів порушує чоловічу репродуктивну систему через порушення сперми та дисфункцію гонад. Cistanche tubulosa – пустельна рослина, яка широко використовується в китайській медицині завдяки своїм фармакологічним ефектам.Ехінакозид (ECH)є основною складовою КТР, що відповідає за його антиоксидантну та протизапальну дію. Наші результати in vitro показали, що ECH відновлює шлях синтезу тестостерону та знижує рівень експресії білка NF-κB і RAGE. ECH ефективно інгібував утворення супероксид-аніону та H2O2 у клітинах Лейдіга. Дослідження in vivo показали, що ECH знижує рівні холестерину, тригліцеридів, TNF- та IL-6. На додаток до цього, експресія мРНК у гіпоталамусі діабетичних щурів була значно покращена. Слід також відзначити, що ECH знижує перекисне окислення ліпідів і покращує резистентність до інсуліну у самців щурів з діабетом. Антиоксидантна активність зросла як у плазмі, так і в яєчках. Таким чином, наші дослідження показали, що ECH забезпечував ефективний захист від репродуктивної дисфункції у STZ-індукованого діабету самців щурів.