Ехінакозид уповільнює клітинне старіння фібробластичних клітин людини MRC-5

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Активний інгредієнт Cistanche: Як діє ехінакозид проти старіння?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

У цьому дослідженні було досліджено вплив ехінакозиду, одного з фенілетаноїдів, виділеного зі стебел цистанхеса сальсового, китайського традиційного фітопрепарату, на фібробластичні клітини MRC-5 легенів людини. Активність проліферації клітин оцінювали за допомогою Alamar Blue, показуючи, що лікування ехінакозидом може сповільнити старіння. Результати проточної цитометрії показують, що ехінакозид може ініціювати клітини у фазі G1 переходити у фазу S та фазу G2 і може покращити деградацію АФК. Результати кометного аналізу показують, що ехінакозид може захищати клітини від пошкодження ДНК, частково з’ясовуючи механізм його впливу. Усі наведені вище результати свідчать про те, що ехінакозид має потенційну дію проти старіння.

Cistanche deserticola має багато ефектів, натисніть тут, щоб дізнатися більше

1. Введення

Нормальні клітини, культивовані in vitro, проліферують протягом обмеженої кількості подвоєннь популяції («межа Хейфліка») і переходять у стадію реплікативного старіння. Старіючі клітини піддаються зупинці росту клітин у фазі G1 і зміні морфології та метаболізму, включаючи збільшення клітин, посилення біогенезу лізосом і експресію вищої активності -галактозидази при рН 6 (асоційована зі старінням -галактозидаза, SA- - -Gal ) (Хейфлік і Мурхед 1961; Дімрі 1995). Накопичення старіючих клітин свідчить про вікове зниженнятканина/органфункції. Щоб отримати доступ до способу затримки або звернення старіння, зусилля з пошуку активних речовин, що запобігають старінню, ніколи не припинялися.Ехінакозидє одним з фенілетаноїдів, виділених із стебелЦистанчі сальса, китайський традиційний фітопрепарат, який має потенційну біологічну активність як антисироватка, так і як антисерумпроти втомиагент (Ден та ін. 2004; Сюн та ін. 1996). Також повідомлялося, що він веде себе in vitro як сильнодіючийбезкоштовнорадикальнийсміттяр(Facino et al. 1995) та експонатинейропротекторнийдіяльностіin vitro та in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Ехінакозид може бути кандидатом на антивікову речовину, а антивікова активність може бути однією з його біологічних властивостей. Таким чином, ми обробили старіючу лінію фібробластичних клітин легенів людського ембріона MRC-5 ехінакозидом, очікуючи, що він може сповільнити або повернути назад старіння.

2. Дослідження та результати

По-перше, ми додали ехінакозид у культуральне середовище, щоб перевірити його вплив на ріст клітин і клітинні цикли. Було помічено, що життєздатність клітин при 48-годинному впливі ехінакозиду помітно зросла порівняно з контролем, оскільки концентрація зростала (рис. 1A), що вказує на те, що ехінакозид сприяє проліферації старіючих клітин. Результати фарбування SA-Gal показали, що рівень SA--Gal явно знизився після обробки ехінакозидом (дані не показані), що свідчить про те, що частина старіючих клітин повернула старіння. Щоб підтвердити, чи справді старіючі клітини стимулювали проліферацію ехінакозидом, було запроваджено аналогічну цитометрію для перевірки зміни фази клітинного циклу старіючих клітин MRC-5 після лікування ехінакозидом. У нашому дослідженні ми спостерігали, що зі збільшенням концентрації ехінакозиду співвідношення клітин у періоді G1 поступово зменшувалося. Навпаки, більше клітин було змушено увійти у S-фазу та G2-фазу (рис. 1B). Накопичення асоційованих зі старінням гетерохроматинових вогнищ (SAHF) є ще одним специфічним біомаркером старіючих клітин (Shay and Wright 2001). Старіючі клітини відображали пунктирні вогнища ДНК, які візуалізували за допомогою фарбування за Хехстом (рис. 1C). Навпаки, клітини MRC-5, оброблені ехінакозидом, мали менше SAHF.

Рівень активних форм кисню (АФК) зростає, коли клітини наближаються до межі Хейфліка (Hutter et al. 2002). Постійна обробка клітин із сублетальними рівнями АФК не лише підвищує рівень продуктів окислювального пошкодження, таких як ліпофусцин (Sitte та ін. 2001), але також спричиняє постійну зупинку росту, що супроводжується активацією p53-інгібітора росту шляху (Туссен та ін. 2000). Таким чином, на клітинному рівні АФК відіграє ключову роль у індукції старіння. Флуоресцентний барвник FL DCFH-DA використовувався для вимірювання вмісту АФК за допомогою аналогічної цитометрії. Показано, що в клітинах, інкубованих з ехінакозидом, порівняно з контролем помітно знижується вміст АФК (рис. 2А). Ці результати свідчать про теехінакозидможе діяти як антиоксидант, знижуючи виробництво АФК або прискорюючи видалення АФК.

Накопичені активні форми кисню (АФК) викликають значне порушення макромолекул у клітинах, включаючи білки, ДНК і теломери (Kovtun et al. 2007). Окислювальні пошкодження ДНК викликають p53-залежну зупинку росту G1 після експресії p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen та ін., 1998) і старіння клітин у нормальних фібробластах людини. Ми використали кометний аналіз, щоб виміряти пошкодження ДНК та її відновлення. Розмір фрагментів ДНК і кількість розривів визначають міграцію та структуру побаченої комети. Вміст ДНК хвоста (добуток довжини хвоста на вміст ДНК хвоста) збільшується з пошкодженням. Наші результати показують, що попередня обробка ехінакозидом може частково сприяти відновленню пошкоджень ДНК, принаймні захистити клітини від пошкоджень ДНК, спричинених H2O2 (рис. 2B). На основі цих фактів ми робимо висновок, що ехінакозид має активність проти старіння принаймні в клітинах MRC-5. Результати нашого дослідження показують, що ехінакозид може зменшувати накопичення АФК, захищати клітини від пошкодження ДНК, сприяти переходу клітин MRC-5 із фази G1 у фази S та G2 і таким чином покращувати проліферацію клітин. Загалом, вплив ехінакозиду на клітини MRC-5 можна розділити на два аспекти: сприяти проліферації клітин і зменшувати накопичення АФК. Хоча точний механізм клітинного старіння все ще невідомий, а мережа регуляції клітинного циклу залишається суперечливою, ми продемонстрували, що ехінакозид може захищати клітини від окисного пошкодження. Тому ми припускаємо цеехінакозидможе бути хорошим кандидатом для регуляції старіння, навіть незважаючи на те, що точний основний механізм залишається відкритим питанням і тривають подальші дослідження.

3. Експериментальний

3.1. Культивування клітин і лікування

Лінія фібробластичних клітин легенів ембріона людини MRC{{0}} (Інститут біохімії та клітинної біології, SIBS, CAS) підтримувалася в модифікованому мінімальному необхідному середовищі (Gibco/BRL) і доповнювалася 10-відсотковою фетальною бичачою сироваткою. Клітини MRC-5 піддаються реплікативному старінню після кількох пасажів клітин, що оцінюється за сповільненням метаболізму та припиненням поділу протягом 7 днів. Усі культури висівали при щільності клітин 104/см2, якщо не вказано інше, і залишали для проліферації без затримок протягом 7 днів. Різні концентрації ехінакозиду додавали за 48 годин до дослідження з розчинником як контролем, якщо не вказано інше. Концентрація ДМСО в культурах становила менше 0,3 відсотка (об./об.). Для обробки H2O2 клітини індукували 250 М H2O2 протягом 12 годин.

3.2. Аналіз рівня виживаності

Клітини культивували та обробляли ехінакозидом на 96-лункових планшетах. Перед виявленням до середовища додавали 10% Alamar BlueTM та інкубували протягом 4 годин. Абсорбцію вимірювали спектрофотометром.

3.3. Аналіз проточною цитометрією

Проточна цитометрія була введена для вимірювання вмісту ДНК і внутрішньоклітинних рівнів ROS з використанням пропідію йодиду та DCFH-DA відповідно. Клітини висівали з щільністю 105 клітин/10 мл клітинного розчину в чашки діаметром 100 мм і доповнювали ехінакозидом протягом 48 годин після посіву клітин. Через 48 годин обробки клітини збирали і промивали в PBS після центрифугування, потім ресуспендували в розчині PBS з 0,1 відсотка РНКази і 50 г/мл йодиду пропідію або культурального середовища, що містить 10 М DCFH-DA протягом 30 хвилин. Потім вміст ДНК або АФК визначали шляхом сортування клітин, що активуються флуоресценцією FL, на системі проточної цитометрії Beckman Coulter. Дані були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення MultiCycle.

3.4. Фарбування по Hoechst

Клітини культивували та обробляли ехінакозидом протягом 48 годин на 96-лунковому планшеті. Середовище видаляли, клітини промивали PBS, потім фіксували 4% формальдегідом у PBS протягом 20 хвилин, потім промивали PBS один раз і фарбували барвником Hoechst протягом 10 хвилин. Знімки були зроблені.

3.5. Одноклітинний гель-електрофорез (кометний аналіз)

Аналіз комети проводився, як повідомлялося (Olive and Banath 2006). Окремі зображення комети аналізували за допомогою програмного забезпечення CometScore. Подяка: Ця робота була підтримана Національною програмою фундаментальних досліджень (проект 973) Китаю (№ 2007CB507406), Національним фондом природничих наук Китаю (№ 30572341) і Фондом медичних наук Цінхуа-Юе-Юен (THYY20070008). ).