Визначення ехінакозиду у водному екстракті цистанхеї за допомогою ВЕРХ

Анотація: МетаДля визначення ехінакозиду у водному екстракті сЦистанхея трав'яна.методиЕхінакозид визначали методом ВЕРХ. Розділення проводили на Inertsil ODS-СП С18 колонка з рухомою фазою, що складається з ацетонітрилу(A)і 0.4% розчин фосфорної кислоти(B), за градієнтомелюція. Довжина хвилі виявлення була встановлена ​​на 333 нм, і температура стовпчика становила 30 градуси. Швидкість потоку становила 1,0мл·хв-1 і об’єм ін’єкції становив 10μL. РезультатиЛінійне відношенняехінакозидв межах концентраціїдіапазон 44.939 7-539.276 4 мкг ·мл- 1 було добре(r = 0.999 8). Відновлення склало 94,59%-105.31%(RSD=2.93%,n = 9). Вміст ехінакозиду у водних екстрактах цистанки трав’яної становив 15,527,7.347,12,267 мг·г-1. 

ВисновокВстановлений метод ВЕРХ з хорошою повторюваністю є точним, простий і здійсненний. Це підходитьдля визначення ехінакозиду вводний екстракт цистанки трави. 

Ключові слова:ВЕРХ;водний екстракт цистанки трави; ехінакозид; визначення змісту

НОВИЙ РОСЛИННИЙ СОСТАВ ДЛЯЖИВЛЕННЯ НИРОК ЯН

Цистанш пустеляце тонізуючий засіб традиційної китайської медицини, який широко використовується в клінічній практиці і відомий як «женьшень пустелі» [1]. TheCistanche deserticolaзаписано у виданні 2015 рКитайська фармакопеяявляє собою висушене м'ясисте стебло з лускатим листямCistanche deserticola YC MaабоCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Він буває теплим, солодким і солоним і повертається до меридіанів нирок і товстого кишечника. Він живить нирковий ян, відновлює есенцію та кров, а також зволожує кишечник і є проносним [2]. «Materia Medica Shen Nong» каже, що він може «тонізувати середину, живити п’ять внутрішніх органів, зміцнювати інь і живити есенцію». Cistanche deserticola в основному містить фенілетаноїдні глікозиди, іридоїди та їх глікозиди, лігнани та їх глікозиди, полісахариди, складноефірні сполуки та алкалоїди [3].

Фенілетаноїдні глікозиди є основними діючими інгредієнтами Cistanche deserticola, серед яких ехінацеазид і вербаскозид є індексними компонентами для ідентифікації та визначення вмісту Cistanche deserticola в китайській фармакопеї. Фармакологічні дослідження [4] показують, що Cistanche deserticola має різні фармакологічні ефекти, такі як проносне, захист печінки, антиостеопороз, антиоксидант, антистаріння та втома. Водний екстракт Cistanche deserticola може стимулювати ген кісткового морфогенетичного протеїну 2 в остеобластах щурів, а також резистентну до тартрату кислу фосфатазу та кістковий кальцій у сироватці крові оваріектомованих мишей.

Експресія генів Smad1, Smad5, трансформуючого фактора росту- тощо в кістковому та кістковому мозку має антиостеопоротичний ефект [5-6].

Ехінацея може сприяти проліферації остеобластів і диференціюванню мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку, культивованих in vitro, в остеобласти [7-9]. В останні роки було опубліковано багато досліджень щодо визначення вмісту ехінакозиду та вербаскозиду в етанольному екстракті Cistanche deserticola та його складових препаратах [10-12], але є кілька звітів щодо визначення вмісту індексних компонентів у Cistanche deserticola водний екстракт. У цьому дослідженні для визначення використовувалася високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).вміст ехінацеазидувводний екстракт Cistanche deserticola.

1 Матеріал

1.1 Інструменти

LC-20AT високоефективний рідинний хроматограф, SPD-20Детектор, SIL-20A автосамплер, CTO-10ASvp колонна піч, LC розчинна робоча станція рідинної хроматографії, Shimadzu Corporation, Японія; Електронні аналітичні ваги MES125P-OCE-DU, Sartorius, Німеччина; SHZ-D (III) циркуляційний водяний багатоцільовий вакуумний насос, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd.; Циркуляційна система охолодження роторного випарника RC2B SO25, роторний випарник RV 10 D S96, IKA, Німеччина; Електрична водяна баня постійної температури DK-S26, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Машина надчистої води серії UPR, Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd.

1.2 Лікарські матеріали та реактиви

Лікарські матеріали Cistanche deserticola були придбані у Guangzhou Lingnan Chinese Medicine Pieces Co., Ltd., номери партій: 1801001, 1806001 та 181001. Це було ідентифіковано як висушене м’ясисте стебло з лускоподібними листками Cistanche deserticola YCMa родини Orobanchaceae. Фармацевт Ту Сінмін із Третьої афілійованої лікарні Університету китайської медицини Гуанчжоу. Зразок зберігається в кімнаті для тестування на наркотики Третьої афілійованої лікарні Університету китайської медицини Гуанчжоу; ехінакозид еталонна речовина, вміст 89,7%, номер партії: 111670-201706 Інституту інспекції харчових продуктів і ліків Китаю; ацетонітрил хроматографічно чистий (Merck, Німеччина); метанол і фосфорна кислота є аналітично чистими (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); вода надчиста.

2 Методи та результати

2.1 Приготування водного екстракту Cistanche deserticola

Візьміть неочищений порошок Cistanche deserticola, додайте 10-кратну кількість дистильованої води, нагрійте та кип’ятіть двічі, щоб екстрагувати, кожен раз протягом 1 години, відфільтруйте, об’єднайте фільтрат і сконцентруйте фільтрат до 0,100 г·мл -1 сирого препарату на роторному випарнику та зберігайте його при 4 градусах для подальшого використання.

2.2 Хроматографічні умови та придатність системи

Хроматографічна колонка: колонка Inertsil ODS SP C18 (150 мм × 4,6 мм, 5 мкм); рухома фаза: ацетонітрил (А)-0.4% розчин фосфорної кислоти (Б), градієнтне елюювання: 0 ~ 5 хв, 17%А; 5 ~ 25 хв, 20% A; 25 ~ 30 хв, 17% A; довжина хвилі детектування: 333 нм; температура колонки: 30 градусів; швидкість потоку: 1,0 мл·хв-1; об'єм ін'єкції: 10 мкл. За цих хроматографічних умов розрив між піками ехінакозиду та суміжних компонентів перевищує 1,5, а теоретичне число планшетів на основі піку ехінакозиду має бути не менше 4, 000. Хроматограма показана на малюнку 1.

Малюнок 1. ВЕРХ-хроматограми ехінакозиду (A) та водного екстракту Cistanche herba (B)

2.3 Приготування розчину

2.3.1 Еталонний розчин

Зважте відповідну кількість еталонного ехінакозиду, точно зважте його, помістіть у мірну колбу на 10 мл, додайте метанол, щоб розчинити його, і приготуйте еталонний розчин, що містить 898,794 мкг ехінакозиду на мл, і зберігайте його при 4 градусах для подальшого використання.

2.3.2 Тестовий розчин

Точно відміряйте 2.0 мл водного екстракту Cistanche deserticola, випаріть насухо на водяній бані, додайте метанол для розчинення, доведіть до об’єму в мірній колбі на 10 мл, добре струсіть, і фільтрують через мікропористу фільтруючу мембрану 0,22 мкм для отримання розчину.

2.4 Дослідження лінійної залежності

Точно відміряйте {{0}}.25, 0,50, 1.00, 2.00, 2,50, 3.00 мл розчину порівняння відповідно до 2.3.1 і помістіть його в мірну колбу на 5 мл, додайте метанол до повного об’єму, добре збовтайте та отримайте розчин порівняння з градієнтною концентрацією 44.939 7, 89.879 4, 179.{ {21}}, 359.517 6, 449.397 0, 539.276 4 ug·mL-1,і фільтрують через мікропористу мембрану 0.22 мкм. Виміряйте відповідно до хроматографічних умов згідно з 2.2 і зафіксуйте площу піку.

Виконайте лінійну регресію з еталонною масовою концентрацією як горизонтальною віссю (X, мкг·мл{{0}}) і площею піку як вертикальною віссю (Y), і отримайте рівняння регресії: Y{{1 }}.0X-32 273.0, r=0.999 8. Результати показали, що ехінакозид мав хорошу лінійну залежність у діапазоні концентрацій 44.939 7 ~ 539.276 4 мкг·мл-1.

2.5 Випробування на точність

Візьміть 539.276 4 мкг ·мл- 1 розчину порівняння, безперервно вводьте та вимірюйте 6 разів відповідно до хроматографічних умов згідно з 2.2, і зафіксуйте площу піку. RSD площі піку ехінакозиду становив 1,81%, що свідчить про хорошу точність приладу.

2.6 Перевірка стабільності

Точно відміряйте 2.0 мл водного екстракту Cistanche deserticola, випаріть насухо на водяній бані, розчиніть у метанолі, розведіть до 10 мл мірної колби, добре струсіть, відфільтруйте 0 .22 мкм мікропористої фільтрувальної мембрани, введіть і виміряйте через 0, 2, 4, 8, 12 і 24 години відповідно до хроматографічних умов у 2.2 і зафіксуйте площу піку. Результати RSD площі піку ехінакозиду становив 1,16%, що вказує на те, що досліджуваний розчин мав добру стабільність протягом 24 годин.

2.7 Перевірка повторюваності

Точно відміряйте 6 порцій по 2.0 мл водного екстракту Cistanche deserticola, приготуйте паралельно 6 порцій досліджуваного розчину згідно з методом у 2.3.2, введіть і виміряйте їх відповідно до хроматографічних умов у 2.2, і записати площу піку. Результати RSD масової концентрації ехінакозиду становив 1,28%, що свідчить про хорошу повторюваність методу.

2.8 Тест на відновлення зразка

Точно відміряйте 9 порцій по 1.0 мл водного екстракту Cistanche deserticola, додайте 0.8, 1.0 і 1,2 мл розчину порівняння (1,552 мг·мл{{11). }}) відповідно, випарюють насухо на водяній бані, розчиняють у метанолі та розводять у мірній колбі на 10 мл; добре струсіть, фільтруйте за допомогою мікропористої фільтрувальної мембрани 0,22 мкм, щоб отримати високу, середню та низьку концентрацію досліджуваного розчину, приготуйте 3 порції кожної концентрації паралельно та виміряйте відповідно до хроматографічних умов згідно з 2.2, зафіксуйте площу піку та обчисліть відновлення зразка. Результати наведені в таблиці 1.

2.9 Визначення вмісту зразка

Точно відміряйте 2.0 мл водного екстракту Cistanche deserticola на 3 порції, випаріть насухо на водяній бані, розчиніть у метанолі, розведіть до 10 мл у мірній колбі, добре струсіть, відфільтруйте за 0,22 мкм мікропористої фільтрувальної мембрани та визначте відповідно до хроматографічних умов згідно з 2.2, зафіксуйте площу піку та обчисліть вміст ехінакозиду. Результати наведені в таблиці 2.