Кон'югат дендример-тесаглітазар індукує зміну фенотипу мікроглії та посилює -амілоїдний фагоцитоз† Частина 3
Jul 15, 2024
D-Tesa збільшив експресію ферментів, відповідальних за видалення патогенних білків
Фермент, що руйнує інсулін (Ide) і матриксну металопротеазу 9 (MMP9), є ферментами, що виділяються мікроглією, що руйнує позаклітинний -амілоїд і -синуклеїн.71,72 Лікування D-Tesa значно збільшило експресію Ide в 3.1-рази (p < 0.001) із тенденцією до збільшення експресії MMP9 (1.8-кратне збільшення, p=0.057) порівняно з контролем, який отримував лише LPS (рис. 6A та B).
В останні роки все більше досліджень показують, що існує тісний зв’язок між ферментами, що розкладають інсулін, і пам’яттю. Це відкриття дає нам цінні підказки для подальшого вивчення механізму формування та підтримки пам’яті.
Фермент, що руйнує інсулін, є важливим ферментом, основною функцією якого є розщеплення інсуліну для підтримки балансу цукру в крові. Однак нещодавні дослідження показали, що фермент, що руйнує інсулін, відіграє не лише метаболічну роль, але й безпосередньо впливає на ріст і відновлення нейронів у мозку, а також відіграє важливу роль у підтримці пам’яті.
Багато досліджень показали, що чим вищий рівень ферменту, що руйнує інсулін, тим краще пам'ять. Це пояснюється тим, що ферменти, що розкладають інсулін, можуть сприяти росту та відновленню нейронів, тим самим покращуючи здатність мозку до навчання та пам’яті. Крім того, ферменти, що руйнують інсулін, також можуть сприяти з’єднанню між нейронами, тим самим посилюючи асоціацію та збереження пам’яті.
Важлива роль ферментів, що розкладають інсулін, у пам’яті широко використовується в галузі клінічної медицини. Дослідники виявили, що шляхом вдихання ферментів, що руйнують інсулін, можна не лише покращити пам’ять, але й когнітивні здібності та симптоми депресії.
Коротше кажучи, зв’язок між ферментами, що розкладають інсулін, і пам’яттю є дуже важливою областю, яка дає нам цінні підказки для вивчення біологічного механізму пам’яті. Майбутні дослідження продовжуватимуть вивчати функцію та роль ферментів, що руйнують інсулін, допоможуть нам краще зрозуміти механізм формування та зберігання пам’яті та забезпечать кращу основу для покращення здатності людського мозку до навчання та пам’яті. Можна побачити, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад, підвищувати рівні ацетилхоліну та факторів росту, які дуже важливі для пам’яті та навчання. Крім того, Cistanche також може покращити кровотік і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість живлення та енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.
Натисніть «Знай, як покращити пам’ять».
Вільний Tesa значно збільшив експресію Ide 2-раз (p=0.011) і незначно збільшив MMP92-раз (p=0.35) (рис. 6A). і B). Мікроглія М2 при нейродегенеративних захворюваннях може видаляти -амілоїд, -синуклеїн та інші патогенні білки шляхом ферментативного розщеплення або фагоцитозу, а D-Tesa посилює регуляцію білків, які беруть участь у цих процесах (тобто Ide та MMP9).71–73
Ідеекспресія знижується при патології AD і PD і, як відомо, посилюється агоністами PPAR, що узгоджується з нашими результатами.
71,72 Функціонально було показано, що лише 2-кратне збільшення рівнів Ide зменшує накопичення амілоїду та загибель нейронів in vivo.74,75 Таким чином, 3-кратне збільшення Ide, яке спостерігалося D-Tesa, і 2-кратне збільшення Ide за допомогою freeTesa може бути терапевтично ефективним in vivo.
D-Tesa посилює фагоцитоз -амілоїду
CD36 є мікрогліальним рецептором-акцептором, який сприяє фагоцитозу та деградації -амілоїду.73 Його зниження регуляції при AD призводить до зменшення видалення -амілоїду, але активація PPAR посилює його активацію.
Як D-Tesa, так і вільний Tesa значно підвищили рівні експресії CD36 порівняно з клітинами, які зазнали впливу лише на LPS (p < 0.0001 проти p < 0,005 для D-Tesa та вільного Tesa , відповідно), але D-Tesa був набагато ефективнішим, ніж вільний Tesa (6-кратне збільшення порівняно з 2.8-кратне збільшення для D-Tesa та вільного Tesa, відповідно, p < 0,0005) (рис. 6C) ).
Наші результати узгоджуються з попередніми дослідженнями з піоглітазоном (іншим агоністом PPAR), які показали, що посилений мікрогліальний фагоцитоз -амілоїду відбувається через PPAR та CD36-залежний механізм.73
Щоб дослідити, чи корелює активація CD36 від лікування D-Tesa з підвищеною фагоцитарною здатністю цих клітин, ми провели аналіз функціонального фагоцитозу β-амілоїду. 73
Коротко кажучи, після обробки клітин, як ми робили в попередніх аналізах in vitro, ми нанесли на клітини флуоресцентно мічений -амілоїд1–42 протягом двох годин, промили клітини, а потім провели проточну цитометрію, щоб дослідити ступінь поглинання клітинами -амілоїду. D-Tesa збільшив як відсоток клітин, які фагоцитували β-амілоїд, так і середню кількість α-амілоїду, інтерналізованого на клітину (рис. 7A і B).
Навпаки, вільний Tesa не призвів до покращення фагоцитозу -амілоїду. Кращий ефект D-Tesa порівняно з Tesa, ймовірно, пояснюється покращеною інтерналізацією клітин, що забезпечується кон’югацією дендримеру.
Це узгоджується з попередньою роботою, яка продемонструвала, що понад 95% клітин BV2, оброблених флуоресцентно міченим G4-PAMAM-OH, інтерналізувати дендример протягом тридцяти хвилин і продовжували інтерналізувати дендример протягом щонайменше 24 годин.76
Подібним чином, кон’югація маломолекулярного міноцикліну з флуоресцентно міченим G4-PAMAM-OH продемонструвала, що 99% клітин BV2 інтерналізували флуоресцентно мічений кон’югат дендример–лікарський засіб протягом 3 годин.26 Вони також показали, що кон’югат значно знижує рівень оксиду азоту. до вільного препарату після обробки клітин BV2 LPS, що відповідає нашим результатам.
Клітини, оброблені D-тезафагоцитованим у 19-рази амілоїдом, ніж контрольні клітини, оброблені ЛПС (p < 0.001), що можна порівняти зі збільшенням у 2.5-рази -амілоїдний фагоцитоз первинними мікрогліальними клітинами щурів, оброблених піоглітазоном, про який повідомляли Яманака та ін.73 Трохи вищий ступінь -амілоїдного фагоцитозу згідно з попереднім дослідженням міг бути або тим, що вони не обробляли свої клітини ЛПС, як ми, або тим, що первинна мікроглія експресує PPAR на вищий рівень, ніж клітини BV2, використані в цьому дослідженні.77
Таким чином, доза D-Tesa, нижча за оцінену в експериментах in vitro в нашому дослідженні, ймовірно, може бути ефективною для досліджень in vivo та на людях, оскільки відомо, що клітини BV2 експресують PPAR на нижчих рівнях, ніж первинна мікроглія.77
Мікроглія була залучена до багатьох нейродегенеративних захворювань, і BBB запобіг багатьом препаратам, які можуть модифікувати фенотип мікроглії з прозапального, нейротоксичного фенотипу M1 на протизапальний, нейропротекторний фенотип M2, від досягнення терапевтичних рівнів у мозку.5,6, 14,15
Наприклад, два агоністи PPAR, піоглітазон і розиглітазон, кожен досліджувався у фазі III клінічних випробувань на хворобу Альцгеймера через їхню здатність змінювати фенотип мікроглії, але, ймовірно, не вдалося через поганий транспорт через BBB.13,14 Таким чином, існує клінічний інтерес до зміни фенотип мікроглії при нейродегенеративних захворюваннях.
Такий підхід вимагає доставки препарату до мікроглії на достатньому рівні, щоб викликати відповідь. З цією метою було показано, що дендримери G4-OH-PAMAM доставляють ліки до мікроглії на багатьох моделях тварин після системної ін’єкції, і, як наслідок, наразі вони оцінюються в клінічних випробуваннях для лікування ccTLD (NCT03500627) і важкої форми COVID-19. -19 асоційоване запалення (NCT04458298).18–28
Щоб поєднати сприятливий ефект зміни фенотипу мікроглії зі здатністю доставляти ліки до мікроглії, ми кон’югували тесаглітазар (PPAR/подвійний агоніст) із дендримером G4-OH-PAMAM (рис. 1–3). Ми продемонстрували, що D-Tesa здатний змінювати фенотип мікроглії M1 у бік фенотипу M2 (рис. 4 і 5), що призводить до зменшення секреції шкідливих активних форм кисню.
Крім того, ми продемонстрували, що мікроглія, оброблена D-Tesa, посилює експресію ферментів, які руйнують патологічні білки, такі як -синуклеїн і -амілоїд, а також посилює фагоцитоз -амілоїду у функціональному аналізі (рис. 6 і 7).
Хоча ми не надаємо даних, які б демонстрували здатність D-Tesa обходити ГЕБ і накопичуватися в мікроглії, ми раніше показали, що лікарські кон’югати G4-OH-PAMAM із подібним навантаженням, розміром і дзета-потенціалом здатні проходити через порушення ГЕБ та накопичення в мікроглії після внутрішньовенного введення.26,36,52
Ці результати підтверджують подальшу розробку D-Tesa для лікування багатьох неврологічних захворювань. У той час як ми зосереджуємося на хворобах Альцгеймера та Паркінсона в цій статті, D-Tesa має потенціал для клінічного перенесення на численні неврологічні розлади. Через подібну роль мікроглії в патології багатьох нейродегенеративних захворювань агоніст PPAR піоглітазон також досліджувався або зараз досліджується у фазі II клінічних випробувань для хвороби Паркінсона, АЛС, 79 адреномієлонейропатії (NCT03864523), розсіяного склерозу (NCT03109288) і гематоми. дозвіл при внутрішньомозковому крововиливі (NCT00827892).
Якщо ці клінічні випробування також зазнають невдачі через погану доставку піоглітазону через BBB, D-Tesa зможе подолати цю перешкоду в доставці та лікувати пацієнтів із цими захворюваннями.
Інші групи використовували наночастинки для покращення доставки агоністів PPAR до макрофагів, але вони не намагалися доставити ці агоністи до мікроглії. Osinski та ін. продемонстрували, що ліпосоми, навантажені Tesa, були здебільшого поглинені макрофагами у вісцеральному білому жирі в чоловічій моделі ожиріння з дефіцитом лептину.80
Крім того, вони продемонстрували, що ліпосоми, навантажені Tesa, не змінюють експресію маркера M1 Mcp-1, але підвищують експресію маркера M2 Arg1, тоді як лікування вільним Tesa зменшує загальну кількість макрофагів M1 та експресію Mcp{{6 }} і не збільшив експресію Arg1.
Накашіро та ін. використовували наночастинки полі(молочної спільно гліколевої кислоти) (PLGA) для доставки піоглітазону (агоніста PPAR) до макрофагів у контексті атеросклерозу.81
In vivo вони продемонстрували, що PLGA-піоглітазон знижує рівень імунних клітин у крові. У первинних макрофагах кісткового мозку, оброблених LPS та інтерфероном, вони виявили, що PLGA-піоглітазон підвищує IL-4 та IL-10 (маркери M2) і не знижує рівні IL-6 або TNF.
Їх висновки подібні до наших; Маркери М2 підвищувалися під час лікування агоністами наночастинок PPAR, тоді як рівні IL-6 і TNF- не знижувалися. Ді Масколо та ін. використовували наночастинки PLGA-полівінілового спирту для доставки розиглітазону (іншого агоніста PPAR).82
In vitro вони продемонстрували, що їхні комплекси наночастинок-ліків знижують експресію iNOS, TNF- та IL-1 у макрофагах кісткового мозку. Вони попередньо обробили свої клітини препаратом із наночастинок перед стимуляцією LPS, тоді як ми попередньо обробили клітини LPS перед обробкою D-Tesa, що могло бути причиною того, що ми не спостерігали зниження TNF- та IL-1, хоча ми також спостерігали зниження експресії iNOS.
Висновок
Наразі не існує терапії, яка б змінювала патологію багатьох нейродегенеративних захворювань, і в міру того, як населення продовжує старіти, поширеність і вартість лікування цих захворювань продовжуватимуть зростати, що підкреслює нагальну потребу в розробці рішення. Останнім часом прозапальна мікроглія M1 є критичною в патології багатьох нейродегенеративних захворювань.
Згодом здатність доставляти ліки через гематоенцефалічний бар’єр, що може індукувати зміну фенотипу «М1 на М2» у мікроглії, має терапевтичний потенціал для багатьох захворювань, особливо хвороб Альцгеймера та Паркінсона.
D-Tesa був розроблений для доставки препарату, що індукує M1 до M2, до мікроглії після системного введення, щоб зменшити мікрогліальну секрецію нейротоксичних речовин, а також індукувати протизапальний стан, який посилює деградацію та фагоцитоз патогенних білків у мозку. Ми успішно синтезували D-Tesa за допомогою високоефективного підходу хімії кліків.
Лікарський засіб приєднується до дендримера за допомогою ефірного зв’язку, який розщеплюється внутрішньоклітинно в лізосомальних умовах, при цьому приблизно 60% Tesa вивільняється в перші 48 годин в лізосомальних умовах.
Було показано, що D-Tesa перевершує Tesa in vitro в індукуванні зміни фенотипу M1 до M2a/M2b/M2c, що призвело до зниження секреції оксиду азоту, посилення експресії ферментів, що розкладають -синуклеїн і -амілоїд, і посилення фагоцитозу -амілоїду.
Таким чином, D-Tesa поєднує корисні властивості доставки дендримера з властивостями перемикання M1 на M2 Tesa. Завдяки загальній ролі мікроглії та загальній терапевтичній користі від індукції зміни фенотипу M1 до M2 D-Tesa має потенціал для лікування багатьох неврологічних розладів, якщо його вводити на правильній стадії прогресування захворювання.
Авторські внески
LD, AS, KL, RS, SK і RMK концептуалізували експерименти. LD, AS та RS виконали синтез та характеристику кон’югату дендример–лікарська речовина. LD, KL і JJ провели клітинні експерименти. ЛД і К. Л. проводив статистику. LD та AS написали рукопис, і всі автори відредагували рукопис.
Конфлікти інтересів
RMK і SK є співавторами використання дендримеру з гідроксильними кінцями для адресної доставки до мікроглії при неврологічних захворюваннях, а також патенти, пов’язані з технологією дендримерів, описаною в цій статті.
Вони є співзасновниками компаній Asvattha Therapeutics, Orpheris Inc. і RiniSight Inc., які ведуть клінічний розвиток платформи. SK і RMK є членами правління AsvatthaTherapeutics Inc. RS наразі працює в AsvatthaTherapeutics і володіє акціями компанії; твір Р. С. виконав для цієї статті було зроблено до того, як він приєднався до Ашваттхи. Конфліктом інтересів керує Університет Джона Хопкінса.
Подяки
Ми хотіли б подякувати Елізабет Сміт Хурі за корисні обговорення експериментів in vitro. Цей проект фінансувався Фондом видатних професорів імені Паца від Джонса Гопкінса та NICHD (номер гранту HD076901) (RMK). Ми дякуємо Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope та Core Module (номер гранту EY001865) за доступ до проточного цитометра Sony.
Ми дякуємо Servier Medical Arts за використання їхньої колекції зображень (http://smart.servier.com/), яка ліцензована відповідно до Creative Common Attribution 3.0 GenericLicense, яку було змінено, щоб зробити графічні анотації.
Список літератури
1 К. Л. Гуч, Е. Прахт і А. Р. Боренштейн, Тягар неврологічних захворювань у Сполучених Штатах: підсумковий звіт і заклик до дії, Енн. нейрологія, 2017, 81, 479–484.
2 Дж. Л. Каммінгс, Т. Морсторф і К. Чжун, Конвеєр розробки ліків від хвороби Альцгеймера: мало кандидатів, часті невдачі, Alzheimer Res. Терм., 2014, 6, 37.
3 П.-П. Лю, Ю. Се, X.-Y. Мен і Дж.-С. Канг, Історія та прогрес гіпотез і клінічних випробувань хвороби Альцгеймера, Цілеспрямована термообробка сигналу, 2019, 4, 1–22.
4 C. Soto і S. Pritzkow, Неправильне згортання білків, агрегація та конформаційні деформації при нейродегенеративних захворюваннях, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332–1340.
5 VH Perry and C. Holmes, Microglial praiming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217–224.
6 Y. Tang і W. Le, Диференціальна роль M1 і M2Microglia в нейродегенеративних захворюваннях, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181–1194.
7 MW Salter і B. Stevens, Мікроглія виступає як центральна учасника захворювань мозку, Nat. мед., 2017, 23, 1018–1027.
8 S. Krasemann та ін. Шлях TREM2-APOE керує транскрипційним фенотипом дисфункціональної мікроглії при нейродегенеративних захворюваннях, Імунітет, 2017, 47, 566–581.e9.
9 Q. Zhao, et al., Подібні до антидепресантів ефекти піоглітазону в моделі миші з хронічним легким стресом пов’язані з PPAR-опосередкованою зміною фенотипів активації мікроглії, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.
10 Л. Вен та ін., Поляризація мікроглії до фенотипу M2 у гама-залежному рецепторі, активованому пероксисомним проліфератором, послаблює пошкодження аксонів, спричинене черепно-мозковою травмою у мишей, J. Neurotrauma, 2018, 35, 2330–2340.
11 W. Cai та ін. Рецептор, що активується проліфератором пероксисом (PPAR): головний воротар при пошкодженні та відновленні ЦНС, Прог. Neurobiol., 2018, 163–164, 27–58.12 B. Brakedal та ін., Використання глітазону, пов’язане зі зниженим ризиком хвороби Паркінсона, Mov. Disord., 2017, 32, 1594–1599.
For more information:1950477648nn@gmail.com
