Фенілетаноїдні глікозиди Cistanche Tubulosa індукують апоптоз у клітинах гепатоцелюлярної карциноми H22 як через зовнішні, так і через внутрішні сигнальні шляхи

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li та Jinyao Li

Анотація

фон:Цистанка трубчаста(Schenk) R. Wight — це традиційна китайська медицина, яка паразитує на коренях рослини тамарикс і використовується для лікування чоловічої імпотенції, безпліддя, слабкості організму та як тонізуючий засіб. Однак його протипухлинний ефект на гепатоцелюлярну карциному все ще невловимий. Тут ми досліджували протипухлинну діюC. tubulosa фенілетаноїдні глікозиди(CTPG) на клітинах гепатоцелюлярної карциноми H22 як in vitro, так і in vivo та його механізми. Методи: Морфологію, життєздатність, апоптоз, клітинний цикл і потенціал мітохондріальної мембрани (Δψm) клітин H22 аналізували за допомогою інвертованої мікроскопії, МТТ-аналізу та проточної цитометрії відповідно. Експресію та активацію білків на шляху апоптозу виявляли Вестерн-блоттингом. Протипухлинний ефект in vivo оцінювали на мишачій моделі пухлини, створеної з використанням самців мишей Kunming. Результати: лікування CTPG значно пригнічувало ріст клітин H22 залежно від дози та часу, що корелювало з посиленням апоптозу та зупинкою клітинного циклу на фазах G0/G1 та G2/M. Крім того, хромосомну конденсацію спостерігали в клітинах H22, оброблених CTPG. Лікування CTPG значно збільшило співвідношення Bax/Bcl-2, зменшило Δψm і посилило вивільнення цитохрому c. Рівні розщепленої каспази-8 та каспази-9 як у зовнішньому, так і у внутрішньому сигнальних шляхах були значно збільшені, що послідовно активувало каспазу-7 та -3 для розщеплення PARP. Нарешті, CTPG (Цистанхеtubulosaфенілетаноїдні глікозиди) пригнічував ріст клітин H22 у мишей і покращував відсоток виживання пухлинних мишей. Висновки: ці результати свідчать про те, що CTPG пригнічує ріст клітин H22 як через зовнішній, так і через внутрішній шляхи апоптозу.

Фон

Рак печінки посідає шосте місце за захворюваністю на рак і четверте місце за кількістю смертей від раку у всьому світі. Крім того, вона посідає четверте місце за захворюваністю на рак і перше місце за смертністю від раку в країнах з низьким соціально-демографічним індексом [1]. У Китаї рак печінки є третьою основною причиною смерті від раку в 2015 році [2]. Понад 90 відсотків випадків первинного раку печінки у світі становлять гепатоцелюлярну карциному (ГЦК) [3]. В даний час резекція печінки є основним варіантом терапії ГЦК. Проте менше 30 відсотків пацієнтів із ГЦК відповідали критеріям лікувальної резекції печінки, а загальна 5--річна виживаність все ще залишається лише 35-50 відсотками через високу частоту рецидивів [4, 5]. ]. Доступність варіантів лікування для пацієнтів із ГЦК середнього та прогресуючого ступеня дуже обмежена. Сорафеніб, молекулярно-цільовий препарат, був схвалений FDA як засіб першої лінії лікування прогресуючого ГЦК. Однак сорафеніб продовжує виживання лише приблизно на 3 місяці, а рівень відповіді становить менше 4 відсотків [6, 7]. Необхідно терміново розробити нові ліки або стратегії проти ГЦК. Традиційна китайська медицина (ТКМ) окремо або в поєднанні з іншими стратегіями була використана для лікування ГЦК і продемонструвала клінічні переваги, включаючи подовження часу виживання, покращення якості життя, зменшення побічних реакцій тощо [8, 9].Цистанхе, різновид ТКМ, виконує різні біологічні функції, наприкладантиоксидантна, протизапальна, проти старіння,та нейропротекцію [10, 11]. Фенілетаноїдні глікозиди вважаються основними активними компонентамиЦистанхе, які мають різноманітну дію, включаючи антиоксидантну, протизапальну, гепатопротекцію та нейропротекцію [12–15]. Про це повідомляє наша групаФенілетаноїдні глікозиди Cistanche tubulosa(CTPG) міг індукувати апоптоз у клітинах меланоми B16-F10 і пригнічувати ріст пухлин у мишей [16]. У цьому дослідженні ми вимірювали протипухлинну дію CTPG на клітини HCC H22 як in vitro, так і in vivo та досліджували її механізми. Ми виявили, що CTPG індукує апоптоз у клітинах H22 як через зовнішні, так і через внутрішні сигнальні шляхи та пригнічує ріст пухлин H22 у мишей.

методи

Лінія клітин

Клітини гепатоцелюлярної карциноми миші H22 були отримані з Синьцзянської ключової лабораторії біологічних ресурсів і генетичної інженерії Сіньцзянського університету (Урумчі, Сіньцзян, Китай) і культивувалися в середовищі RPMI 1640 (Gibco) з додаванням 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мкг/мл. стрептоміцину та 10% термоінактивованої фетальної бичачої сироватки (Gibco) при 37 градусах у зволоженій атмосфері з 5% CO2.

МТТ аналіз

CTPG було придбано у Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Китай), а основні сполуки CTPG були кваліфіковані та кількісно визначені за допомогою високоефективної рідинної хроматографії [16]. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою 3- (4, 5-диметилтіазол-2-іл)-2, 5-дифенілтетразолію броміду (МТТ) (Sigma, St. Louis, MO , США). Клітини H22 інокулюють у 96-лункові планшети з щільністю 2 × 104 клітини в 100 мкл середовища на лунку та культивують при 37°. Через 24 години клітини обробляли різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) або 0,3 відсотка ДМСО (що дорівнює 400 мкг/мл CTPG) протягом 24, 48 і 72 годин відповідно. . Після центрифугування при 1000 об/хв протягом 7 хв супернатант відкидали і до кожної лунки додавали 100 мкл розчину МТТ (5 мг/мл у PBS). Планшети інкубували при 37°С протягом 4 годин і додавали 100 мкл ДМСО для розчинення утворених кристалів формазану. Значення OD490 були виявлені за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів 96- (Bio-Rad Laboratories, Каліфорнія, США). Життєздатність клітин розраховували за формулою: Життєздатність клітин (відсотки)=(ОЗ, оброблена/З, не оброблена) × 100 відсотків.

Виявлення апоптозу

Клітини H22 обробляли різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) або 0,3% ДМСО протягом 24 годин, а потім фарбували аннексином V FITC/ Propidium iodide (PI) Apoptosis Detection Kit (YEASEN, Китай) згідно інструкції виробника. Зразки аналізували методом проточної цитометрії (BD FACSCalibur, США).

Виявлення мембранного потенціалу мітохондрій

Клітини H22 обробляли різними концентраціями CTPG (0, 200 і 400 мкг/мл) протягом 24 годин, а потім фарбували проникним для мембрани барвником JC-1 (Beyotime, Китай) протягом 20 годин. мін при 37 градусах. Після двічі промивання буфером JC-1 зразки ресуспендували в 300 мкл буфера JC-1 і аналізували за допомогою проточної цитометрії (BD FACSCalibur, США).

Аналіз клітинного циклу

Клітини H22 інокулюють у культуральні чашки розміром 6 0 мм і обробляють різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) або 0,3% ДМСО для 24 години Усі клітини збирали та двічі промивали PBS. Клітини фіксували в 70-відсотковому крижаному етанолі при -20 градусах протягом 2 годин і двічі промивали PBS, потім ресуспендували в 300 мкл буфера для фарбування йодиду пропідію/РНКази (BD Biosciences). Через 10 хвилин при кімнатній температурі зразки відбирали методом проточної цитометрії (BD FACSCalibur, США) і розподіл клітинного циклу аналізували за допомогою програмного забезпечення ModFit LT 3.0.

Фарбування Hoechst 33,258

Морфологічні зміни клітинних ядер H22 аналізували за допомогою фарбування проникною для мембрани ДНК-зв'язувальним барвником Hoechst 33,258. Клітини H22 висівали в 6-лунковий планшет у концентрації 1 × 105 клітин/лунку в 2 мл середовища. Після 60-70-відсоткового злиття клітини обробляли CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) протягом 24 годин. Клітини збирали та фіксували 4-відсотковим крижаним параформальдегідом при 4 градусах протягом 10 хвилин. Після промивання PBS клітини фарбували Hoechst 33,258 (Beyotime, Китай) при 4 градусах протягом 10 хвилин. Зразки спостерігали за допомогою інвертованого флуоресцентного мікроскопа (Nikon Eclipse Ti-E, Японія).

Вестерн-блот

Анти-каспаза-3, анти-розщеплена каспаза-3, анти-Bcl-2 і анти-Bax були придбані у Beyotime Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Анти-каспаза-7, анти-розщеплена-каспаза-7, анти-каспаза-8, анти-розщеплена-каспаза-8, анти-каспаза-9, анти -розщеплена каспаза-9, анти-PARP, анти-розщеплений PARP, анти-мишачий IgG-HRP і анти-кролячий IgG-HRP були придбані в Cell Signaling Technology. Анти- -актин був придбаний у Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Пекін, Китай).

Клітини H22 обробляли різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) або 0,3% ДМСО протягом 24 годин. Клітини збирали та лізували розчином для лізису клітин RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) протягом 30 хвилин на льоду. Зразки центрифугували (12,000 г протягом 15 хвилин при 4 градусах), щоб зібрати супернатант, і концентрацію білка вимірювали за допомогою набору BCA (Thermo Fisher Scientific, США). Рівну кількість білка в кожному зразку виділяли за допомогою 12% SDS-PAGE і переносили на мембрани PVDF (Biosharp, Китай). Після блокування буфером TBST, що містив 5 відсотків знежиреного молока, мембрани інкубували з відповідними первинними антитілами та вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону (HRP), відповідно. Після промивання TBST цільові білки були виявлені за допомогою набору для аналізу ECL (Beyotime, Китай).

Тварини та етика

Самці мишей Куньмін віком 6-8 тижнів були придбані в Лабораторному центрі тварин Сіньцзянського медичного університету (Урумчі, Сіньцзян, Китай). Мишей утримували у стандартній кімнаті для тварин із контрольованою температурою та світловими циклами Сіньцзянського університету. Усі дослідження на тваринах проводилися відповідно до вказівок Комітету з догляду та використання тварин Сіньцзянського університету. Протокол був схвалений Комітетом з етики експериментів на тваринах Синьцзянської ключової лабораторії біологічних ресурсів і генної інженерії (BRGE-AE001) Сіньцзянського університету.

Дослідження пухлини на мишах

Для індукції мишачої моделі пухлини самцям мишей Kunming підшкірно вводили 1 × 106 клітин H22 в 100 мкл PBS у правий бік. Через 3 дні мишей випадковим чином розділили на 3 групи (7 мишей на групу). Контрольній групі вводили 0,1 мл ДМСО підшкірно навколо пухлини. Групам CTPG-200 і CTPG- 400 підшкірно вводили 200 або 400 мг/кг CTPG в 0,1 мл ДМСО навколо пухлини. Мишей лікували кожні 2 дні протягом 21 дня. Розміри пухлини вимірювали за допомогою штангенциркуля до 25 днів, а об’єм пухлини розраховували за формулою: об’єм пухлини (мм3)=(довжина×ширина2)/2. Через 25 днів виживаність пухлинних мишей контролювали щодня до кінця цього дослідження.

Статистичний аналіз

Статистичну значущість розраховували шляхом одностороннього аналізу дисперсії між групами лікування та контрольною групами. Усі дані виражали як середнє ± стандартне відхилення (SD). p < 0.05="" вважався="" статистично="">

Результати

CTPG знижував життєздатність клітин H22 in vitro

Щоб дослідити протипухлинну дію CTPG на HCC, клітини H22 обробляли різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) in vitro. Через 24 години морфологію клітин H22 спостерігали за допомогою інвертованого мікроскопа. Ми виявили, що морфологія клітин H22 була різко змінена під час обробки CTPG. Зі збільшенням концентрації CTPG клітини ставали маленькими та круглими, а кількість клітин також значно зменшувалася (рис. 1а). Аналіз MTT використовували для аналізу життєздатності клітин H22 після обробки CTPG протягом 24, 48 і 72 годин відповідно. CTPG значно знижував життєздатність клітин H22 залежно від дози та часу (рис. 1b). CTPG при 300 мкг/мл досяг найкращої швидкості інгібування (рис. 1c). Значення IC50 CTPG для клітин H22 становлять 236 мкг/мл через 24 години та 169,8 мкг/мл через 48 годин.

CTPG індукував апоптоз у клітинах H22

Щоб дослідити, чи опосередковується зниження життєздатності клітин H22 індукцією апоптозу, клітини H22 обробляли різними концентраціями CTPG (0, 100, 200, 300 і 400 мкг/мл) протягом 24 годин і фарбували. з PI та аннексином V. Результати проточної цитометрії показали, що CTPG істотно індукував апоптоз клітин H22 (включаючи ранній і пізній апоптоз) залежно від дози (рис. 2а). Хоча висока доза CTPG також значно збільшила некроз клітин H22, некроз відіграє незначну роль у пригніченні росту клітин H22 через його меншу частку (8,3 відсотка) порівняно з апоптозом (52,6 відсотка). Крім того, загальні білки клітин H22 виділяли після обробки CTPG і виявили експресію антиапоптотичної В-клітинної лімфоми 2 (Bcl-2) і проапоптозного BCL-2-асоційованого X білка (Bax). Вестерн-блот. Дані сканування в градаціях сірого показали, що рівні експресії Bax і Bcl-2 були підвищені та знижені відповідно. Співвідношення Bax/Bcl-2 значно збільшилося (рис. 2b). Ці результати свідчать про те, що CTPG індукує апоптоз у клітинах H22.

CTPG індукує хромосомну конденсацію та зупинку клітинного циклу в клітинах H22

Повідомлялося, що пошкодження ДНК і зупинка клітинного циклу, викликані лікарськими засобами, можуть пригнічувати ріст пухлинних клітин і викликати апоптоз пухлинних клітин [17, 18]. Щоб виявити морфологію ядер у клітинах H22 після обробки CTPG протягом 24 годин, клітини H22 пофарбували Hoechst 33,342 і спостерігали за допомогою інвертованої флуоресцентної мікроскопії. Клітини, оброблені CTPG, показали дозозалежне збільшення яскраво конденсованого хроматину ядер, тоді як необроблені клітини показали однорідно пофарбовані ядра (рис. 3a). Розподіл клітинного циклу в клітинах H22 додатково аналізували за допомогою фарбування PI після обробки CTPG протягом 24 годин. Як показано на рис. 3b, лікування CTPG значно збільшило частку клітин G0/G1- і G2/M-фази та значно зменшило частку клітин S-фази, що свідчить про те, що CTPG індукує G 0/G1 і G2/M фаза зупинки в клітинах H22. Висока доза CTPG також значно збільшила частку субклітин G1.

CTPG знижував потенціал мітохондріальної мембрани та збільшував вивільнення цитохрому c

Мітохондріально-залежний шлях відіграє важливу роль в індукції апоптозу [19, 20]. Зміни потенціалу мітохондріальної мембрани (Δψm) можна контролювати за допомогою фарбування JC-1 через те, що агрегат JC-1 (червона флуоресценція) може розпадатися на мономер (зелена флуоресценція) зі зменшенням Δψm [21]. Після обробки CTPG протягом 24 годин клітини H22 фарбували барвником JC- 1. Дані проточної цитометрії показали, що червона флуоресценція в каналі FL-2 і зелена флуоресценція в каналі FL-1 були значно зменшені та збільшені після обробки CTPG. Частка клітин PE− FITC plus була значно збільшена (рис. 4а), що свідчить про те, що CTPG зменшує Δψm у клітинах H22. Це узгоджується зі збільшеним співвідношенням Bax/Bcl-2. Отже, ми спостерігали, що вивільнення цитохрому с було значно збільшене при лікуванні CTPG (рис. 4b). Ці результати показали, що CTPG може частково індукувати апоптоз у клітинах H22 за допомогою мітохондріально-залежного (внутрішнього) шляху.

CTPG активує каспазний шлях і запобігає репарації ДНК

Далі було проаналізовано активацію каспази, індуковану CTPG через зовнішні та внутрішні сигнальні шляхи. Після обробки CTPG протягом 24 годин загальні білки виділяли з клітин H22 і рівні про- та розщеплених каспаз виявляли за допомогою вестерн-блоттингу. Порівняно з необробленим контролем або контролем з ДМСО лікування CTPG значно підвищувало не лише рівень розщепленої каспази-8 (зовнішній шлях), але й рівень розщепленої каспази-9 (внутрішній шлях) (рис. 5). Послідовно активовані каспази-8 та -9 розщеплюють наступні про-капази-3 та -7, які спостерігалися на рис. 5. Активована каспаза-3 розщеплює ДНК репараційний фермент полі (АДФ-рибоза) полімерази (PARP), щоб запобігти репарації ДНК і накопиченню пошкоджень ДНК, як показано на рис. 3a.

Ці результати показали, що CTPG індукував апоптоз у клітинах H22 як через зовнішні, так і через внутрішні сигнальні шляхи.

CTPG пригнічує ріст H22 HCC in vivo та покращує виживаність пухлинних мишей

Нарешті, протипухлинну дію CTPG на HCC оцінювали на мишачій моделі пухлини, яка була встановлена ​​шляхом підшкірної ін’єкції клітин H22. Після 3 днів ін'єкції клітин H22 пухлинних мишей обробляли CTPG 8 разів. Масу тіла мишей і розміри пухлини контролювали в зазначені моменти часу. Як показано на рис. 6а, маса тіла мишей у кожній групі не має істотної різниці, що свідчить про те, що вибрані дози CTPG не мають очевидних побічних ефектів. Цікаво, що ріст пухлини у мишей, які отримували як 200 мг/кг, так і 400 мг/кг CTPG, значно пригнічувався (рис. 6b). Крім того, дві дози лікування CTPG значно покращили виживаність пухлинних мишей (3/7, 3/7) порівняно з контрольною групою (0/7) наприкінці експерименту (рис. 6b). Ми також виявили, що CTPG значно посилює проліферацію спленоцитів, виділених від самців мишей Kunming, залежно від дози (рис. 6c), що свідчить про те, що CTPG має імуностимулюючий ефект.

Обговорення

TCM використовувався для лікування різних захворювань, включаючи рак протягом довгої історії. Повідомлялося, що ТКМ може індукувати апоптоз у різних типах пухлинних клітин через зовнішні (опосередковані рецептором смерті) і внутрішні (залежні від мітохондрій) сигнальні шляхи для прояву протипухлинних ефектів [22–25]. Два шляхи можуть активувати каспазу -8 і -9 відповідно [24, 26]. Тут ми виявили, що CTPG значно пригнічує ріст клітин H22 шляхом індукції апоптозу та зупинки клітинного циклу. Рівні розщепленої каспази-8 та -9 значно підвищувалися під час лікування CTPG, що свідчить про те, що в індукції апоптозу брали участь як зовнішні, так і внутрішні сигнальні шляхи. Наше попереднє дослідження показало, що CTPG індукує апоптоз у клітинах меланоми B16-F10 за допомогою мітохондріально-залежного шляху, що підвищує рівень розщепленої каспази-9, але не каспази-8 [16]. CTPG може активувати різні сигнальні шляхи в різних типах пухлинних клітин.

Цілісність мітохондріальної мембрани жорстко регулюється членами сімейства білків BCL-2, включаючи Bax і Bcl-2 [27, 28]. Співвідношення Bax до Bcl-2 відіграє вирішальну роль у мітохондріально-залежному шляху апоптозу [29]. У клітинах H22, оброблених CTPG, співвідношення Bax/Bcl-2 було значно підвищено, що могло спричинити зниження Δψm і вивільнення цитохрому c, що спостерігалося в цьому дослідженні. Отже, прокаспаза-9 була розщеплена та активована. Нарешті, ініціатори активної каспази-8 та -9 активували ката каспази-3, щоб розщепити PARP, щоб запобігти репарації ДНК. Взяті разом, ці результати свідчать про те, що CTPG індукує апоптоз у клітинах H22 як через зовнішні, так і через внутрішні сигнальні шляхи.

У моделі миші з пухлиною CTPG значно пригнічував ріст H22 HCC і значно покращував виживаність мишей з пухлиною. Цікаво, що CTPG залежно від дози сприяв проліферації спленоцитів у мишей Kunming, що узгоджується з нашим попереднім дослідженням [16].

Ці результати свідчать про те, що CTPG може пригнічувати ріст H22 HCC у мишей як через прямий протипухлинний ефект, так і через непряме посилення імунітету.

Висновки

CTPG пригнічував ріст клітин H22 як in vitro, так і in vivo та індукував апоптоз у клітинах H22 як через зовнішні, так і через внутрішні сигнальні шляхи. Ці дані показали, що CTPG може бути потенційним кандидатом для лікування ГЦК.