Cistanche: індуковане ехінакозидом виробництво оксиду азоту в ендотеліальних клітинах: роль андрогенного рецептора та шлях PI3K-Akt

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, DANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU та XIN LIU

вступ

ЦистанхеHoffmg. Ет Лінк — багаторічна трав'яниста рослина-паразит з роду Оробанхових. HerbaЦистанхе, стеблоЦистанхе deserticolaY. c . МА іЦистанхе tubulosa(Schenk) R. Weight використовувалися як тонізуючий засіб для лікування ниркової недостатності, імпотенції, патологічної лейкореї та старечого запору (1), що може бути пов’язано з його андрогеноподібним або регуляторним ефектом статевих гормонів (2).Ехінакозид(EcH; c35H46O20;

молекулярна маса 786,73; Рис. 1), є одним із фенілетаноїдних глікозидів (PhG), виділених із стебел Herba.Цистанхе, і демонструє численні біологічні властивості, включаючи антиоксидантну, антистарільну, протизапальну, гепатопротекторну та нейропротекторну дію (3). Сучасні фармакологічні дослідження показали, що різні складові HerbaЦистанхе, включаючи EcH, актеозид, канканоз, канканозид F і цистанозид F, виявляють вазорелаксуючу активність (4).

Ендотелій є критично важливим регулятором судинної мережі, а оксид азоту (NO) є важливим розслаблюючим фактором, що виділяється ендотеліальними клітинами. Дифундуючи в клітини гладких м’язів, NO активує гуанілатциклазу, підвищує рівень циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ), а потім активує цГМФ-залежні протеїнкінази (PKG), щоб сприяти розслабленню гладких м’язів (5). Раніше було продемонстровано, що EcH у 350-400 мкМ безпосередньо діє на гладкі м’язи судин і пригнічує спричинену гіпоксією проліферацію в клітинах гладких м’язів легеневої артерії щурів (6), тоді як 30-300 мкМ EcH викликає гостре розслаблення судин в ендотелії- неушкоджених кілець залежно від концентрації та посилення виробництва цГМФ у гладких м’язах кавернозного тіла кілець аорти, скорочених фенілефрином (7). Відкриваючи канали NO-cGMP-PKG-BKca в клітинах гладкої мускулатури, 100 або 300 мкМ EcH пригнічував індуковане норадреналіном скорочення в легеневих артеріях щурів, особливо в оголених ендотелієм кільцях (8). Ендотеліальні клітини є ключовими регуляторами серцево-судинної функції, і в кількох випадках було виявлено, що залежне від ендотелію розслаблення було зумовлене переносною речовиною, такою як NO, що вивільняється з ендотелію (9). Однак попередній молекулярний механізм виробництва NO, індукованого EcH, у ендотеліальних клітинах судин потребує подальшого дослідження.

У судинному ендотелії утворення NO в основному опосередковується ендотеліальною NO-синтазою (eNOS). Декілька груп продемонстрували, що шлях фосфатидилінозитол 3-кінази (PI3K) активує серин-треонін-протеїнкіназу B (Akt), яка спричиняє пряме фосфорилювання eNOS за серином 1177 (Ser1177) (10). Андрогенний рецептор (AR) є членом підродини ядерних рецепторів s3, який канонічно модифікує експресію генів. Локалізація АР в кавеолах клітинної мембрани бере участь

негеномна регуляція функції ендотеліальних клітин або експресії генів шляхом запуску каскаду c-Src/PI3K/Akt, що зрештою призводить до фосфорилювання eNOS і виробництва NO (11). Повідомлялося, що в ендотеліальних клітинах аорти людини тестостерон активує передачу сигналів PI3K/Akt і швидко індукує вироблення NO завдяки прямій взаємодії AR і субодиниці p85 PI3K у серцево-судинній системі (12). Повідомлялося, що EcH посилює симптоми, пов’язані з дефіцитом гормонів, і чинить андрогеноподібний ефект завдяки конкурентному зв’язуванню з АР замість тестостерону (2). Таким чином, у цьому дослідженні висунуто гіпотезу про те, що шлях PI3K/Akt може брати участь у виробництві NO через AR-залежне фосфорилювання eNOS, індуковане EcH. Метою цього дослідження було оцінити наступні ефекти EcH: i) індукція продукції NO та фосфорилювання eNOS; ii) участь AR у фосфорилюванні eNOS; і iii) активація шляху PI3K/Akt в ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEcs), добре відомої експериментальної моделі для вивчення регуляції функцій ендотеліальних клітин і ангіогенезу (13).

Матеріали і методи

Хімікалії і реагенти.EcH (чистота, 92,5 відсотка) було отримано з національних еталонних стандартів лікарських засобів у Національному інституті контролю харчових продуктів і ліків. Антитіла проти p-Akt (Ser473; кат. № ab8805), Akt (кат. № ab81283), p-eNOS (Ser1177; кат. № ab184154) та eNOS (кат. № ab76198) були придбані у Abcam. Інгібітори нілутаміду та IcI 182780 були отримані від Sigma-Aldrich; Merck KGaA. L-NAME був придбаний у Adamas-Beta, Ltd., а вортманнін був придбаний у Pribolab.

Стільниковий культури іпрепарат лікування.HUVEc були отримані від Sciencell Research Laboratories Inc. і культивовані в середовищі ендотеліальних клітин (EcM; Sciencell Research Laboratories) з 5 відсотками (об./об.) фетальної бичачої сироватки (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) і 1 відсотком ендотеліальних клітин. добавка для зростання (ECGS) при 37˚C (5 відсотків CO2 і 95 відсотків вологості) (14). Після досягнення злиття клітини розщеплювали трипсином і висівали в ECM з 1% FBS і 1% EcGS. Для всіх експериментів HUVEcs висівали в чашки в концентрації 1x104/мл і вирощували до досягнення конфлюентності. Перед обробкою EcH або іншими стимуляторами клітини інкубували в EcM без фенолового червоного без FBS і EcGS протягом 6 годин для індукції

зупинка росту. В інгібіторних експериментах HUVEc попередньо інкубували з різними антагоністами або інгібіторами, включаючи 10 мкМ нілутаміду, 10 мкМ IcI 182780, 0,5 мМ L-NAME або 5 мкМ вортманніну, протягом 30 хв, з або без ЕХГ, при 37˚C. У всіх групах, включаючи контроль, dMSO використовували як розчинник в рівних концентраціях 0,001 відсотка.

Вимірювання внутрішньоклітинний БЕЗ виробництва.

Відносні зміни в цитозольній концентрації NO в HUVEcs відстежували за допомогою флуоресцентного зонда NO DAF-FM (Cayman Chemical Company), як повідомлялося раніше (12). Коротко кажучи, клітини завантажували 5 мкМ DAF-FM діацетатом протягом 20 хвилин при 37˚C у чорну пластину для мікротитрації та кілька разів промивали PBS (pH 7,4). Флуоресценцію визначали при довжинах хвиль збудження та випромінювання 495 та 515 нм відповідно, використовуючи флуоресцентний рідер для мікропланшетів (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) та компактний інвертований мікроскоп (Nikon eclipse Ts2R; Nikon corporation).

західний пляма аналіз.Як повідомлялося раніше (15), конфлюентні моношари клітин двічі промивали крижаним PBS і лізували буфером RIPA (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology). Концентрацію білка в супернатанті вимірювали за допомогою методу аналізу біцинхонінової кислоти (16). Згодом 30 мкг білка завантажували на доріжку, розділяли за допомогою 10% поліакриламідних гелів і переносили на полівінілідендифторидні мембрани. Мембрани блокували 5% знежиреним молоком протягом 1 години при 25°C. Після інкубації з моноклональними антитілами проти Akt (1:1, 000 розведення), p-Akt (1:500 розведення), eNOS (1:2, 000 розведення) або p-eNOS (1 :1,000 розведення) при 4°C протягом ночі, мембрани промивали TBST (містить 0,1 відсотка Tween-20) 4 рази протягом ~15 хвилин на кожне промивання при 25°C. Згодом мембрани інкубували з вторинними антитілами, кон’югованими з пероксидазою хрону (розведення 1:5, 000; антимишачі антитіла, кат. № A0216, або антитіла проти кроликів, кат. № A0208, Beyotime Institute біотехнології) протягом 1 години при 25˚C і виявлено за допомогою набору для хемілюмінесценції (кат. № 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Інтенсивність смуг була кількісно визначена за допомогою програмного забезпечення для аналізу гелю Image J, версія 1.8.0_112 (Національний інститут здоров’я).

Маленький заважаючи (si) РНК підготовка і трансфекція.Довгі дволанцюгові РНК були синтезовані цільовою мРНК AR та рецептора естрогену (ER) із послідовностями, наведеними в таблиці I. Умови нокдауну siRNA включали трансфекцію HUVEC при 70 відсотковому злитті, що зберігалося в неантимікробних препаратах культуральне середовище в чашках для культур, покритих колагеном 60 мм. Трансфекція 5 нМ AR-міРНК або 10 нМ ER-міРНК реагентом Lipofectamine 3000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) проводилася окремо, згідно з протоколами виробника. Ефективність трансфекції оцінювали за допомогою кількісного PcR аналізу зворотної транскрипції (RT-qPcR), як повідомлялося раніше (17). Умови термоциклування були такими: 10 хв при 95˚C; 40 циклів 95˚C протягом 5 секунд і 60˚C протягом 1 хвилини, і крива плавлення при 95˚C протягом 15 секунд, 60˚C протягом 1 хвилини і 95˚C протягом 15 секунд; для кожного зразка було проведено три незалежні біологічні повтори. Подальші експерименти проводили через 48 годин після трансфекції. Пари праймерів були розроблені за допомогою програмного забезпечення Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) з наступними послідовностями: AR вперед, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' і назад, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER вперед, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' і назад, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; і GAPdH вперед, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' і назад, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Статистичний аналіз.Усі дані представлені як середнє ± стандартне відхилення. Статистичні порівняння між групами проводили за допомогою тесту Крускала-Уолліса або двостороннього дисперсійного аналізу з пост-критерієм Тьюкі для численних порівнянь. П<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Результати

ECH спонукає НІ виробництва і eNOSфосфорилювання.Як показано на рис. 2A і B, 1 мкМ ECH значно збільшив внутрішньоклітинне виробництво NO в HUVEcs порівняно з клітинами негативного контролю, тоді як стимулюючий ефект EcH був послаблений до контрольного рівня попередньою обробкою L-NAME. Щоб отримати оптимальну концентрацію, фосфорилювання eNOS було перевірено через 60 хвилин після обробки EcH у концентраціях

з {{0}}, 0.01, 0.1, 1 і 10 мкМ. Результати показали, що EcH у концентраціях 0,01-10 мкМ може істотно індукувати фосфорилювання eNOS на Ser 1177 залежно від концентрації, при цьому максимальне фосфорилювання eNOS спостерігається при індукції EcH 10 мкМ (рис. 2c і d). Крім того, фосфорилювання eNOS у Ser1177 перевіряли за допомогою вестерн-блоттингу через 0, 5, 15, 30, 60 і 120 хвилин після інкубації з 1 мкМ EcH. Було помічено, що фосфорилювання eNOS швидко ініціювалося EcH через 5 хвилин і продовжувало зростати до 30 хвилин інкубації (рис. 2E і F). Згодом, незважаючи на обробку EcH, відносна величина фосфорилювання eNOS залишалася стабільною з 30 хвилин; отже, EcH не впливав на загальну експресію eNOS (рис. 2c і E).

AR опосередковує ECH-індукований НІ виробництва і eNOSінтерферуючий ефект AR-міРНК-1 та ER-міРНК-2 був найбільш успішним у пригніченні експресії AR та ER у HUVEcs у цьому дослідженні (рис. 3). Згодом антагоніст для аналізу інгібування функції AR і siRNA для аналізу втрати функції AR були застосовані для оцінки участі AR в індукованій EcH активації eNOS і продукції NO. Як показано на рис. 4A, 1 мкМ ECH значно збільшив виробництво NO в HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

ECH активує в PI3K/Акт шлях.У цьому дослідженні фосфорилювання Akt у Ser473 перевіряли через 60 хв після інкубації EcH у концентраціях 0, 0.01, 0.1 , 1 і 10 мкМ. Результати показали, що EcH (0.01-10 мкМ) може суттєво індукувати фосфорилювання Akt. Відносні рівні експресії p-Akt досягали піку при 1 і 10 мкМ лікування EcH (рис. 5A і B). Крім того, фосфорилювання Akt перевіряли за допомогою вестерн-блоттингу через 0, 5, 15, 30, 60 і 120 хвилин після додавання 1 мкМ EcH до культур HUVEc. Як показано на рис. 5c і d, EcH швидко збільшував фосфорилювання Akt після 5 хвилин інкубації, а максимальний рівень білка p-Akt спостерігався через 60 хвилин. Навпаки, EcH не впливав на загальну експресію Akt (рис. 5A і c). Крім того, щоб дослідити потенційний вплив шляху PI3K на фосфорилювання eNOS, HUVEc були попередньо оброблені інгібітором PI3K вортманніном перед застосуванням EcH. Було виявлено, що вортманнін знижує спричинене EcH виробництво NO до базового рівня (рис. 5E). Подібне явище спостерігалося за допомогою флуоресцентної мікроскопії під час дослідження індукованої EcH флуоресценції DAF-FM (рис. 5F). Крім того, вортманнін може мати здатність скасовувати швидке фосфорилювання eNOS у HUVEcs (рис. 5G і H). Вищезазначені результати свідчать про те, що EcH може активувати фосфорилювання eNOS і виробництво NO через шлях PI3K/Akt.

Обговорення

EcH - це природна сполука, виділена з HerbaЦистанхе, з різними фармакологічними властивостями. Раніше було продемонстровано, що EcH виявляє залежний від ендотелію ефект релаксації судин шляхом відкриття каналів NO-cGMP-PKG-BKca в клітинах гладких м’язів кровоносних судин (7,8). Поточні результати свідчать про те, що ECH спричиняє AR-залежну активацію eNOS для індукування виробництва NO із залученням сигнального шляху PI3K/Akt у ендотеліальних клітинах судин.

Будучи внутрішнім шаром стінки судини, ендотелій може швидко сприймати та реагувати на зміни в кровотоці, у свою чергу, призводячи до передачі сигналу до розташованих нижче клітин гладких м’язів, щоб регулювати тонус судин (18). Широко повідомлялося про існування багатьох судинорозширювальних сполук ендотелію, найбільш прототипова речовинабудучи NO, утворюється з ендотеліальної ізоформи eNOS, що призводить до фосфорилювання (19). За нормальних умов eNOS залишається неактивним, коли зв’язується з кавеоліном, і активується з наступною послідовністю подій в ендотеліальнихклітини: i) eNOS дисоціює від кавеоліну-1 та асоціюється з ca2 плюс /caM; ii) білок теплового шоку (HSP)90 сприяє eNOSдимеризація та сприяє стеричному утворенню для рекрутування Akt; і iii) кальциневрин дефосфорилює Thr495 для підсилення стану активації (20). У цьому дослідженні продукція NO була значно збільшена в HUVEC, оброблених 1 мкМ ECH. Це явище було подібне до попередніх результатів, де EcH збільшив вивільнення NO та стимулював синтез цГМФ у кільцях грудної аорти щурів (7). Крім того, два сайти фосфорилювання, Ser1177 і Thr495, здаються особливо важливими для регуляції активності eNOS (20), і це дослідження показало, що EcH індукує гостре фосфорилювання eNOS у Ser1177 залежно від концентрації. Крім того, стимули, пов’язані з впливом на рівні білка eNOS, головним чином визначають стабільність мРНК eNOS, і якщо стимул підтримується протягом більш тривалого періоду часу, транскрипція мРНК eNOS відбувається за допомогою мітоген-активованої протеїнкінази та ядерного фактора κB (20). У сукупності ці спостереження вказують на те, що активація eNOS на Ser1177 відповідає за синтез NO, індукований EcH.

Крім того, все більше досліджень демонструють, що АР експресується в ендотеліальних клітинах у ряді тканин людини, що свідчить про потенційну роль андрогенів та їх аналогів, які діють через АР-опосередковані процеси, у модуляції ендотелію людини. клітинний гомеостаз (21). У некласичному шляху PI3K/Akt AR може активувати PI3K шляхом безпосередньої взаємодії з регуляторною субодиницею PI3K p85 (22). Це дослідження продемонструвало, що антагоніст AR або siRNA AR зменшує виробництво NO та фосфорилювання eNOS, індуковане EcH у HUVEcs. Раніше повідомлялося, що естрогени індукують фосфорилювання eNOS і стимулюють вироблення NO через класичну активацію ER в ендотеліальних клітинах (23), а введення ECH значно посилює експресію ER в матці (24). Однак у цьому дослідженні ефект AR був більш помітним порівняно з ефектом ER на EcH-індуковану активацію eNOS і виробництво NO. Крім того, було помічено, що EcH викликає гостру продукцію NO протягом декількох хвилин через активацію eNOS за участю AR у HUVEcs, що узгоджується з негеномною природою відповіді в ендотеліальних клітинах. AR пов’язаний з білками каркасу, включаючи HSP90, HSP70 і кіназу Src, у цитоплазмі, і його можна транспортувати до мембрани з комплексу AR протягом 5 хвилин після лікування тестостероном (23). На основі стратегії «цільового вилову» HSP90 було ідентифіковано як PhGs-пов’язану мішень, що вказує на те, що EcH може полегшити дисоціацію AR від білків каркасу (25). Інше дослідження показало, що в гіпоталамусі EcH може поєднуватися з АР-кишенею в амінокислотах Met-894 і Val-713 і пригнічувати транспорт цитоплазматичного АР до ядра (26). Однак основний механізм, за допомогою якого EcH опосередковує цитоплазматичну транслокацію AR на мембрану, потребує подальшого дослідження. Тому необхідні подальші дослідження, щоб з’ясувати механізм, за допомогою якого EcH досягає AR-залежної активації eNOS, і як це може бути пов’язано зі зв’язуванням з HSP90 у ендотеліальних клітинах судин.

Шлях PI3K/Akt є одним із найважливіших сигнальних каскадів, активація якого індукується продукуванням фосфатидилінозитол-3,4,5-трифосфату для зв’язування N-кінцевого гомологічного домену плекстрину Ser/ Thr кіназа Akt. Це полегшує залучення Akt до плазматичної мембрани (27). Шлях PI3K/Akt може відігравати важливу роль у контролі NO-залежної релаксації, індукованої EcH.

Це дослідження показало, що індуковане EcH виробництво NO було значно знижено, коли клітини інкубували з інгібітором PI3K вортманніном. У попередньому звіті було показано, що 15 мг/кг EcH активує сигнальний шлях PI3K/Akt у клітинах кісткового мозку, пригнічених 5-фторурацилом (28). У цьому дослідженні інгібітори PI3K значно зменшили EcH-індуковане фосфорилювання eNOS на Ser1177. Крім того, активність Akt переважно регулювалася регуляторними шляхами вище за течією, зокрема PI3K-залежним фосфорилюванням у Ser473 (20). У цьому дослідженні EcH індукував фосфорилювання Akt на Ser473 залежно від дози; Подібним чином, попереднє дослідження продемонструвало, що 5, 10 або 20 мкМ EcH справляли кардіопротекторний ефект проти аноксії/реперфузійної терапії залежним від дози способом шляхом потенційного посилення p-Akt і SLc8A3 (29). Регуляція транскрипції гена Akt залишається в основному невідомою (30); тому дане дослідження було зосереджено на посттранскрипційних регуляторних ефектах EcH на Akt. Беручи до уваги вищезазначені висновки, було зроблено висновок, що застосування EcH до HUVEcs може призвести до активації шляху PI3K/Akt, який фосфорилює eNOS і, згодом, збільшує виробництво NO.

Підсумовуючи, EcH є натуральним продуктом, який в основному виділено з HerbaЦистанхе.Потенційний механізм, що лежить в основі індукованого EcH виробництва NO в ендотеліальних клітинах, може включати наступне (рис. 6): i) EcH діє як функціональний ліганд AR, який локалізований у кавеолах клітинної мембрани; ii) PI3K зв’язується з гідрофобним доменом Akt у Ser473 і сприяє залученню Akt до клітинної мембрани; iii) залучення каскадів PI3K/Akt запускає AR-залежне фосфорилювання eNOS; і iv) утворення NO опосередковується eNOS в ендотеліальних клітинах. Спостереження, що EcH індукує продукцію NO через AR-залежне фосфорилювання eNOS із залученням шляху PI3K/Akt, може сприяти подальшому розумінню васорелаксуючих ефектів EcH. Крім того, EcH, спрямований на шляхи NO, отримані з ендотелію, може бути наслідком негеномних ефектів. Таким чином, це дослідження може допомогти з’ясувати механізми, за допомогою яких EcH здійснює свій фармакологічний ефект для запобігання серцево-судинним захворюванням.

Подяки

Не застосовується.

Фінансування

Це дослідження було підтримано Національним фондом природничих наук Китаю (грант № 81503333).

Доступність з даних і матеріалів

Набори даних, згенеровані та проаналізовані під час цього дослідження, доступні у відповідного автора за розумним запитом.

авторів внески

LG і XL задумали та розробили експерименти. dL і YZ провели експерименти. WZ і JG проаналізували дані. Л. Г. підготував рукопис. XL переглянув і відредагував рукопис. Усі автори прочитали та схвалили остаточний рукопис.

1202 ГУet al: ЕХІНАКОЗИД ІНДУКУЄ ПРОДУКЦІЮ ОКСИДУ АЗОТУ ЗА АР-ЗАЛЕЖНИМ ШЛЯХОМ PI3K/AKT

Етика затвердження і згода до брати участь

Не застосовується.

пацієнт згода для публікація

Не застосовується.

Змагаючись інтереси

Автори заявляють, що не мають конкуруючих інтересів.

Список літератури

1. Комісія китайської фармакопеї:ЦистанхеHerba. В: Фармакопея Китайської Народної Республіки 1. chin. Мед. наук. Press, Beijing, стор 135, 2015.

2. Jiang Z, Wang J, Li X і Zhang X: ехінакозид іЦистанхе tubulosa(Шенк)R. wight покращує спричинене бісфенолом А пошкодження яєчок і сперматозоїдів у щурів за допомогою регульованих стероїдогенних ферментів статевих залоз. J Ethnopharmacol 193: 321-328, 2016.

3. Liu J, Yang L, dong Y, Zhang B and Ma X: Echinacoside, неоціненний природний продукт для лікування неврологічних та інших розладів. Молекули 23: piiE1213, 2018.

4. Yoshikawa M, Matsuda H, Morikawa T, Xie H, Nakamura S and Muraoka O: Фенілетаноїдні олігоглікозиди та ацильовані олігоцукри з судинорелаксуючою активністю відЦистанхе tubulosa. Bioorg Med chem 14: 7468-7475, 2006.

5. Арнольд В.П., Міттал К.К., Кацукі С. та Мурад Ф.: Оксид азоту активує гуанілатциклазу та підвищує рівень гуанозин 3':5'-циклічного монофосфату в різних тканинних препаратах. Proc Natl Acad Sci USA 74: 3203-3207, 1977.

6. Gai XY, Tang F, Ma J, Zeng KW, Wang SL, Wang YP, Wuren TN, Lu dX, Zhou Y і Ge RL: Антипроліферативний ефект ехінакозиду на клітини гладких м’язів легеневої артерії щурів під дією гіпоксії. J Pharmacol Sci 126: 155-163, 2014.

7. He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ і Tu PF: ехінакозид викликає залежну від ендотелію релаксацію в кільцях аорти щурів через шлях NO-cGMP. Planta Med 75: 1400-1404, 2009.

8. Gai XY, Wei YH, Zhang W, Wuren TN, Wang YP, Li ZQ, Liu S, Ma L, Lu dX, Zhou Y and Ge RL: Ехінакозид індукує вазорелаксацію легеневої артерії щурів шляхом відкриття NO-cGMP-PKG- каналів BKca та зниження внутрішньоклітинного рівня ca2 plus. Acta Pharmacol Sin 36: 587-596, 2015.

9. Maruhashi T, Kihara Y та Higashi Y: Оцінка ендотелій-незалежної вазодилатації: від методології до клінічних перспектив. J Hypertens 36: 1460-1467, 2018.

10. Ahmad KA, Ze H, chen J, Khan FU, chen X, Xu J та похідні на ендотеліальних клітинах пупкової вени людини проти пошкодження, спричиненого окислювальним стресом: залучення антиоксидантних та сигнальних шляхів PI3k/Akt/eNOS/NO. Biomed Pharmacother 106: 1734-1741, 2018.

11. Yu J, Akishita M, Eto M, Koizumi H, Hashimoto R, Ogawa S, Tanaka K, Ouchi Y і Okabe T: Src-кіназа опосередковує залежну від андрогенного рецептора негеномну активацію сигнального каскаду, що веде до ендотеліальної синтази оксиду азоту . Biochem Bioph Res communautaire 424: 538-543, 2012.

12. Yu J, Akishita M, Eto M, Ogawa S, Son B, Kato S, Ouchi Y та Okabe T: Андроген-рецептор-залежна активація ендотеліальної синтази оксиду азоту в ендотеліальних клітинах судин: роль фосфатидилінозитолу {{3} }kinase/Akt шлях. Ендокринологія 151: 1822-1828, 2010.

13. Pittarella P, Squarzanti dF, Molinari c, Invernizzi M, Uberti F і Reno F: NO-залежна проліферація та міграція, індукована вітаміном d у HUVEc. J Steroid Biochem 149: 35-42, 2015.

14. He Y, Luan Z, Fu X і Xu X: Надмірна експресія роз’єднуючого білка 2 пригнічує індукований глюкозою апоптоз ендотеліальних клітин пупкової вени людини. Int J Mol Med 37: 631-638, 2016.

15. Xiao-Hong d, chang-Qin X, Jian-Hua H, Wen-Jiang Z і Bing S: Ікаріїн затримує індуковане гомоцистеїном старіння ендотеліальних клітин, включаючи активацію сигнального шляху PI3K/AKT-eNOS. Pharm Biol 51: 433-440, 2013.

16. Сміт П. К., Крон Р. І., Германсон Г. Т., Маллія А. К., Гартнер Ф. Х., Провенцано М. Д., Фуджімото Е. К., Гьоке Н. М., Олсон Б. Дж. і Кленк д. К.: Вимірювання білка за допомогою біцинхонінової кислоти. Anal Biochem 150: 76-85, 1985.

17. Gu L, Zhong X, Lian d, Zheng Y, Wang H та Liu X: Біосинтез тритерпеноїдів і транскрипційна відповідь, викликана оксидом азоту під час зануреного бродінняГанодерма lucidum. Process Biochem 60: 19-26, 2017.

18. Ellinsworth dc, Sandow SL, Shukla N, Liu Y, Jeremy JY та Gutterman dd: Ендотелійна гіперполяризація та коронарна вазодилатація: різноманітні та інтегровані ролі епоксиікозатрієнових кислот, перекису водню та щілинних з’єднань. Мікроциркуляція 23: 15-32, 2016.

19. Фрід Дж.К. і Гуттерман д.д.: комунікація є ключовою: механізми міжклітинної сигналізації при вазодилатації. J cardiovasc Pharm 69: 264-272, 2017.

20. Quillon A, Fromy B і Debret R: Відчуття мікрооточення ендотелію, що призводить до опосередкованої оксидом азоту вазодилатації: Огляд нервових і біомеханічних сигналів. Оксид азоту 45: 20-26, 2015.

21. Torres-Estay V, Carreno dV, Francisco IF, Sotomayor P, Godoy AS і Smith GJ: Андрогенний рецептор в ендотеліальних клітинах людини. J Endocrinol 224: 131-137, 2015.

22. Deng Q, Zhang Z, Wu Y, Yu WY, Zhang J, Jiang ZM, Zhang Y, Liang H і Gui YT: Негеномна дія андрогенів опосередковується швидким фосфорилюванням і регуляцією передачі рецепторів андрогенів. Cell Physiol Biochem 43: 223-236, 2017.

23. de Oliveira TS, de Oliveira LM, de Oliveira LP, costa RMd, Tostes Rc, Georg Rc, costa EA, Lobato NS, Filgueira FP and Ghedini Pc: Активація шляху PI3K/Akt, опосередкована рецепторами естрогену, пояснює індукований естроном судинна активація передачі сигналу cGMP. Vascul Pharmacol 110: 42-48, 2018.

24. Li F, Yang X, Yang Y, Guo c, Zhang c, Yang Z і Li P: Антиостеопоротична активність ехінакозиду у щурів з оваріектомією. Фітомедицина 20: 549-557, 2013.

25. Zeng KW, Liao LX, Wan YJ, Jiang Y і Tu PF: Ідентифікація фармакологічних цілей та аналіз ефективності фенілетаноїдних глікозидів зЦистанчіHerba заснована на стратегії «цільової риболовлі». chin Tradit Herbal drugs 49: 173-178, 2018.

26. Jiang Z, Zhou B, Li X, Kirby GM і Zhang X: Ехінакозид збільшує кількість сперми у щурів, націлюючись на гіпоталамічний андрогенний рецептор. Sci Rep 8: 3839-3850, 2018.

27. Coffer PJ, Jin J та Woodgett JR: Протеїнкіназа B (c-Akt): багатофункціональний медіатор активації фосфатидилінозитол 3-кінази. Biochem J 335, 1-13, 1998.

28. Wang S, Zheng G, Tian S, Zhang Y, Shen L, Pak Y, Shen Y та Qian J: Echinacoside покращує гемопоетичну функцію у мишей із 5-FU-індукованою мієлосупресією. Life Sci 123: 86-92, 2015.

29. chen M, Wang X, Hu B, Zhou J, Wang X, Wei W і Zhou H: Захисні ефекти ехінакозиду проти аноксії/реперфузійного ушкодження в клітинах H9c2 через підвищення регуляції p-AKT і SLc8A3. Biomed Pharmacother 104: 52-59, 2018.

30. Abeyrathna P і Su Y: Критична роль Akt у серцево-судинній функції. Vascul Pharmacol 74: 38-48, 2015.