Глава 5 Зміни активності ферментів під час ферменту бродіння

Глава 5 Зміни активності ферментів під час ферменту бродіння

 

Протеаза, ліпаза таСупероксид Дісмутаза (SOD)є основними функціональними ферментамиМікробний фермент Здоров'я. Серед них,протеазавідіграє роль усприяння гідролізу білка в їжів людському тілі. Крім того, він також може розкласти деякі вмираючі клітини, видаляти бруд на поверхні шкіри та пори та відігравати роль у відлущуванні, тому він широко використовується в продуктах для ванни. Ліпаза діє на ефірну зв'язок між жирними кислотами та гліцерином, а гідролізний субстрат, як правило, натуральні олії. Тому він спостерігається в багатьох продуктах для схуднення та продуктів для здоров'я. Багато жінок надзвичайно стурбовані темою схуднення, саме тому ферменти швидко стали популярними у всьому світі.Ферменти багаті ліпазою, що означає, що вони мають високу цінність досліджень та перспективи застосування.Дерна- це спеціальний металевий фермент, який каталізує реакцію на дискмутаціюаніонні радикали супероксиду, тим самимВидалення аніонних радикалів супероксидув тілі. Це захисний бар'єр для організмів, тому він широко використовується в медичній галузі.
У цій главі є яблучний фермент як приклад. Починаючи з початкової стадії бродіння,Діяльність супероксид -демутази, амілаза, ліпаза, протеаза та целюлаза в експериментальній групі та контрольній групі вимірювали кожні 15 днів для всебічно та систематично відображати зміну тенденції активності ферментів протягом усього процесу бродіння.

Нові трави cistanche

Клацніть, щоб отримати більше деталей

 

Служба підтримуючої служби Wecistanche-найбільший експортер Cistanche в Китаї:
Електронна пошта: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/Тел: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Матеріали та методи

5.1.1 Матеріали

(1) Експериментальні матеріали

Вимийте свіжі яблука стерильною водою в стерильних умовах, природним чином висушіть їх на стерильному операційному столі, очистіть їх та наріжте для подальшого використання. Додайте білий цукор і яблука до стерилізованої скляної банки при масовому співвідношенні 1: 1. Активуйте бактерії, необхідні для експерименту, і прищеплюйте їх у фермент відповідно до оптимальної схеми (цей крок операції опущена для контрольної групи), закладіть її та покладіть у прохолодне і сухе місце. Після 3 місяців бродіння кімнатної температури візьміть зразок, щоб отримати всю ферментну рідину, що містить целюлозу, і фільтрувати її. Візьміть супернатант як експериментальний зразок. Після того, як зразок центрифугується при 10, 000 об / хв протягом 15 хвилин у високошвидкісній центрифузі, він використовується для вимірювання відповідних даних. Варто зазначити, що в процесі створення ферментів, щоб уникнути непотрібного забруднення, всі наші операції проводилися в стерильних умовах.

(2) Основні інструменти
Інструменти, необхідні для експерименту, такі ж, як і 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Методи

(1) Визначення активності супероксиддисмутази (SOD) [66]
Розчин пірогаллолу попередньо нагріли на 25 -градусій постійній температурній водяній бані протягом певного періоду часу. Згідно з таблицею 5.1, у пробірку додавали відповідну кількість буфера, дистильованої води та того ж об'єму соляної кислоти або пірогаллолу розчину. Постійна температурна водяна банова була встановлена ​​на 25 градусів на 2 0 хв. Після того, як змішана рідина швидко похитнулася, її негайно вводили в кювету. Значення абсорбції A0 зразка вимірювали кожні 30 секунд на довжині хвилі 325 нм за допомогою спектрофотометра.

Вкладка.5.1 Додайте кількість сусіднього бензолу три реагенту фенолу для визначення швидкості аоксидації

 

Метод визначення активності СОД в основному такий же, як і вищевказана операція. Єдина різниця полягає в тому, що перед додаванням пірогаллу, {{0}}. 5 мл розчину зразка ферментів різних концентрацій потрібно додати спочатку. У той же час додається той самий об'єм дистильованої води. Вимірювана поглинання - ASOD. The inhibition rate and SOD enzyme activity are calculated according to formula 5.1 and formula 5.2: Inhibition rate (%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100 (5.1) Enzyme activity (U/mL)=inhibition rate/50% × V1/V2×n (5.2) де: v1 - загальний об'єм розчину, мл; V2 - об'єм розчину зразка ферменту, мл; △ A0-швидкість автоматичного окислення пірогаллолу; △ ASOD - швидкість зміни значення поглинання вибірки; N-це розведення множинного (2) визначення активності амілази У цьому дослідженні було використано колориметричний метод йод-старметричного методу для визначення активності амілази. Конкретні етапи операції стосуються "Національної процедури клінічної лабораторії" [67]. В основному він розділений на наступні два моменти:

 

① Підготовка рішення
Buffered starch solution ({{0}}.4g/L): Accurately weigh 9g of sodium chloride, 22.6g of anhydrous disodium hydrogen phosphate, and 12.5g of anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dissolve them in 500mL of distilled water, and heat поки розчин не кинеться; Точно зважуйте 0,4 г розчинного крохмалю, розчиняйте його в 10мл дистильованої води, змішайте рівномірно і відрегулюйте до пасти; Введіть розчин крохмалю, відрегульовану на пасту, у вищезазначений розчин кипіння, і повторно промивайте склянку, поки крохмаль повністю не буде перенесений у розчин кипіння. Після рівномірно перемішування зі скляним стрижнем, охолоджуйте до кімнатної температури, додайте 5мл 37% розчину формальдегіду волосся і розбавте до 1 л дистильованою водою. Значення рН розчину становить 7,0 ± 0,1, і його поміщають у холодильник для використання.
Розчин йоду (0. 1 моль/л): точно важить 1,7835 г йодату калію та 22,5 г йодиду калію в чистому 500 мл
Сялка, повільно і рівномірно додає 4,5 мл концентровану соляну кислоту, постійно перемішаючи під час процесу додавання, розбавляйте до шкали дистильованою водою і рівномірно перемішайте. Покладіть його в холодильник для використання та зберігайте його в коричневу пляшку реагенту.
Розчин для додатків йоду ({{0}}. 01MOL/L): Візьміть певну кількість розчину для запасу йоду (0,1 моль/л), розведіть його 10 разів дистильованою водою, покладіть його в холодильник для використання та зберігайте його до 1 місяця.

② Експериментальні етапи експлуатації
Візьміть розчин ферменту і розведіть його 10 разів фізіологічним фізіологічним розчином і працюйте відповідно до таблиці 5.2. Добре перемішайте, довжина хвилі спектрофотометра становить 660 нм, а легкий шлях колориметричної чашки - 10 мм. Нуль з дистильованою водою і прочитайте поглинання кожної трубки. Обчисліть активність амілази на основі основної формули обчислення 5.3.

 

Вкладка.5.2 Етапи експлуатації визначення амілази

 

(3) Визначення активності ліпази

Метод визначення проводився відповідно до QB/T {{0}} [68]. Тестовий розчин 2% ферменту готували з 0. 0 25 моль/л фосфатного буфера (pH 7,5), фенольфталеїн використовували в якості індикатора, а жирні кислоти титрували стандартним розчином гідроксиду натрію. Активність ліпази обчислювали на основі об'єму гідроксиду натрію, споживаного в експерименті. Правило: при рН 7,5 і температура навколишнього середовища 40 градусів, 1 мл розчину рідкого ферменту гідролізує ліпазу протягом 1 хв для отримання 1 мкмоль жирної кислоти, що є однією одиницею активності ліпази, експресованою як U/мл. Потім активність ліпази обчислювали відповідно до формули 5.4: активність ферменту (u/мл)=(ba) × c/0,05 × 50 × 1/15 × n=200/3 × (ba) × c × n (5,4), де: b - це обсяг гідроксайду, що споживає, ml; A - об'єм стандартного розчину гідроксиду натрію, споживаного в порожній контрольній групі, мл; C - концентрація стандартного розчину гідроксиду натрію, моль/л; 0,05 - коефіцієнт перетворення концентрації стандартного розчину гідроксиду натрію; 50 - вміст жирної кислоти в розчині гідроксиду натрію; 15 хв - час реакції; n - розведення множинного.

(4) Визначення протеазної активності

Зверніться до GB/T 23527-2009 [69] з незначними модифікаціями.
① Підготовка стандартної кривої
Візьміть 1мл стандартного розчину тирозину з різними масовими концентраціями, які є 0, 1 0, 20, 30, 40 та 50 мг/л, і додайте до нього 5 мл 0,4Mol/L розчину карбонату натрію та 1мл розчину реагенту Folin. Реагуйте протягом 20 хвилин при температурі 40 градусів. Після завершення реакції вийміть реакційний розчин і вимірюйте значення поглинання розчину на довжині хвилі 680 нм за допомогою спектрофотометра. Накресліть стандартну криву тирозину з концентрацією тирозину як горизонтальної осі та значення абсорбції як вертикальної осі.

Нові трави Cistanche з сильною антиоксидантною силою

② Визначення протеазної активності
Експериментальна група: візьміть 1мл розчину казеїну з концентрацією 10 г/л і рівномірно перемішайте його з 1 мл розчину зразка, який підлягає випробуванню, і реагувати на 10 хв при температурі навколишнього середовища 40 градусів; Фільтруйте і отримуйте фільтрат після стояння, візьміть 1мл фільтрата, 5мл розчину карбонату натрію та 1 мл фель -реагенту, рівномірно перемішайте і реагують на 20 хв при температурі навколишнього середовища 40 градусів; Використовуйте спектрофотометр для вимірювання значення поглинання розчину на довжині хвилі 680 нм.
Порожній контрольний група: Візьміть 1мл розчину зразка, який підлягає перевірці, додайте трихлороцтову кислоту, повністю реагуйте на інактивацію протеази, а інші методи роботи такі ж, як і експериментальна група.

Обчисліть активність протеази відповідно до формули 5.5:
Протеазна активність (u/ml)=ak × 4/10 (5.5) де: a - поглинання розчину ферменту в експериментальній групі; K - кількість тирозину, коли поглинання дорівнює 1; 4 - загальний об'єм реакційного розчину, мл; 10 - час реакції, хв.

(5) Визначення активності целюлази [70]

Активність целюлази в ферментах, як правило, експресується кількістю глюкози, що виділяється певною кількістю розчину ферменту за одиницю часу. Принцип використання методу фільтрувального паперу для вимірювання активності целюлази полягає в тому, що целюлаза може розкладати целюлозу у фільтрувальному папері для отримання вторинних метаболітів, таких як глюкоза, і глюкоза може реагувати з 3, 5- динітросаліцилової кислоти для утворення жовтого комплексу. Колір цієї реакції відносно яскравий, що добре може визначити кількість глюкози та інших вироблених цукрів.

 

①3, 5- динітросаліцилова кислота колориметричного агента
Актурно зважуйте 1 0 G 3, 5- Дирітросаліцилова кислота з точкою плавлення 168-169, розчиняти її дистильованою водою, додаючи 20 г гідроксиду натрію та 200 г калію натрію, продовжуючи нагрівання, а не реалізовано, і розведено 500 мл. 0,5 г безводного сульфіту натрію, постійно перемішайте під час процесу додавання, поки він не буде повністю розчинений, припиніть нагрівання після змішування рівномірно, охолоджується до кімнатної температури, перенесіть усі на 1000 мл об'ємної колби, розведіть до позначки дистильованою водою, розміщуйте при кімнатній температурі протягом одного тижня, фільтруйте, отримайте супернатант, і зберігайте у пляшці реагування коричневого реагенту.②ензиматичний гідроліз
Точно Pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 мл розчину для проби ферментів у 2 мл оцтової кислоти-дію ацетату з значенням рН 4,5. Через 5 хвилин постійної температури водяної бані на 40 градусів додайте 6 шматочків хроматографічного фільтрувального паперу з площею 1 × 1 см2 відповідно, і негайно почніть час, щоб зробити час реакції точним до 60 хвилин. Негайно перенесіть на киплячу водяну баню для реакції протягом 10 хвилин, і целюлаза втрачає свою активність.

 

 

③ Колірна реакція
Візьміть розчин зразка ферменту, додайте 3 мл з 3, 5- динітросаліцилової кислоти колориметричного агента, приготованого в ①, нагрівання у киплячій водяній бані протягом 15 хвилин, вийміть, прохолодну до кімнатної температури, додайте 10мл дистильованої води, змішайте рівномірно, використовуйте спектрофотометром у довжині хвилі 550 нм.
④ Малюнок стандартної кривої глюкози
Підготуйте стандартний розчин глюкози з концентрацією 1 мг/мл точно і використовуйте дистильовану воду для виготовлення стандартного розчину глюкози з обсягом 0, 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 3 мл 3, 5- Динітросаліцилова кислота Колориметричний агент, приготований у ① для виконання реакції розвитку кольору. Наведіть стандартну криву концентрацією глюкози як горизонтальної осі та поглинання як вертикальної осі.
⑤calculation
Використовуйте значення поглинання A після розвитку кольору з розчином ферменту, а потім обчисліть кількість вивільнення глюкози M відповідно до стандартної кривої глюкози та обчисліть відповідно до формули 5.6:
Активність целюлази (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) де: m - кількість вивільнення глюкози, UG; t - час ферментативного гідролізу, хв; M - вміст ферменту в реакції, UG/мл.