Інгібування арилового вуглеводневого рецептора відновлює опосередковану індоксилсульфатом ендотеліальну дисфункцію в кільцях аорти щурів

Анотація:Theуремічний токсин індоксилсульфат(ІС), підвищений вхронічні захворювання нирок(CKD), як відомо, сприяє прогресуванню серцево-судинних захворювань. IS активує арил-вуглеводневий рецептор (AhR), який опосередковує окислювальний стрес іендотеліальна дисфункціячерез активацію шляху CYP1A1. У цьому дослідженні вивчається інгібування AhR антагоністом CH223191 на IS-опосередковане порушення функції ендотелію судин і порушення окисно-відновного балансу. Гострий вплив IS на ендотелій-залежну релаксацію оцінювали на кільцях аорти щурів Sprague Dawley, які піддавалися таким умовам: (1) контроль; (2) Є (300µМ); (3) IS + CH223191 (1µМ); (4) IS + CH223191 (10µМ). Після цього тканини оцінювали на предмет змін експресії окисно-відновних маркерів. IS зменшив максимальний рівень ендотелій-залежної релаксації (Rmax) на 42% (p < 0.001) compared to control, this was restored in the presence of increasing concentrations of CH223191 (p < 0.05). Rings exposed to IS increased expression of CYP1A1, nitro-tyrosine, NADPH oxidase 4 (NOX4), superoxide, and reduced eNOS expression (p < 0.05). CH223191 (10 µM) відновлення експресії цих маркерів до контрольних рівнів (p < 0.05). These findings demonstrate the adverse impact of IS-mediated AhR activation on the vascular endothelium, where oxidative stress may play a critical role in inducing ендотеліальна дисфункціяв судинах серця інирки. Пригнічення AhRможе забезпечити захоплюючу нову терапію ССЗ уНалаштування ХХН. 

Ключові слова:арилуглеводневий рецептор; індоксил сульфат; ендотеліальна дисфункція; хронічні захворювання нирок; серцево-судинне захворювання; окислювальний стрес

Ключовий внесок: Індоксилсульфат (IS), найбільш вивчений уремічний токсин, пов’язаний з білками, і потужний агоніст арилового вуглеводневого рецептора (AhR), як відомо, відіграє патологічну роль упрогресування ХХНіТравми, пов’язані з ХХНв інших тканинах, таких як судинна система. Це дослідження демонструє, що ex vivo інгібування AhR може запобігти IS-індукованій ендотеліальній дисфункції та пов’язаним із цим змінам окисно-відновного балансу, реалізуючи потенційно новиймета для терапії ХХН

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК

1. Введення

ХХН вражає 10% населення світу, впливаючи не лише на системи охорони здоров’я, але й накладаючи важкий тягар на економіку та продуктивність на країни по всьому світу [1,2]. Ризик розвитку серцево-судинних захворювань (ССЗ) підвищується у пацієнтів із хронічною хворобою нирок (ХХН) [3]. У цих пацієнтів накопичення недіалізованих циркулюючих зв’язаних з білками уремічних токсинів (PBUTS), таких як індоксилсульфат (IS), не тільки демонструє підвищену смертність від серцево-судинних захворювань [4], але також передбачає несприятливі серцево-судинні події у пацієнтів з хронічною серцевою недостатністю [ 5]. ХХН і підвищений рівень IS також посилюють серцево-судинні ускладнення, такі як гіпертрофія міокарда, дисліпідемія, хронічне запалення [6], а також ендотеліальну дисфункцію, що підтверджується аномальною дилатацією, опосередкованою кровотоком плечової артерії (FMD), що корелює з рівнями IS у сироватці крові [7,8]. . В інших дослідженнях було виявлено, що звуження мікроциркуляторного русла у пацієнтів із ХХН пов’язане зі зниженням розрахункової швидкості клубочкової фільтрації [9]. Крім того, дослідження на тваринах показали, що IS, незалежно від того, збільшений у моделі ХХН або введений екзогенно, сприяє порушенню ендотелій-залежної вазорелаксації [10,11].

IS походить від метаболізму триптофану, який прогресивно накопичується в сироватці крові хворих на 2–5 стадії ХХН; його висока афінність зв’язування з альбуміном перешкоджає його виведенню навіть після діалізу [4,12]. Попередні дослідження ідентифікували IS як ендогенний агоніст арилового вуглеводневого рецептора (AhR), цитозольного ліганд-залежного фактора транскрипції, який конститутивно експресується та бере участь у численних біологічних процесах, таких як окислювальний стрес, запалення, ремоделювання судин та атерогенез [13, 14]. IS-опосередкована активація AhR індукує фермент, цитохром P450 1A1 (CYP1A1) в ендотеліальних клітинах, і це пов’язано зі збільшенням виробництва активних форм кисню (АФК) [14,15]. Крім того, спостерігали підвищену експресію CYP1A1 у крові пацієнтів із ХХН [16]. Інгібування IS-опосередкованої активації AhR за допомогою селективних антагоністів, таких як 2-метил-2Н-піразол-3-карбонова кислота (2-метил-4-о-толі- Повідомлялося, що лазо-феніл)-амід (CH223191) [17] зменшує індуковане IS запалення та вироблення ROS для контролю рівнів в ендотеліальних клітинах [14,15].

Відомо, що AhR відіграє важливу роль у підтримці геномного окислювально-відновного балансу шляхом активації ксенобіотиків фази I та елементів антиоксидантної відповіді (ARE) фази II. Активація AhR запускає клітинну систему детоксикації, яка поділяється на ферменти фази I, такі як CYP1A1, що беруть участь у Виробництво АФК. Тривале утворення АФК призводить до його взаємодії з антиоксидантним фактором транскрипції ядерним фактором, еритроїдним 2-пов’язаним фактором (Nrf2), крім того, активація AhR також стимулює Nrf2 [18,19]. Nrf2 разом із протоонкогеном фактора транскрипції c-Maf зв’язується з ARE-індукуючою експресією антиоксидантних ферментів фази II NAD(P)H: хіноноксидоредуктази (NQO1) і глутатіон-S-трансферази (GSTA1/2). CYP1A1 і NRF2 відіграють гомеостатичну роль у підтримці балансу між про- та антиоксидантами [18,19].

Варіанти лікування, які обмежують шкідливий вплив PBUT, таких як IS, обмежені. Пероральний адсорбент AST-120, який видаляє з кишківника попередники уремічного токсину, такі як індол, зменшує утворення та циркулюючі рівні IS та інших PBUT, отриманих з індолу. AST-120 використовувався в невеликих клінічних випробуваннях з певним успіхом [20–22], у результаті яких він був схвалений у кількох азіатських країнах. Однак великі клінічні випробування III фази EPPIC-1 і -2 (Evaluating Prevention of Progression in CKD) продемонстрували, що АСТ-120 не відповідає первинній кінцевій точці [23]. Це викликає потребу в альтернативних стратегіях, які можуть запобігти механізму дії ІБ. In vitro було показано, що AhR є ефективною мішенню, чиє інгібування може блокувати подальші дії IS та потенційно інших метаболітів триптофану [13,14] і може забезпечити терапевтичну користь у зниженні ризику ССЗ при ХХН та полегшенні його прогресування.

У той час як більшість досліджень in vitro, що оцінюють інгібування AhR, використовують siRNA або інгібітори малих молекул, такі як чистий антагоніст AhR CH223191 [17], не було проведено жодних досліджень ex vivo з оцінкою впливу цього антагоніста на релаксацію ендотелію для визначення «доказу принципу». Метою цього дослідження було оцінити вплив інгібування AhR на ізольовану тканину аорти для запобігання IS-індукованого порушення ендотеліально-залежної судинної функції шляхом полегшення IS-опосередкованого окисного стресу та експресії гена CYP1A1, пов’язаної з активацією AhR, а також вивчити вплив на антиоксидантну систему.

2. Результати

2.1. Вплив інгібування арилового вуглеводневого рецептора на IS-порушену ендотелій-залежну релаксацію

Кільця аорти здорових щурів піддавали IS (10–300 мкМ), щоб визначити оптимальну дозу IS, що спричиняє порушення релаксації ендотелію. IS при 300 мкМ, але не 10 мкМ або 100 мкМ, значно знижував залежну від ендотелію релаксацію (Rmax) до ацетилхоліну (ACh) порівняно з контролем на 32% (p <0,05; рис. 1A), і ця концентрація була використовувати в подальших експериментах. У наступних експериментах у присутності інгібітора AhR, CH223191 (1 і 10 мкМ), було попереджено IS-індуковане порушення Rmax (42%) (p <0,001, рис. 1B, табл. 1). У кільцях аорти, стимульованих лише IS, ефективність ACh (-pEC50) була знижена порівняно з контролем (p < 0,01) і відновилася в присутності CH223191 (p < 0,05; таблиця 1). Щоб визначити, чи інгібітор AhR сам по собі демонструє будь-який внутрішній вплив на ендотелій-залежну релаксацію, кільця аорти інкубували лише з CH223191 і не виявляли жодного впливу на значення Rmax або -pEC50 (таблиця 1, а також додатковий малюнок S1).

Рисунок 1. Вплив CH223191 на реактивність судин. (A) Вплив IS (300 мкМ) на кільця аорти знижував стимульовану ACh ендотелій-залежну релаксацію (p <0,05; N=6). (B) Попередня інкубація з CH223191 (1 мкМ і 10 мкМ) запобігала зниженню IS-індукованої ендотелій-залежної релаксації (p <0,001; N=10). Точки даних виражені як середнє ± SEM

2.2. Вплив IS на ендотелій та ендотеліальну синтазу оксиду азоту

Після завершення реакцій функціональної релаксації на ACh зрізи тканин цих кілець аорти аналізували за допомогою імуногістохімії на ендотеліальні клітини та експресію ендотеліальної синтази оксиду азоту (eNOS). Не було змін в ендотеліальних клітинах, як визначено за допомогою фарбування на антиген ендотеліальних клітин щурів{{0}} (RECA-1) за чотирьох досліджених умов (Малюнок 2A). Проте зрізи кільця аорти, пофарбовані на eNOS, продемонстрували, що вплив IS значно знижує експресію eNOS на 75% поверхні просвіту ендотелію (p < 0.01), тоді як у присутності CH223191 цьому зниженню запобігає присутність 10 мкМ CH223191 (Рисунок 2B–F; p <0,05).

Рисунок 2. IS знижує експресію eNOS без втрати ендотеліальних клітин. (A) Фарбування маркера ендотеліальних клітин RECA-1 в оброблених IS кільцях аорти за відсутності та присутності CH223191. (B) Експресія ендотеліального NOS знижена в присутності IS була попереджена за допомогою CH223191. Типові зображення фарбування eNOS у (C) контрольній тканині, (D) обробленій IS, IS у присутності (E) 1 мкМ та (F) 1{{10}} мкМ CH223191. Стрілки вказують на позитивне фарбування. Дані, виражені як середнє 土 SEM з=10 експериментів. ** p < 0,01 порівняно з контрольною тканиною, #fp < 0,05 порівняно з IS експонованою тканиною Збільшення X400.

2.3. Вплив IS та CH223191 на про- та антиоксидантну дію

Відомо, що індукована IS активація AhR підвищує CYP1A1. Ми виявили, що IS (3{{10}}0 мкМ) значно підвищив експресію CYP1A1 в кільцях аорти через 1 і 4 години майже в дев’ять і сім разів відповідно порівняно з контрольними умовами (p <0,05, малюнок 3). CH223191 при 1 і 10 мкМ знижував IS-опосередковану експресію гена CYP1A1 після 1 години стимуляції IS до подібних рівнів, що спостерігалися в кільцях з контрольною експозицією, тоді як після 4 годин стимуляції IS лише 10 мкМ CH223191 вдалося значно знизити рівні CYP1A1 (p <0,001 , малюнок 3). При дослідженні антиоксидантного шляху IS за відсутності та присутності CH223191 не спровокував зміну експресії генів Nrf2, NQO1 та GSTA1/2 (Див. Додатковий малюнок S2)

2.4. Вплив IS та CH223191 на маркери окисного стресу та запалення

Для подальшого вивчення змін окисно-відновного балансу тканини з функціональних експериментів були проаналізовані для вивчення змін маркерів окисного стресу, а саме нікотинаміаденіндинуклеотидфосфат (NADPH) оксидази 4 (NOX4), експресії супероксиду та нітротирозину. Тканини, які зазнали впливу IS, продемонстрували збільшення експресії NOX4 на 180% (рис. 4; p < 0.001). У присутності CH223191 (1 і 1 0 мкМ) експресія NOX 4 була значно знижена порівняно з IS (рис. 4; p < 0,001). Експозиція IS підвищувала рівні експресії нітротирозину, маркера пошкодження клітин і фарбування запалення, на 90% порівняно з контролем (рис. 5; p <0,05), тоді як у присутності CH223191 (10 мкМ) експресія нітротирозину була знижена повернутися до контрольних рівнів (рис. 5; p < 0,05). Експресію молекули активних форм кисню, супероксиду, визначали фарбуванням дигідроетидієм (DHE). Вплив IS збільшив фарбування DHE на 430% порівняно з контролем (рис. 6; p < 0,001), тоді як у присутності CH223191 в обох дозах експресія супероксиду була знижена до контрольних рівнів, як показано на малюнку 6; (р <0,001

Експресію генів запальних маркерів також досліджували в аорті, стимульованій за відсутності або присутності CH223191. IS викликав незначне збільшення на 111 і 55% експресії гена фактора некрозу пухлини a (TNFa) та молекули адгезії судинних клітин-1VCAM-1, відповідно, через 4 години. У присутності CH223191 рівні експресії обох генів були значно знижені, як показано на малюнку 7 (p < 0.05).

Малюнок 6. CH223191 запобіг IS-індукованій експресії супероксиду. (A) Кількісне визначення фарбування DHE в оброблених S-кільцях аорти за відсутності та присутності CH223191. Типові зображення експресії супероксиду в (B) контрольній тканині, (C) оброблена IS, IS у присутності (D) 1 мкМ та (E) 1{{10}} M CH223191Дані, виражені як середнє значення SEM з N=10 експериментів. *** p < 0,001 у порівнянні з контрольною тканиною#### p < 0,001 у порівнянні з тканиною, підданою IS. Збільшення х200.

Рисунок 7. Вплив інгібування IS та Ahk на експресію гена запалення. Вплив кілець аорти IS на незначне підвищення (A) TNFa та (B) VCAM-1 експресії генів через 4 год. У присутності CH223191 експресія TNFx і VCAM-1 була попереджена. Дані, виражені як середнє 土 SEM з=6 експериментів. # p < 0.05 порівняно з IS експонованою тканиною.