Апоцинін покращує індуковане глутаматом натрію пошкодження яєчок через порушення гематогенного бар’єру та параметрів окисного стресуⅠ

Анотація:

Передумови: це дослідження мало на меті дослідити вплив апоциніну (APO) на рівні гормонів, бар’єр крові та яєчок і окислювальні біомаркери в дегенерації яєчок, спричиненій глутаматом натрію (MSG). Методи: самці щурів Sprague Dawley (150–200 г; n=32) були випадковим чином розподілені на чотири групи: контрольна, APO, MSG і MSG плюс APO. MSG і MSG плюс APO групам вводили MSG (120 мг/кг) протягом 28 днів.

Клацніть, щоб дізнатися про тестостерон

Крім того, групи APO і MSG плюс APO отримували APO (25 мг/кг) протягом останніх п’яти днів експерименту. Усі введення проводили через пероральний зонд. Нарешті, були проведені біохімічні аналізи на основі визначення тестостерону, фолікулостимулюючого гормону (ФСГ), лютеїнізуючого гормону (ЛГ), малонового діальдегіду (МДА), глутатіону (ГШ) і супероксиддисмутази (СОД), а також світло і пропускання. проводили електронно-мікроскопічні дослідження, оцінку параметрів сперми, ZO-1, оклюдин, NOX-2 та імуногістохімію TUNEL.

Результати: MSG підвищив як рівень окислювального стресу, так і апоптоз, зменшив проліферацію клітин і спричинив дегенерацію морфології яєчок, у тому числі в бар’єрі між кров’ю та яєчками. Введення апоциніну змінило всі погіршені морфологічні та біохімічні параметри в групі MSG плюс APO. Висновки: вважається, що апоцинін запобігає дегенерації яєчок шляхом підтримки цілісності бар’єру «кров-яєчка» зі збалансованим рівнем гормонів і оксидантів/антиоксидантів.

Ключові слова: глутамат натрію; апоцинін; NOX-2; гематотестиальний бар'єр; ультраструктура

1. Введення

Широко використовувана L-глутамінова кислота, як добавка, зустрічається в природі в різноманітних харчових продуктах і є джерелом підсилювача смаку, глутамату натрію (MSG) [1]. Багато оброблених харчових продуктів містять MSG як добавку, із середнім добовим споживанням у промислово розвинутих країнах Європи 0.3 до 1.0 г. [2]. Незважаючи на те, що організації з безпеки харчових продуктів вважають споживання MSG безпечним, у кількох доклінічних і клінічних дослідженнях воно все ще ставиться під сумнів, особливо його довготривалий вплив. Серед фізіологічних функцій глутамату є його властивість нейромедіатора в центральній нервовій системі, як попередника таких метаболітів, як глутатіон [1].

Доведено, що тривале споживання MSG негативно впливає на чоловічу репродуктивну систему. Дослідження показали, що тривале споживання MSG знижує кількість сперматозоїдів у чоловіків і впливає на морфологічну структуру сперматозоїдів і яєчок [3]. Більшість цитованих раніше досліджень зосереджувалися насамперед на токсичності MSG у щурів у дозах 2000–8000 мг/кг маси тіла, що вкрай малоймовірно для людей на такому рівні [4].

Алометричне перетворення Shin та ін. [5] показали, що ця доза еквівалентна 120 мг/кг маси тіла у щурів. Існує значна кількість рецепторів глутамату в репродуктивних органах і спермі, що робить їх сприйнятливими до пошкодження збудження від надлишку глутамату в організмі. Це робить репродуктивну систему частою мішенню для пошкоджень, спричинених глутаматом. Крім того, відомо, що токсичність глутамату безпосередньо пошкоджує гіпоталамо-гіпофізарно-гонадну вісь, що призводить до гомеостатичного дисбалансу в репродукції [6].

MSG спричиняє окисне пошкодження (підвищене перекисне окислення ліпідів і зниження активності антиоксидантних ферментів) і сперматогенні зміни, що проявляються низькою кількістю сперматозоїдів і морфологічними аномаліями [3]. Таким чином, ми вивчали вплив перорального споживання MSG на щурів, коли вони ковтали помірну дозу, екстрапольовану безпосередньо з щоденного споживання людьми. Цей вплив дози MSG на морфологію яєчок щурів також спостерігався в експериментальних дослідженнях [3,7].

Надмірне виробництво активних форм кисню (АФК) викликає окислювальний стрес і апоптоз. Завдяки своїй реактивній структурі вільні радикали можуть взаємодіяти з ліпідами, нуклеїновими кислотами та білками та мати шкідливий вплив на організм [8]. Відомо, що окислювальний стрес, індукований АФК, відіграє важливу роль у чоловічому безплідді [9]. Дослідження показали, що НАДФН-оксидаза (NOX) є одним із основних джерел АФК [10]. Надмірні АФК і окислювальний стрес у чоловічій репродуктивній системі викликають негативні зміни в концентрації, рухливості та морфології сперми. Дегенерована сперма та порушення параметрів сперми призводять до безпліддя [11]. АФК викликає чоловіче безпліддя через пошкодження ДНК сперми [12]. Окислювальний стрес порушує цілісність плазматичної мембрани сперматозоїдів і індукує ранню дієздатність.

Внаслідок цього знижується запліднювальна здатність сперматозоїдів і виникає безпліддя [13]. Відомо, що апоцинін (APO), екстрагований з коренів рослини Apocynum cannabinum, є ефективним інгібітором NOX [14]. Протизапальну дію АПО було продемонстровано в багатьох експериментальних дослідженнях [15]. Активація NOX відбувається через міграцію цитозольних компонентів до клітинної мембрани [16,17]. APO діє як селективний інгібітор виробництва АФК, впливаючи на активність NOX в активних нейтрофілах людини.

Однак АПО не впливає на фагоцитоз чи інші механізми внутрішньоклітинної смерті [18,19]. Ізоформи NOX експресуються в різних клітинах і мають різні фізіологічні функції. NOX-2 є ізоформою NOX, яка присутня в еозинофілах, макрофагах і нейтрофілах [20]. До сперматогенних клітин підключаються і клітини Сертолі. Цей динамічний зв'язок регулюється щільними і щілинними з'єднаннями [21]. Тісні з’єднання між клітинами Сертолі важливі для формування та функціонування гематотестичного бар’єру (ГТБ).

Структура BTB включає тісні контакти, десмосоми, базальні ектоплазматичні спеціалізації та щілинні контакти. Тісні з’єднання епітеліального походження — це багатомолекулярні спеціалізації мембран, які містять кілька інтегральних мембранних білків, таких як zonula occludens-1 (ZO-1) і оклюдин [21]. Окклюдини є однією з молекул, які сприяють утворенню щільних контактів. Білки Zonula occludens, такі як zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2 і ZO-3, є важливими білками, залученими до цієї структури. Оклюдин, ZO-1 і ZO-3 взаємодіють з актиновим цитоскелетом. Білок ZO-3 асоціюється з цитоплазматичними доменами ZO-1 і оклюдіном [22].

Окислювальний стрес виникає, коли не вистачає антиоксидантів проти вільних радикалів. Зниження активності антиоксидантних ферментів, таких як рівні супероксиддисмутази (SOD) і глутатіону (GSH), призводить до збільшення окисного пошкодження [23]. Малоновий діальдегід (MDA), параметр пошкодження клітинної мембрани, вказує на щільність атаки кисневих радикалів у реактивних клітинах і метаболізм вільних радикалів in vivo. Зниження SOD і підвищення MDA викликають окислювальний стрес і викликають пошкодження клітин, що призводить до їх загибелі [24]. Дослідження показали, що NOX-2 є джерелом АФК [20,25]. APO, потужний інгібітор NOX-2 [26], може бути ефективним у інгібуванні NOX-2 для запобігання пошкодженню тканин через окислювальний стрес.

Введення APO може мати лікувальний ефект на параметри окисного стресу та гістопатологічні пошкодження. Це дослідження мало на меті оцінити вплив MSG на пошкодження тканини яєчок, проліферацію клітин, апоптоз і окислювальний стрес, про що свідчить експресія NOX-2 і на гематоестикулярний бар’єр. Крім того, дослідження мало на меті дослідити, чи може апоцинін покращити вплив на всі ці параметри.

2. Матеріали та методи

2.1. Експериментальний дизайн

Це експериментальне дослідження було схвалено Комітетом з етики університету Acibadem Mehmet Ali Aydinlar Experimental Animals (ACU-HADYEK, номер дозволу: HDK2020/39). У цьому дослідженні 8-тижневих самців щурів-альбіносів Sprague Dawley (n=32) утримували в клітках із температурою 22 ± 2 ◦C і стандартним світлом/темрявою (12:12 год.) цикл. Щурів годували стандартною тваринною їжею ad libitum протягом 28 днів експериментального періоду. Це дослідження проводилося згідно з рекомендаціями та правилами ARRIVE (Дослідження на тваринах: звітування про експерименти in vivo). У цьому дослідженні щури-самці Sprague Dawley (n=8 у кожній групі) були випадковим чином розділені на 4 контрольні групи: APO, MSG і MSG плюс APO. Контрольній групі щурів перорально вводили дистильовану воду (1 мл) протягом 28 днів. Групам MSG і MSG плюс APO вводили 120 мг/кг MSG перорально протягом 28 днів поспіль [4]. Групам APO та MSG плюс APO вводили 25 мг/кг APO перорально в останні 5 днів експерименту [27]. Щотижня аналізували вагу щурів в дослідних групах. Після анестезії ізофлураном щурів умертвляли. Для біохімічного та мікроскопічного дослідження використовували зразки крові, а також зразки тканин яєчка та придатка яєчка.

2.2. Вимірювання концентрації тестостерону, ФСГ і ЛГ у сироватці крові

Концентрації тестостерону, фолікулостимулюючого гормону (ФСГ) і лютеїнізуючого гормону (ЛГ) у сироватці крові вимірювали за допомогою наборів для твердофазного імуноферментного аналізу (ELISA). Тестостерон щурів (номер за каталогом: EA0023Ra, ELISA kit Bioassay Technology Laboratory), щурячий ФСГ (номер за каталогом: EA0015Ra, лабораторія Bioassay Technology, Шанхай, Китай) і набори LH щурів ELISA (номер за каталогом: EA0013Ra, лабораторія Bioassay Technology) використовувалися для аналіз рівня гормонів за методикою набору. Результати тестостерону надано в нмоль/л, а ФСГ і ЛГ — у мМО/л

2.3. Вимірювання тестикулярних рівнів MDA, GSH та SOD

Рівні MDA визначали за допомогою комерційного набору (E-BC-K025-M, Elabscience, Houston, TX, USA). MDA, один із продуктів розпаду перекисного окислення ліпідів, реагує з тіобарбітуровою кислотою (TBA) з утворенням рожевого комплексу з максимумом поглинання 532 нм. Рівні МДА в тканині розраховували в нмоль/г. Аналіз GSH у тканині яєчок проводили за методом Beutler [28]. Принцип методу заснований на тому факті, що GSH в пробірці для аналізу реагує з 5,50 -дитіобіс-2-нітробензойною кислотою (DTNB), утворюючи жовтувате забарвлення. Інтенсивність світла цього кольору зчитували на спектрофотометрі при довжині хвилі 410 нм. Гомогенати тканини центрифугували, до отриманого супернатанту додавали 10-відсотковий розчин ТХА, перемішували та знову центрифугували для осадження білків. Яскраво забарвлені супернатанти використовували для аналізу GSH. Інтенсивність забарвлення, що утворилася у зразках, які зберігалися при кімнатній температурі протягом 5 хвилин, зчитували при 410 нм на спектрофотометрі, а рівні GSH у мкмоль/г у тканині визначали за допомогою стандартної кривої глутатіону. Активність SOD визначали за допомогою набору Sigma SOD Determination Kit (E-BC-K019-M, Elabscience, Houston, TX, USA). Значення абсорбції зчитували при 450 нм після інкубації активності SOD з робочим розчином ферменту. Рівень СОД у тканині розраховували в МО/г

2.4. Кількість, рухливість і морфологія сперматозоїдів

Зразки тканини епідидиму щурів поміщали в розчин збалансованих солей Ерла з буферним розчином Hepes і обробляли для аналізу кількості, рухливості та морфології сперматозоїдів на основі попереднього дослідження [27]. Коротко, зразки тканини придатка яєчка щурів переносили в розчин збалансованих солей Ерла з додаванням буферного розчину Hepes після розтину. Для оцінки сперматозоїдів використовували звичайний метод градієнта щільності. Супернатант видаляли, а осад розбавляли середовищем для промивання сперматозоїдів (SAGE, Ньюкасл-апон-Тайн, Великобританія) і центрифугували. Потім осад розбавляли середовищем для підготовки сперми (SAGE, Великобританія). Пелету розміром 10 мкм використовували для підрахунку сперматозоїдів у лічильній камері Macler (Sefi cut out Medical Instruments, Хайфа, Ізраїль) за допомогою фотомікроскопа для їх підрахунку. Для морфологічної оцінки готували мазки, які потім фарбували за допомогою набору Diff-Quick (Medion Diagnostics, Grafelfing, Мюнхен, Німеччина). На кожному предметному склі 100 сперматозоїдів досліджували при 100-кратному збільшенні за допомогою фотомікроскопа (Zeiss A1 Axio Scope, Оберкохен, Німеччина) для оцінки морфології сперми.

2.5. Обробка тканин для світлової мікроскопії

Тканини яєчок фіксували розчином Буена для планових гістологічних досліджень. Для імуногістохімічного дослідження тканини яєчка фіксували 4% розчином параформальдегіду (PFA). Після фіксації тканини проходили звичайну процедуру парафінування [29]. Для звичайної гістологічної оцінки зрізи фарбували гематоксиліном і еозином (H&E). Для виявлення структури базальних мембран сім'яних канальців застосовували періодичну реакцію Шіффа (PAS). Сім’яні канальці в H&E-забарвлених зрізах яєчок оцінювали на основі модифікованих гістопатологічних параметрів Джонсена [30,31]. Крім того, вимірювали товщину епітелію 100 сім’яних канальців у всіх зрізах за допомогою програми Image J (програмне забезпечення Image J, Національний інститут здоров’я).

2.6. Термінальна дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP Nick End Labeling (TUNEL) Імунохімія

Метод кінцевої дезоксинуклеотидилтрансферази dUTP нік-кінцевого маркування (TUNEL) застосовували до зрізів тканини яєчка відповідно до інструкції з використання набору, наданої виробником (ApopTag Plus, In Situ Apoptosis Detection Kit, S7101, Merck Millipore, Дармштадт, Німеччина). Коротше кажучи, після депарафінізації та регідратації зрізи промивали PBS і потім нагрівали в мікрохвильовій печі в цитратному буфері. Після охолодження протеїназу К (20 мкг/мл) капали на зрізи тканини. Зрізи промивали дистильованою водою і замочували в 3% розчині перекису водню. Після промивання в PBS 10 мкл стабілізуючого тампона поміщали на зрізи на 30 хвилин при кімнатній температурі. Потім капали 10 мкл ферменту Tdt і зрізи інкубували протягом 1 години при 37 ◦C. Буфер для зупинки промивання капали протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Після промивання PBS на зрізи капали 13 мкл антидигоксигеніну. Після інкубації при кімнатній температурі протягом 30 хв зрізи промивали 4 рази протягом 2 хв у PBS. Потім додавали 13 мкл розчину 3,3'-діамінобензидину (DAB). Потім зрізи струшували з дистильованою водою. Для контрастного фарбування зрізи змочували в розчині гематоксиліну Mayer (JT Baker, Center Valley, PA, USA). Після промивання в дистильованій воді секції монтувалися з італ. Зрізи знімали за допомогою світлового мікроскопа (Zeiss A1 Axio Scope, Oberkochen, Німеччина). Індекс апоптозу оцінювали діленням загальної кількості канальців яєчка на кількість сім’яних канальців з 3 або більше TUNEL-позитивними клітинами [32].

2.7. Імуногістохімія проліферуючого клітинного ядерного антигену (PCNA).

Зрізи піддавали імуногістохімічному дослідженню PCNA для визначення кількості проліферативних клітин та індексу проліферації. Після депарафінізації та регідратації зрізи обробляли для імуногістохімії PCNA, як описано в попередньому дослідженні [32]. Коротше кажучи, зрізи зберігали в 3-відсотковому розчині перекису водню (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США) протягом 20 хвилин. Зрізи нагрівали в мікрохвильовій печі при 200 Вт в буфері етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA) (Sigma-Aldrich, США) протягом 20 хв. Після промивання PBS 3 рази зрізи замочували в 5-відсотковому розчині блокуючої козячої сироватки (Invitrogen, Waltham, MA, USA) протягом 10 хвилин. Потім було застосовано первинне кроляче антитіло до PCNA (№ за каталогом: SY12-07, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA) (1:50). Зрізи зберігали у зволоженій камері при 4 ◦C протягом ночі та промивали 3 рази PBS по 5 хвилин кожен раз. Мічене біотином козяче антикроляче вторинне антитіло (№ за каталогом: A16100, Invitrogen, Waltham, MA, USA) (1:500) додавали на зрізи та витримували при 37 ◦C протягом 30 хвилин. Стрептавідинпероксидазу (Invitrogen, Waltham, MA, USA) закапували в зрізи та залишали на 10 хв. Після триразового промивання PBS зрізи замочували в 3,30 -діамінобензидиновому (DAB) хромогені (1 мл субстрату DAB плюс 30 мкл DAB хромогену) протягом 5 хв. Після промивання дистильованою водою зрізи фарбували розчином гематоксиліну Майєра для контрастного фарбування. Потім секції були змонтовані гліцериновим желатином Кайзера (№ за каталогом: 1.09242, Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина). Зрізи досліджували під світловим мікроскопом (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Німеччина). Для визначення індексу проліферації кількість PCNA-позитивних клітин у 20 канальцях кожної ділянки ділили на загальну кількість клітин [32].

2.8. Імуногістохімія ZO-1 та Окклюдину

Зрізи тканин, фіксовані 4 відсотками PFA, були депарафіновані та повторно гідратовані спиртовими розчинами. Потім зрізи замочували в 3-відсотковому розчині перекису водню (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) протягом 20 хвилин для блокування ендогенних ферментів. Після промивання PBS зрізи нагрівали в мікрохвильовій печі при 200 Вт в буфері EDTA (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Зрізи охолоджували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі та зберігали 3 рази по 5 хвилин кожен у PBS, а потім 10 хвилин у 10-відсотковій буферній козячій сироватці (Invitrogen, США). Зрізи обробляли кролячим анти-ZO-1 (№ за каталогом: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, США) та кролячим антиокклюдином (1:100) (№ за каталогом: {{18} }, Invitrogen, Waltham, MA, USA) антитіла (протягом ночі, при плюс 4 ◦C). Після 3-разового промивання в PBS протягом 5 хвилин на зрізи нанесли мічене біотином антикроляче вторинне антитіло (№ за каталогом: 65-6140, Invitrogen, Waltham, MA, USA) (1:1000). Після замочування в PBS 3 рази по 5 хвилин на зрізи наносили стрептавідин-пероксидазу (Invitrogen, Waltham, MA, США). Після промивання в PBS додавали AEC Single/Plus Chromogen (Abcam, Кембридж, Великобританія), зрізи струшували з дистильованою водою та змішували з гліцериновим желатином Kaiser (№ за каталогом: 1.09242, Sigma-Aldrich, Дармштадт, Німеччина). Зрізи знімали за допомогою світлового мікроскопа (A1 Axio Scope, Oberkochen, Zeiss, Німеччина). Інтенсивність імунореактивності як ZO-1, так і окклюдину розраховували за допомогою програми Image J (програмне забезпечення 1.44, Національний інститут здоров’я).

2.9. Імунофлуоресцентний аналіз ZO-1, окклюдину та NOX-2

Зрізи витримували в 3% перекису водню і промивали PBS. Потім зрізи інкубували з кролячим анти-ZO-1(1:100) ZO-1(номер за каталогом: 61-7300, Invitrogen, Waltham, MA, США), кролячим анти-окклюдином (1 :100) (Каталожний номер: 71-1500, Invitrogen, США) і кролячі анти-NOX-2 первинні антитіла (1:100) (Каталожний номер: NBP2-41291, Novus, BioTechne, Міннесота, США). Предметні скла промивали PBS, а потім інкубували з AF 488 (№ за каталогом: ab150077, Abcam, США), міченим козячим антикролячим вторинним антитілом (1:1000). Після того, як зрізи востаннє промивали PBS, їх додавали в розчин 406- діаміно-2-феніл-ідолу (DAPI) (№ за каталогом: ab104139, Abcam, Бостон, Массачусетс, США). Зрізи знімали за допомогою флуоресцентного мікроскопа (мікроскоп Zeiss Axio Scope.A1 з флуоресцентною приставкою Zeiss AxioCam MRc 5 камерою). Інтенсивність флуоресценції на сфотографованих зрізах розраховували за допомогою програми Image J (програмне забезпечення Image J, Національний інститут здоров’я).

2.10. Обробка тканин для трансмісійної електронної мікроскопії

Зразки тканини яєчок фіксували забуференим 2,5-відсотковим розчином глутарового альдегіду (у 0,1 М PBS, рН 7,2) і обробляли для стандартної трансмісійної електронної мікроскопії згідно з раніше опублікованим протоколом [32]. Зрізи аналізували під просвічуючим електронним мікроскопом (TALOS L 120 C, Thermo Scientific Fisher, Ейндховен, Нідерланди).

2.11. Статистичний аналіз

Дані були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу та множинних порівняльних тестів Тьюкі, причому p < 0.05 вважалося значущим. Статистичний аналіз проводили за допомогою Graph Pad Prism 8.0 (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

Як Cistanche підвищує тестостерон?

Цистанхе - це трава, яка традиційно використовується в китайській медицині для підвищення енергії, лібідо та загальної життєвої сили. Вважається, що цистанхе може підвищити рівень тестостерону шляхом пригнічення активності ферменту під назвою ароматаза, який перетворює тестостерон в естроген. Було також виявлено, що цистанхе збільшує виробництво лютеїнізуючого гормону (ЛГ) в організмі. ЛГ відіграє вирішальну роль у регуляції вироблення тестостерону в яєчках. Підвищуючи рівень ЛГ, Cistanche може опосередковано підвищувати вироблення тестостерону. Крім того, Cistanche також містить кілька фітохімічних речовин, таких як ехінакозид і актеозид, які мають антиоксидантні властивості. Ці сполуки можуть допомогти захистити яєчка та інші репродуктивні органи від окисного пошкодження, тим самим покращуючи їхню функцію та збільшуючи вироблення тестостерону. Загалом, точні механізми, за допомогою яких Cistanche підвищує рівень тестостерону, до кінця не вивчені, але, ймовірно, це взаємодія інгібування ароматази, збільшення виробництва ЛГ та надання антиоксидантної підтримки репродуктивній системі.

Далі буде...

Мерве Ачікель-Елмас 1,*, Салва Асма Алгілані 1, Бегум Шахін 1, Озлем Бінгол Озакпінар 2, Мерт Гечім 2, Кутай Кероглу 3 і Серап Арбак 1

1 Кафедра гістології та ембріології, Медичний факультет, Університет Аджибадема Мехмета Алі Айдінлара, Icerenkoy Mah., Kayisdagi Cad. No. 32, Atasehir, Стамбул 34752, Туреччина

2 Кафедра біохімії, Факультет фармації, Університет Мармара, Basibuyuk Yolu, 4/A, Basibuyuk, Istanbul 34854, Turkey

3 Кафедра гістології та ембріології, Школа медицини, Університет Мармара, Basibuyuk Yolu No. 9 D:2, Maltepe, Istanbul 34854, Turkey