Антиоксидантна та відбілююча дія надземної частини Euphorbia Supina Raf. Екстракт

Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com

Sa-Haeng Kang1, Yong-Deok Jeon2, Ji-Yoon Cha1, Sung-Woo Hwang1, Hoon-Yeon Lee1, Min Park1, Bo-Ri Lee1, Min-Kyoung Shin2, Su-Jeong Kim3, Sang-Min Shin3, Dae- Кі Кім4, Чон-Сік Джин2* та Янг-Мі Лі1

Анотація

фон: Молочай супинний(ЕС) знайшов широке застосування в народній медицині завдяки своїм антибактеріальним, кровоспинним і протизапальним властивостям. Метою цього дослідження було оцінити антиоксидантну та відбілюючу дію 70-відсоткового етанольного екстракту ES.

Методи:Надземні частини вESрослини екстрагували 70% етанолом. Життєздатність клітин B16F10 оцінювали методом MTT для визначення нетоксичних доз для подальших експериментів. Theтирозиназаі клітинну тирозиназну активність потім вимірювали за допомогою ферментно-субстратного аналізу. Крім того, експресію пов'язаних з відбілюванням білків вимірювали за допомогою вестерн-блоттингу.

Результати:Антиоксидантна активність зразків ES збільшувалася залежно від дози, що підтверджено їх активністю поглинання радикалів у 2,2-дифеніл-1-1-пікрилгідразилі та 2,2-азино-біс-( 3-етилбензтіазолін-6-сульфонова кислота). TheESекстракт значно зменшуєтьсятирозиназаактивність і вміст меланіну залежно від дози. Крім того, він зменшив індуковану меланоцит-стимулюючим гормоном (MSH) експресію протеїну тирозинази та асоційованого з мікрофтальмією фактора транскрипції (MITF).

Висновки:Наші результати показують, щоESекстракт ослаблений-МШ-стимулює синтез меланіну шляхом модуляціїтирозиназаі вираз MITF. Таким чином, екстракт ES може бути перспективним терапевтичним засобом для лікування гіперпігментації та як інгредієнт косметичних засобів для відбілювання шкіри.

Ключові слова: Молочай супинний(ES), DPPH, меланогенез,Тирозиназа, MITF,-МШ

Цистанхе є природним інгібітором тирозинази

Фон

Меланін є основним пігментом, який контролює колір шкіри та волосся. Це високомолекулярна сполука, широко поширена в організмі тварин і рослин [1]. Меланін захищає шкіру від ультрафіолетового випромінювання. Однак, коли виробляється в надлишку, пігмент накопичується в шкірі з утворенням плям і веснянок, і ці ураження можуть спричинити рак шкіри [2]. Тому, щоб запобігти надлишковій пігментації шкіри, необхідно пригнічувати вироблення меланіну [3]. Меланоцити, розташовані в базальному шарі епідермісу і контролюютьсятирозиназа, виробляють меланін шляхом меланогенезу та містять такі ферменти, як споріднений з тирозиназою білок -1 (TRP-1) і допахрометаутомераза (DCT) [4]. Тирозиназа каталізує утворення хінону 3,4-дигідроксифенілаланіну (ДОФА) з ДОФА та утворення меланіну з хінону ДОФА шляхом автоокислення та ферментативних реакцій [5]. Таким чином, виробництво меланіну пов’язане з експресією тирозинази та активацією TRP-1. Таким чином, ми дослідили, чиМолочай супинний(ES) може впливати на зв'язок між тирозиназою та меланіном.

Тирозиназаактивність є важливою в дослідженнях відбілювання шкіри [6]. Різні хімічні речовини та рослинні екстракти, такі як аскойєва кислота, арбутин, вітамін С і гідрохінон, використовуються в косметиці для відбілювання шкіри. Однак їх використання було обмеженим через їхні побічні ефекти, такі як забарвлення, запах і цитотоксичність [7]. Тому останні дослідження зосереджені на розробці засобів для відбілювання шкіри з безпечних для шкіри натуральних продуктів.

У цьому дослідженніESбув використаний для розробки безпечної сполуки з антиоксидантною дією та ефектом відбілювання шкіри. ES є однорічною трав'янистою рослиною і широко використовується в традиційних трав'яних рецептах. Він широко поширений у помірних і тропічних регіонах, таких як Корея, Китай і Японія. Використовується в народній медицині проти різних запальних захворювань [8, 9]. Повідомлялося про дослідження, зосереджені на компонентах ES, таких як дубильні речовини [10, 11], фенольні речовини та флавоноїди [12, 13], а також терпеноїди [14, 15]. Крім того, повідомлялося про протипухлинний ефект in vitro при метастазах раку молочної залози [16] та антиоксидантну активність фенольних сумішей ES [17]. Однак in vitro антиоксидантна активність 2,2-дифенілу{{13 }}Аналіз пікрилгідразилу (DPPH) і 2,2′-азино-біс-3-етилбензтіазолін-6-сульфонової кислоти (ABTS), а також вплив екстрактів ES на відбілювання шкіри на клітини меланоми не з’ясовано. Таким чином, метою цього дослідження було визначити антиоксидантну та відбілюючу дію ES in vitro та підтвердити його ефективність як нового засобу для відбілювання шкіри.

методи

Приготування екстракту ЕС

ESнадано фармацевтичною компанією Wonkwang (Іксан, Чонбук, Корея). Надземні частини (стебло і лист) ES (250 г) кип'ятили з 70% етанолом при 70 градусах протягом 2 годин. Після фільтрації залишок знову кип'ятили двічі, як описано вище. Об'єднані фільтрати випарювали при 45°С і ліофілізували для отримання неочищеного екстракту з виходом 60 г (24 відсотки). Екстракт перед дослідами зберігали при 4 градусах. Зразок ваучера (JUHES-1660) ​​було збережено у відділі ресурсів східної медицини Національного університету Чонбук (Іксан, Корея).

екстракт цистанки

Культура клітин

Клітини мишачої меланоми B16F10 (CRL-6475) були придбані в Американській колекції типових культур (ATCC; Манассас, Вірджинія, США). Клітини культивували в модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM), що містило 2 мМ глутаміну, доповнене 10 відсотками фетальної бичачої сироватки (FBS), 100 одиниць/мл пеніциліну та 100 мкг/мл стрептоміцину в культуральних колбах в CO2-інкубаторі з зволожена атмосфера 5 відсотків CO2 у повітрі при 37 градусах. Усі експерименти проводили в трьох повторах і повторювали тричі для забезпечення відтворюваності.

Дослідження життєздатності клітин

Щоб оцінити безпекуESекстракту було проведено аналіз МТТ для визначення життєздатності клітин після обробки екстрактом. Цей метод ґрунтується на відновленні 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразолію броміду (МТТ) до формазану мітохондріальними ферментами ( NAD(P)H-залежна клітинна оксидоредуктаза) у життєздатних клітинах [18]. Коротко, клітини B16F10 (1 × 104 клітин/лунку) інкубували з різними концентраціями екстракту ES (8, 40, 200 мкг/мл) у 96-лунковому мікропланшеті протягом 24 годин. Потім до кожної лунки додавали розчин МТТ (500 мкг/мл) і планшет інкубували при 37°С протягом 8 годин. Кристали формазану, утворені живими клітинами, розчиняли в 600 мкл ДМСО. Оптичну густину кожної лунки вимірювали при 540 нм на пристрої для зчитування мікропланшетів Versa Max (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія, США).

Антиоксидантна діяльність

Активність поглинання радикалів DPPH оцінювали за методикою, описаною в [19] з незначними модифікаціями. Різні концентрації (8, 40, 200 мкг/мл).ESекстракту або 20 мкг/мл аскорбінової кислоти (використовується як позитивний контроль) при 500 мкл додавали до 1 мл 0,1 мМ розчину DPPH. Після перемішування на вортексі реакції давали протікати протягом 30 хвилин у темряві при кімнатній температурі (RT). Оптичну густину вимірювали при 517 нм на рідері мікропланшетів VersaMax. Ми провели експеримент, щоб підтвердити, до якої міри радикали були зменшені завдяки електронодонорному ефекту відносно активності поглинання радикалів ABTS [20]. Після утворення радикала додавали розчин 7,4 mMABTS і 2,6 mM персульфату калію та давали отриманій суміші прореагувати протягом 12 годин при кімнатній температурі; Розчин ABTS було виміряно та показало абсорбцію 0,70 ± 0,03 (середнє значення ± стандартне відхилення), виміряну за допомогою рідера мікропланшетів. Екстракт ES (100 мкл) додавали до 900 мкл розчину ABTS і залишали для реакції протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Поглинання 200 мкл суміші розчину вимірювали при 732 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів.

Вимірювання вмісту меланіну

Вміст меланіну вимірювали після додавання незначних модифікацій до описаного раніше протоколу [21]. Клітини меланоми B16F10 висівали у кількості 1 × 105 клітин/лунку в 3 мл середовища в 6-лункові культуральні планшети та інкубували протягом ночі, щоб дозволити клітинам прилипнути. Клітини піддавалися впливу різних концентрацій (8, 40, 200 мкг/мл)ESекстракту або 10 мМ арбутину протягом 72 годин у присутності або відсутності 100 нМ β-меланоцитстимулюючого гормону (-MSH; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Наприкінці обробки клітини промивали PBS (pH 7,2) і лізували 300 мкл 1 М NaOH, що містить 10 відсотків ДМСО, протягом 2 годин при 80 градусах. Поглинання 200 мкл суміші вимірювали при 400 нм за допомогою рідера для мікропланшетів.

Визначення активності клітинної тирозинази

Стільниковийтирозиназаактивність вимірювали згідно з методом, раніше описаним Lee et al. [22] з деякими модифікаціями. Шестилункові планшети, що містять 2 мл DMEM, засівали клітинами меланоми B16F10 із щільністю 1 × 105 клітин/лунку. Кожна лунка була розділена на 6 різних груп наступним чином; Носій: без обробки, контроль: 100 нМ -MSH, ESEE 8: -MSH і екстракт ES (8 мкг/мл), ESEE 40: -MSH і екстракт ES (40 мкг/мл), ESEE200: -MSH і ES екстракт (200 мкг/мл), Арбутин:-МШі арбутин (10 мМ). Планшети інкубували протягом ночі у зволоженому інкубаторі при 37 градусах з атмосферою 5% CO2, щоб дозволити клітинам прилипнути. Потім клітини піддавали впливу 100 нМ -MSH протягом 48 годин, а потім обробляли зростаючими дозамиESекстракту або арбутину протягом 24 годин. Клітини промивали PBS (pH 6,8) і повторно суспендували в буфері для лізису. Далі клітини розщеплювали шляхом заморожування та відтавання, а лізат очищали центрифугуванням при 16,000 g протягом 20 хв. Вміст білка в лізаті визначали за допомогою BCA Protein AssayKit (Thermo Scientific, Вантаа, Фінляндія). Після кількісного визначення рівня білка концентрації були скориговані таким чином, щоб усі зразки містили однакову кількість білка (20 мкг). Потім ці лізати додавали до лунок 96-лункового планшета, що містив 2,5 мМ L-DOPA в 0,1 М фосфатному буфері (pH 6,8). Після інкубації при 37°С протягом 1 год вимірювали абсорбцію різних лізатів при 475 нм за допомогою спектрофотометра.Тирозиназаактивність білка розраховували за такою формулою:

Активність тирозинази (відсотки)=（ODs−ODb）/ контроль * 100

ODs: значення абсорбції зразка

ODb: значення поглинання транспортного засобу

Активність тирозинази грибів

L-DOPA використовувався як субстрат для вимірювання грибівтирозиназадіяльність. Реакційний буфер (загалом 3 мл), використаний в експерименті, містив 2,8 мл 0.5 мМ L-DOPA в 50 мМ Na2HPO4-NaH2PO4 буфер (pH 6,8) і 100 мкл різних концентраційESВодний розчин тирозинази грибів (100 мкл) додавали до змішаного буфера. Розчин (200 мкл) негайно оцінювали на лінійне збільшення оптичного поглинання при 475 нм за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів.

Вестерн-блот аналіз

Клітини меланоми B16F10 (1 × 106 клітин/лунку) культивували в чашках 60- мм2. Потім клітини обробляли різними концентраціями (8, 40, 200 мкг/мл)ESекстракту та 10 мМ арбутину протягом 24 год. Потім клітини аналізували в буфері, що містив 5 0 мМ трис-HCl з рН 7,4, 2 мМ EGTA, 1 мМ фенілметилсульфонілфториду, 10 мМ -гліцерофосфату, 10 мМ -меркаптоетанолу, 1 мМ ортованадату натрію та 0,1% дезоксихоліну. кисла натрієва сіль. Лізати (25 мкг) розділяли за допомогою електрофорезу в 10-відсотковому SDS-поліакриламідному гелі та електрофоретично переносили на полівініліденфторидні мембрани та блокували протягом ночі 5-відсотковим знежиреним молоком у буфері TBST (20 мМ трис-HCl рН 7,4, 100 мМ NaCl і 0,1 відсотка твіну). 20) при 4 градусі. Після промивання мембран у буфері TBST їх інкубували протягом 3 год з первинним антитіломтирозиназа, MITF і -актину (співвідношення 1:1000). Після інкубації з вторинним антитілом (співвідношення 1:1000) протягом 1 години при кімнатній температурі комплекси білок-антитіло візуалізували за допомогою реагенту ECL Western blotting Luminol (Santa Cruz Biotech, CA). , США) і виявлені за допомогою аналізатора зображень Fluorchem E (Cell Biosciences, CA, США).

ГХ-МС аналіз

Зразок етанольного екстракту висушували за допомогою швидкісного вакууму та дериватизували N,O-біс(триметилсиліл)трифторацетамідом (BSTFA) (Sigma Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США). Аналіз ГХ-МС проводили за допомогою газового хроматографа QP2010з’єднаного з мас-спектрометром (Shimadzu) при напрузі іонізації 70 еВ. GC-аналіз проводили в режимі температурного програмування за допомогою колонки Restek (0,25 мм, 30 м; XTI-5). Початкову температуру колонки встановлювали на рівні 70 градусів протягом 3 хвилин, лінійно підвищували на 10 градусів за хвилину до 300 градусів, а потім витримують 5 хв. Температура ін'єкційного порту становила 280 градусів, а інтерфейс ГХ/МС підтримувався на рівні 290 градусів. Швидкість потоку газу-носія гелію становила 1,0 мл/хв.

Статистичний аналіз

Дані щодо синтезу меланіну, цитотоксичності татирозиназааналіз активності були статистично оцінені за допомогою дисперсійного аналізу, а потім за допомогою тесту Даннетта. Дані представлені як середнє ± SD. Значення AP < 0.05="" вказує="" на="" статистичну="">

Результати

Вплив екстракту ES на життєздатність клітин B16F10

Аналіз MTT використовувався для оцінки ефектуES70-відсотковий етаноловий екстракт на життєздатність клітин меланоми B16F10. Клітини обробляли різними концентраціями екстракту (8, 40, 200 мкг/мл) протягом 24 годин, а потім проводили МТТ-аналіз. Результати виражені у відсотках життєздатності відносно контролю. Екстракт ES мав нецитотоксичну дію на проліферацію клітин B16F10 (рис. 1). Однак при концентрації 1000 мкг/мл спостерігалася чітка цитотоксичність у клітинах B16F10 (дані не показані).

Антиоксидантні властивості екстракту ES

Для вимірювання антиоксидантної активності екстракту ES використовували аналізи DPPH і ABTS. Для вимірювання активності поглинання радикалів DPPH екстрактом ES використовували різні концентрації екстракту ES (8, 40, 200 мкг/мл). Активність поглинання радикалів DPPHESекстракту збільшується залежно від дози. Аскорбінова кислота, яка використовувалася як позитивний контроль, показала понад 50% активності поглинання радикалів DPPH (рис. 2а). ABTS плюс активність поглинання радикалів 8 і 40 мкг/мл екстракту ES також була значно високою, демонструючи результати, подібні до результатів групи позитивного контролю. Екстракт ES показав 93,05 ± 0,6 відсотка активності при 200 мкг/мл, що було майже таким же, як і аскорбінової кислоти (рис. 2b).

Вплив екстракту ES на активність тирозинази грибів, вміст меланіну B16F10 і внутрішньоклітинну активність тирозинази

Для вимірювання гальмівного ефектуESекстракту на активність тирозинази грибів, було проведено аналіз інгібування тирозинази. Результати показали, що активність тирозинази грибів інгібується екстрактом ES у високих концентраціях.Тирозиназаактивність становила 88,35 ± 1,28 відсотка, 7{{10}}.81 ± 2.52 відсотка та 45.43 ± 0.48 відсотка після лікування 8, 40 та 200 мкг /мл екстракту ES, відповідно (рис. 3а). Щоб дослідити антимеланогенну активність екстракту ES, інгібуючу дію екстракту ES на меланін оцінювали в клітинах B16F10. Клітини B16F10 обробляли екстрактом ES при 8, 40 і 200 мкг/мл або арбутином при 10 мм і стимулювали -MSH (10 нМ) протягом 48 годин. Екстракт ES мав значний дозозалежний інгібуючий ефект на синтез меланіну. Вміст меланіну був представлений у відсотках від носія. Вміст меланіну становив 146,17 ± 0,07 відсотка, 110 ± 0,1 відсотка та 76,95 ± 0,39 відсотка після обробки 8, 40 та 200 мкг/мл екстракту ES відповідно (рис. 3b). Коли клітини B16F10 обробляли арбутином позитивного контролю (10 мМ), вміст внутрішньоклітинного меланіну становив 84,82 ± 1,28 відсотка. Щоб визначити механізм, що лежить в основі інгібуючої дії екстракту ES на меланогенез, ми оцінили внутрішньоклітинну активність тирозинази в клітинах меланоми B16F10. Тому іншу групу клітин B16F10 обробляли різними концентраціями екстракту ES (8, 40, 200 мкг/мл) або арбутину (10 мМ) і стимулювали за допомогою-МШ(10 нМ) протягом 48 год. Екстракт ES значно інгібував -MSH-індукованийтирозиназаактивність залежно від дози (рис. 3c).

Інгібуюча дія екстракту ES на білки, пов'язані з томланогенезом у клітинах B16F10

Дослідити чиESміг впливати на експресію меланогенного білка, вестерн-блоттинг проводили з використанням лізату клітин меланоми B16F10, оброблених ES і стимульованих -MSH (10 мМ). Рівні експресії тирозинази та MITF оцінювали методом Вестернблот (рис. 4). Ми це підтвердилитирозиназаі експресія MITF значно зростала, коли клітини стимулювали-МШ. Екстракт ES був здатний пригнічувати експресію тирозинази та MITF, стимульовану -MSH залежно від дози.

Хімічний склад ЕС

Хімічний складESекстракт аналізували методом ГХ-МС (рис. 5). Час утримання галікової та протокатехової кислот, двох основних компонентів екстракту ES, становив 19,810 та 18,290 хв відповідно. Дві сполуки були успішно виявлені в екстракті ES.

Екстракт цистанки: корисний для шкіри

Обговорення

У цьому дослідженні ми оцінили, чи єESЕкстракт виявляв ефект відбілювання шкіри шляхом пригнічення вироблення меланіну в клітинах меланоми B16F10. Екстракт ES пригнічував активність ферменту тирозинази, знижував вміст меланіну та виявляв антиоксидантну дію. Вироблення меланіну може стимулюватися УФ або-МШ-MSH зв'язує MC1R і активує сигнальний білок аденілатциклазу для збільшення виробництва циклічного АМФ (цАМФ) [23]. cAMP-реагуючий елемент-зв’язуючий білок (CREB) постійно активується протеїнкіназою A (PKA), а активація CREB збільшує експресію білка MITF і сприяє експресіїтирозиназа[24]. Після стимуляції клітин B16F10 -MSH для індукування меланогенезу відбілюючий ефект ES був підтверджений кількісним визначенням мелану. Встановлено, що вміст меланіну пригнічується залежно від дози, і при найвищій концентрації (200 мкг/мл), використаній в експерименті, спостерігалося пригнічення вмісту меланіну більш ніж на 50 відсотків у порівнянні з групою, яка отримувала лише -MSH.

ES використовувався в традиційних рослинних композиціях. Він належить до сімейства Euphorbiaceae і традиційно використовується в Східній Азії в медичних цілях. ES містить численні біологічно активні речовини, включаючи таніни, терпеноїди та поліфеноли [25]. DPPH є відносно стабільним вільним радикалом. Аналіз DPPH широко використовується для вимірювання антиоксидантної активності рослин, на що вказує зменшення темно-фіолетового кольору розчину за допомогою відновників, таких як аскорбінова кислота, токоферол, полігідроксиароматичні сполуки та ароматичні аміни [26]. Крім того, активність поглинання радикалів ABTS є більш корисною, ніж активність поглинання радикалів DPPH щодо вимірювання антиоксидантів, що донорують водень, антиоксидантів, що розривають ланцюг, і антиоксидантної здатності гідрофільних і гідрофобних речовин [27]. Дослідження показали антиоксидантну активність ES. Однак його ефект відбілювання шкіри досі не оцінений. Таким чином, у цьому дослідженні ми підтвердили ефект відбілювання шкіриES(Рис. 2). Ми перевірили його вплив натирозиназаактивності, яка визначає початкову швидкість меланогенезу (рис. 3). Як фермент, який сприяє виробленню меланіну, тирозиназа широко використовується як цільова сполука для ідентифікації нових інгібіторів, які можуть пригнічувати утворення меланіну [28]. Щоб дослідити механізм, за допомогою якого ES пригнічує меланогенез, ми визначили, чи може екстракт ES пригнічувати активність тирозинази безпосередньо [29] . Для цього аналізу арбутин використовували як позитивний контроль. Ми спостерігали ефект відбілювання шкіри, який був значно вищим, ніж у арбутину (10 мМ). Екстракт ES значно знизив тирозиназну активність грибів через 24 години лікування та пригнічив активність клітинної тирозинази. Таким чином, ми підтвердили, що ESextract демонструє чудовий антиоксидантний ефект, а також відбілюючу дію на шкіру.

Тирозиназає основним ферментом, що бере участь у меланогенезі [30]. Транскрипційні фактори MITF є важливими регуляторами розвитку та диференціювання меланоцитів [31]. Пригнічення тирозинази та експресії MITF екстрактом ES посилювалося дозозалежним чином. Ці результати свідчать про теESпригнічує фактор транскрипції MITF і таким чином інгібує експресію тирозинази.

Зріс інтерес до різноманітних натуральних продуктів, які відбілюють шкіру та зменшують зморшки, як базових матеріалів для продуктів харчування та косметики. На світовому ринку краси зросло використання продуктів, що містять інгредієнти з різними властивостями захисту шкіри, такими як проти зморшок, зволоження, відбілювання та проти запалення [32]. У цьому дослідженні ми виявили, що ESextract має потужну антиоксидантну дію, пригнічує тирозиназу та регулює експресію білка, пов’язану з відбілюванням. Діяльність може бути пов'язана з галлова кислотою та протокатеховою кислотою, виявленими в екстракті ES [33, 34]. Таким чином, видається, що ES має потенціал для використання для розробки натуральної косметики для відбілювання шкіри для ефективного зменшення або запобігання надмірній пігментації меланіну на шкірі.

ефекти цистанхи: інгібтирозиназадіяльність по відбілюванню шкіри

Висновки

На закінчення,ESвитяжка регулюєтьсятирозиназаактивності та експресії білка MITF у клітинах B16F10. Екстракт ES продемонстрував антиоксидантну активність у аналізах DPPH та ABTS. Це дослідження надає експериментальні докази того, що ES може бути корисним терапевтичним засобом для лікування шкірних захворювань.

Цистанхе пригнічує активність тирозинази