Досягнення в дерматології з використанням ДНК-аптамера «Аптамін С» Інновація: запобігання окислювальному стресу та максимізація ефекту вітаміну С через антиоксидантну дію

joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Сухо Чой PhD1|Jeongmin Han Ph.D. Кандидат2|Ji Hyun Kim MS Candidate1|А-Ру Кім Ph.D. Кандидат3|Санг-Хон Кім Ph.D. Кандидат3|Weontae Lee Ph.D., professor2|Мун-Янг Юн Ph.D., professor3|Gyuyoup Kim PhD1|Юн-Сонг Кім доктор філософії, професор1

Анотація

фон:Вітамін С(також відома як L-аскорбінова кислота) відіграє вирішальну роль у зниженні кількості активних форм кисню (АФК) і регенерації клітин, захищаючи клітини від окисного стресу. Незважаючи на те, що вітамін С широко використовується на косметичних і терапевтичних ринках, існують значні докази того, що вітамін С легко піддаєтьсяокисленняповітрям, pH, температурою та ультрафіолетовим світлом під час зберігання. Цей дефіцит вітаміну С знижує його ефективність як антиоксиданту та скорочує термін придатності продуктів, що містять вітамін С як його інгредієнт. Щоб подолати дефіцит вітаміну С, ми розробили аптамін С, інноваційний ДНК-аптамер, що забезпечує максимальну антиоксидантну ефективність вітаміну С шляхом зв’язування з відновленою формою вітаміну С і затримки йогоокислення.

Методи:Зв'язування аптаміну С з вітаміном С визначали за допомогою аналізу ITC. Експеримент ITC проводили з 0.2 ммоль/лвітамін Сякий вводили 25 разів аліквотами по 2 мкл у клітинку зразка об’ємом 1,8 мл, що містить аптамін С у концентрації 0.02 ммоль/л. Дані були підігнані до ізотерми зв’язування на одному місці за допомогою програми з джерелом для ITC v.5.0.

Результати:Дослідити дію аптаміну С івітамін Скомплексу в шкірі людини, були проведені як in vitro, так і клінічні випробування. Ми помітили, що комплекс аптаміну С і вітаміну С був значно ефективним у зменшенні зморшок, відбілюючому ефекті та підвищенні зволоження. Під час клінічного випробування суб’єкти, які отримували комплекс, показали різке покращення подразнення шкіри та свербіння. Жодної побічної реакції комплекс Аптамін С у тесті не виявив.

Висновок:У сукупності ці результати показали, що аптамін С, інноваційна нова сполука, потенційно може використовуватися як ключовий космецевтичний інгредієнт для ряду захворювань шкіри.

КЛЮЧОВІ СЛОВАантиокислення, аптамін С (аптамер, що зв'язує вітамін С),окислення, окислювальний стрес,вітамін С(L-аскорбінова кислота)

цистанчемають сильну антиоксидантну здатність

1|ВСТУП

Активні форми кисню (АФК) – це хімічно реактивні хімічні речовини, що містять кисень, який відіграє важливу роль у сигналізації клітин і гомеостазі.1-3 Це включає не лише позитивні ефекти, такі як індукція захисних генів господаря та мобілізація систем транспорту іонів, але також бере участь в апоптозі (запрограмованій смерті клітин).4,5 Рівні АФК можуть підвищуватися під впливом навколишнього середовища, що призводить до пошкодження клітинних структур.3 Це явище називається «оксидативним стресом». Окислювальний стрес є однією з головних причин різноманітних захворювань, включаючи нейродегенеративні захворювання, хворобу Лу Геріга, аутизм, розсіяний склероз і шкірні захворювання.6-15 Крім того, окислювальний стрес безпосередньо впливає на процес старіння шкіри16; білки, ліпіди та ДНК чутливо реагують на окислювальний стрес, спричинений АФК.17 Антиоксиданти дуже ефективні для захисту шкіри, оскільки вони безпосередньо реагують на АФК, не даючи їм досягти біологічних цільових молекул.18,19 Такі антиоксиданти, яквітамін С, вітамін Е, коензим Q10 і поліфенольні сполуки захищають шкіру від пошкоджень, спричинених АФК. Антиоксиданти, таким чином, допомагають запобігти та лікувати різні шкірні захворювання та уповільнити процес старіння шкіри.20 Використання вітаміну С у промисловості насамперед через його антиоксидантні властивості, які є результатомвітамін Сздатність нейтралізувати вільні кисневі радикали за допомогою процесу, який називається поглинанням радикалів.21,22 Однак через ці ж антиоксидантні властивості сама молекула за своєю суттю чутлива до деградації черезокислення. Щоб вирішити цю проблему, ми розробили Аптамін С, ДНК-аптамер, який специфічно зв’язується з вітаміном С і пригнічує окислення вітаміну С. Аптамери — це одноланцюгові олігонуклеотиди на основі ДНК або РНК, здатні вибірково зв’язувати широкий діапазон молекул. Аптамери зазвичай ідентифікуються за допомогою методу відбору in vitro, який називається систематичною еволюцією лігандів шляхом експоненціального збагачення або «SELEX». Ми визначили, що аптамін С пригнічуєокисленнявітаміну С від кількох окислювачів і зберігає антиоксидантну активність під час тривалого зберігання. Щоб підтвердити оцінку безпеки аптаміну С, були проведені експерименти на клітинному рівні та безпосередньо застосовані до людей, і токсичності не спостерігалося. Шкірні захворювання, такі як атопічний дерматит, псоріаз і акне, пов’язані з імунною відповіддю та ROS.23Вітамін Смає здатність видаляти АФК і має протизапальну дію.24 Аптамін С запобігаєокисленнявітаміну С і максимізує його ефективність завдяки повільному вивільненню. Тому ми очікуємо, що комплекс Aptamin C-vitamin C продемонструє синергетичний ефект.

2|МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

2.1|Скринінг аптамерів проти вітаміну С зі зниженим вмістом оксиду графену

Цей метод було здійснено шляхом модифікації методу попереднього дослідження.25 Кандидати оцДНК, які можуть специфічно зв’язуватися звітамін Сбули розроблені з випадкової бібліотеки оцДНК, що складається приблизно з 1X1018 різних послідовностей. Для бібліотеки ssDNA ми використали виготовлену на замовлення послідовність, розмір якої становить 60 мер і містить 30 випадково згенерованих нуклеотидних послідовностей і сайт праймера для ампліфікації (5′‐ATGCGGATCCCGCGC‐(N)30‐GCGCGAAGCTTGCGC‐3’). Ми виконали загалом п’ять раундів, змінюючи умови експерименту, щоб вибрати більш конкретну послідовність. Загальний об'єм для реакції становив 200 мкл. Приблизно 20 мкл буфера для зв’язування 10× (10× PBS, доданого 10 ммоль/л MgCl2), 80 мкл rGO (5 мг/мл, розведеного у воді) і 200 пікомолей бібліотеки оцДНК (20 мкл 100 мкмоль/л основного матеріалу). ) додавали та заповнювали dH2O до 200 мкл. Реакція тривала протягом 30 хвилин для зв’язування бібліотеки оцДНК з rGO, а потім суміш центрифугували при 20 000 g протягом 20 хвилин для видалення супернатанту. Осад rGO промивали 1 раз 200 мкл буфера для зв’язування, концентрація якого була такою ж, як умови зв’язування мішені кожного циклу. Для елюювання кандидатів потрібно 200 наномолейвітамін Срозбавлених у 200 мкл буфера зв’язування додавали до осаду rGO, і етап елюювання проводився протягом 1 години. Елюовану оцДНК розділяли центрифугуванням при 20 000 g протягом 20 хвилин і ампліфікували. Перед ампліфікацією ми провели осадження EtOH, щоб видалити домішки, за винятком оцДНК. Ми зробили асиметричну ПЛР для отримання ампліфікованої оцДНК. Співвідношення направляючого праймера до зворотного праймера асиметричної ПЛР становило 10:1. Ми провели електрофорез на 2,5-відсотковому агарозному гелі, щоб підтвердити продукт ПЛР кількома мікролітрами його. Асиметрична ПЛР не може виробляти лише оцДНК. Отже, ми застосували метод роздавлювання та замочування, щоб виділити кандидатів на оцДНК. Для цього методу ми провели електрофорез на 12-відсотковому поліакриламідному нативному гелі та пофарбували гель бромістим етидієм (EtBr). Щоб відокремити дволанцюгову ДНК (дцДНК) і оцДНК, частину гелю, пофарбовану оцДНК, вирізали, подрібнювали та екстрагували оцДНК буфером для подрібнення та замочування (500 ммоль/л NH4OAc, 0,1% SDS, 0,1 ммоль/л ЕДТА) на ніч. Подрібнений гель відділяли центрифугуванням. Супернатант, який містить оцДНК, концентрують і очищають шляхом осадження EtOH. Висушену оцДНК збирали за допомогою стерилізованої dH2O, і її використовували для наступного раунду як бібліотеку.

натуральні інгредієнтицистанче амазонське

2.2|Експеримент калориметрії ізотермічного титрування (ITC).

Експеримент калориметрії з ізотермічним титруванням проводили за допомогою системи VP-ITC (MicroCal Inc Northampton) при 25 градусах у фосфатно-сольовому буферному розчині, що складається з 1 ммоль/л хлориду магнію (pH 7,4). Перед кожним експериментом титрування аптамін С 2 мл івітамін СЗразки об’ємом 600 мкл дегазували протягом 30 хвилин у вакуумі, без перемішування, при температурі на кілька градусів нижче експериментальної. Ми підготували 0,2 ммоль/л вітаміну С, який вводили 25 разів аліквотами по 2 мкл у 1,8 мл клітинку зразка, що містить аптамін С у концентрації 0,02 ммоль/л. Дані були підігнані до ізотерми зв’язування на одному місці за допомогою програми з джерелом для ITC v.5.0 (MicroCal Inc).

2.3|Тести окислення вітаміну С на основі мікропланшетів на основі флуоресценції

Окисленнязвітамін Свимірювали шляхом виявлення окисленого продукту дегідроаскорбату (DHA) за допомогою модифікованої версії методу, описаного Vislisel та ін.7 У цьому методі DHA виявляють шляхом реакції з о-фенілендіаміном (OPDA) з утворенням флуоресцентного продукту конденсації 3-( дигідроксіетил)фуро[3,4-b]хіноксалін-1-он. Аналіз проводили наступним чином у чорних 384-лункових планшетах (Greiner Bio-One). Аптамери спочатку розчиняли у фосфатно-буферному фізіологічному розчині, рН 7,2, що містить 1 мМ MgCl2, у концентрації 200 мкмоль/л, потім згортали шляхом нагрівання до 95 градусів і давали повільно охолонути до кімнатної температури протягом 15 хвилин. Згорнуті аптамери потім розводили 1:1 (об.:об.) у свіжоприготованому розчині 5 ммоль/л.вітамін Св буфері для аналізу [50 ммоль/л ацетату натрію, 1 відсоток (маса/об’єм) BSA, 0,05 відсотка (об’єм/об’єм) Tween 20, 1 мМ MgCl2 (Sigma, усі компоненти) доведений до pH 5,5], і суміш інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі, щоб дозволити аптамерам зв'язатися перед додаванням окислювача. Потім до розчинів вітамін С/аптамер додавали окислювачі в концентраціях (EM) H2O2 (Sigma). Окислювачі попередньо розбавляли до робочих концентрацій у буфері для аналізу. Потім зразки інкубували при кімнатній температурі протягом 10 хвилин перед додаванням OPDA (Sigma) у концентрації 5,5 ммоль/л у буфері для аналізу. Одразу після додавання OPDA флуоресценцію зразків при 425 нм визначали за допомогою планшетного зчитувача SpectraMax® i3X (Molecular Devices) із збудженням при 345 нм протягом 45-хвилинного періоду з вимірюваннями кожні 60 секунд. Усі зразки та посудини з реагентами були загорнуті у фольгу, щоб захистити їх від світла під час усіх інкубацій, проведених для аналізів флуоресценції.

2.4|Вимірювання зниження вмісту вітаміну С за допомогою DCPIP (2,6-дихлорфеноліндофенол)

Для визначення скороченнявітамін С, ми провели експерименти з використанням реакції DCPIP. Вітамін С реагує з DCPIP, змінюючи колір із синього на безбарвний. Готовий вітамін С обробляли 5% аптаміном CTM, а необроблений вітамін С інкубували при кімнатній температурі протягом 8 тижнів. Зразок вимірювали через 2, 4 і 8 тижнів. Приблизно 2 мл DCPIP додавали в конічну колбу за допомогою піпетки, і додавали перший необроблений вітамін С, доки розчин не ставав безбарвним. Кількістьвітамін Сдоданого вимірювали та повторювали з іншими зразками. Відповідно до цих даних розраховували ступінь зменшення кожного зразка.

2,5|Дослідження in vitro ефекту проти зморшок у фібробластах шкіри людини

Щоб оцінити життєздатність клітин у фібробластах шкіри людини, клітини обробляли різними кінцевими концентраціями аптаміну С звітамін С(Аптамін С мкг плюс вітамін С мкг/мл) {{0}}.01 плюс 0.5 мкг/мл, 0,1 плюс 5 мкг/мл, 0,5 плюс 25 мкг /мл, 1 плюс 50 мкг/мл і 2 плюс 100 мкг/мл. А потім клітини обробляли концентраціями аптаміну С з вітаміном С для виявлення активності внутрішньоклітинного колагену, внутрішньоклітинної колагенази (ММР-1) і еластази.

Дермальні фібробласти людини (HDF) були відібрані на основі «Керівництва з оцінки ефективності функціональної косметики (ΙI)» MFDS. HDF культивували в суміші DMEM/F12 3:1 з високим вмістом глюкози з додаванням 10 відсотків FBS і 1 відсотка антибіотика-антимікотика у зволоженій атмосфері 5 відсотків CO2 при 37˚C.

HDF (5 × 104 клітин/лунку) висівали в 24-лункові планшети та інкубували протягом 24 годин і обробляли різними концентраціями аптаміну С звітамін Ста інкубували протягом 24 годин. Через 24 години супернатант збирали, і кількість проколагену, що вивільнився в середовище, вимірювали при 450 нм за допомогою набору ELISA Procollagen Type IC-Peptide (PIP). Ступінь виробництва колагену калібрували за загальним вмістом білка та порівнювали з TGF-1 як позитивним контролем. Середовища без досліджуваних матеріалів використовували як контроль розчинника.

HDF (5 × 104 клітин/лунку) висівали в 24-лункові планшети та інкубували протягом 24 годин і обробляли різними концентраціями аптаміну С звітамін Ста інкубували протягом 48 годин. Через 48 годин активність колагенази вимірювали при 450 нм за допомогою набору MMP-1 Human ELISA. Активність MMP-1 оцінювали за вмістом загального білка та порівнювали з TGF-1 як позитивним контролем. Середовища без досліджуваних матеріалів використовували як контроль розчинника.

Усі дані були виражені як середнє ± стандартне відхилення та отримані з 3 незалежних експериментів. Статистичний аналіз проводився за допомогою t-тесту незалежної вибірки з використанням програмного забезпечення SPSS® (IBM) на рівні значущості P <>

2.6|Вимірювання шкірних зморшок системою аналізу 3D зображення

У цьому дослідженні брали участь двадцять дві жінки (середній вік: 50,05 ± 2,94 року). Шкірні зморшки гусячих лапок оцінювали за допомогою системи аналізу 3D-зображень на початковому рівні, через 4 і 8 тижнів. Гідратацію шкіри оцінювали ємнісним методом, TEWL методом дифузії води на поверхні шкіри та еластичність шкіри методом всмоктування оцінювали на початковому рівні, через 2, 4 та 8 тижнів після лікування. Крім того, суб’єкти заповнювали самоопитувальники щодо ефективності через 2, 4 та 8 тижнів, а анкети щодо зручності використання – через 8 тижнів після лікування. Усі отримані дані були статистично оброблені за допомогою програмного забезпечення SPSS®. Параметри зморшок гусячих лапок оцінювали за допомогою PRIMOS® Premium (GFMesstechnik GmbH). Ця система дозволила провести кількісний аналіз шорсткості, глибини, площі та обсягу виступаючої на шкірі зморшки. Зображення було проаналізовано в тій самій області з точки зору параметрів зморшок шкіри (1, середня глибина зморшок; 2, середня глибина найбільшої зморшки; 3, максимальна глибина найбільшої зморшки; 4, загальна площа зморшок; 5, загальний об’єм зморшок; 6 , Загальна кількість зморшок форм-фактора; 7, Загальна довжина зморшок; 8, Ra; 9, Ry; і 10, Rz) на початковому рівні, через 4 і 8 тижнів після лікування Primos 5.8 E ver. програмне забезпечення.

3|РЕЗУЛЬТАТИ

3.1|Для успішного виконання rGO-SELEX з нестабільною мішенню потрібен був ретельний підхід до підготовки буфера

Бібліотека оцДНК, яка була зв’язана з rGO за допомогою взаємодії π-π укладання між ароматичними кільцями поверхні графену та основами ДНК 26,27 і незв’язаною оцДНК на rGO, була відокремлена та видалена центрифугуванням. ssDNA, яка була адсорбована на поверхні rGO, була елюйована шляхом обробки цільовою сполукою. Відповідно до літературних повідомлень, конформація аптамера змінюється після зв’язування з мішенню та послаблення взаємодії π-πстекінгу з rGO.28-31 Цей процес повторювався протягом п’яти раундів. Кожен наступний раунд проходив із суворішими буферними умовами та коротшим часом елюції. Ця продуктивність дозволила нам підтримувати оцДНК з кращою специфічністю до цільових сполук.

Дані NGS збагаченої бібліотеки, отриманої за допомогою процесу rGO-SELEX, дали 404071 послідовність. Ми вибрали 119 послідовностей із цих даних, відсортували їх у 11 груп на основі подібності структури та вибрали репрезентативні послідовності для кандидатів у аптамери (рис. 1A).

3.2|Вибір аптаміну С

Вторинні структури кандидатів на аптамін С були передбачені за допомогою безкоштовного програмного забезпечення M-Fold.32,33 Кандидати були згруповані за їх положенням, довжиною, формою та кількістю стебла та петлі найвищої потенційної структури (рис. 1B). DHA, оксидвітамін С, виявляється шляхом його реакції з о-фенілендіаміном (OPDA), який відіграє роль індикатора.34 Якщо аптамер зв’язується та запобігає йогоокислення, до вітаміну С і запобігає його окисленню, сигнал флуоресценції від 3-(дигідроксіетил)-фуро-[3,4-b] хіноксалін-1-ону, продукту конденсації вітаміну С і OPDA, буде нижчим, ніж у контроль без аптамерів. Діапазон кожного кандидата на аптамер, змішаний з вітаміном С і окислювачем, з позитивним контролем,вітамін Сплюс послідовності окислювача та скремблування, змішані з вітаміном С та окислювачем (рис. 1C). Показано, що п’ять аптамерів, аптамін Cb, Cc, Cf, Cg і Ck, мають антиоксидантний ефект.

3.3|Інгібування окислення вітаміну С аптаміном С

Аптамін С має високу спорідненість зв'язування звітамін С. Зв'язування аптаміну С з вітаміном С визначали за допомогою аналізу ITC. За ізотермою зв’язування можна отримати ентальпію (ΔH), ентропію (ΔS) і стехіометрію (n) реакції зв’язування. Екзотермічне зв’язування аптаміну Cb було виявлено за допомогою вимірювання ITC, а ентальпію (ΔH) розраховано як 302,5 ± 3,788, ентропію (ΔS) розраховано як 18,9, стехіометрію (n) розраховано як 56,7 ± {{21 }}.426, а константи дисоціації (Kd) були розраховані як 2,13 мкМ для вітаміну С. Екзотермічне зв’язування аптаміну Cf було виявлено за допомогою вимірювання ITC, а ентальпія (ΔH) була розрахована як 279,2 ± 2,992, ентропія (ΔS) була розрахована як 18,4, стехіометрію (n) розраховували як 167 ± 1,15, а константи дисоціації (Kd) розраховували як 0.89 мкМ для вітаміну С. Екзотермічне зв’язування аптаміну Ck було виявлено за допомогою вимірювання ITC та ентальпії (ΔH для вітамін С (рис. 2А). Вимірювання ITC показують, що зміна ентропії після асоціації з аптаміном C є основною рушійною силою длявітамін С. Запобігтиокисленнявітаміну С у рідкому стані, всі розчини готували з деіонізованою водою, обробленою азотом. Флуоресценцію виявляли та кількісно аналізували, коли OPDA (о-фенілендіамін) зв’язувався з DHA, утворенимокисленнявітаміну С. Ступінь окислення вітаміну С за концентрацією аптаміну С (125, 250, 500 і 1000 нмоль/л) порівнювали та підтверджували аналізом OPDA. Результати показали, щовітамін Сперетворення на дегідроаскорбінову кислоту відбувалося повільніше, коли концентрація аптаміну С була вищою. (Малюнок 2B). Ці дані доводять, що аптамін С є дозозалежним інгібітором окислення вітаміну С.

Ми провели експерименти, щоб визначити, чи може аптамін С запобігтиокисленнявітаміну С протягом тривалого періоду часу. Одночасне лікування аптаміном Світамін С, і необроблений вітамін С виставили на світло та залишили стояти при кімнатній температурі протягом 8 тижнів. У результаті, коли необроблений вітамін С залишали в спокої, ступінь відновлення зменшувався менш ніж наполовину за 2 тижні, і майже всі вони окислювалися через 4 тижні. У присутності аптаміну C рівень вітаміну C зменшився приблизно вдвічі менше, ніж через 8 тижнів (рис. 2C). Це свідчить про те, що аптамін С запобігає окисленню вітаміну С протягом тривалого періоду часу.

cistanche бодібілдінг

3.4|Аналіз активності внутрішньоклітинної колагенази (ММР-1) і колагену

При аналізі активності колагенази виробництво матриксної металопротеїнази-1 (ММР-1) було значно знижено залежно від дози на 7.06 відсотків, 9,29 відсотків і 31,81 відсотків при концентраціях {{1{ {12}}}}01 плюс 0.5 мкг/мл, 0.1 плюс 5 мкг/мл і 0.5 плюс 25 мкг/мл мл відповідно (рис. 3A). При аналізі синтезу колагену рівень карбокси-термінального пептиду проколагену типу Ι (PIP) значно збільшувався залежно від дози, із збільшенням на 25.{{20}} відсотків при 0,01 плюс 0,5 мкг/мл , 41,99 відсотка при 0,1 плюс 5 мкг/мл і 71,18 відсотка при 0,5 плюс 25 мкг/мл (Малюнок 3B).

3,5|Клінічне дослідження ефекту зменшення зморшок на шкірі людини

Статистичний аналіз параметрів зморшок проводився за допомогою системи аналізу 3D-зображень, щоб оцінити вплив тестового продукту на шкіру людини на зменшення зморшок. Порівняно з контрольною групою параметр «Середня глибина зморшок» зменшився на 4,77 відсотка через 4 тижні та на 4,25 відсотка через 8 тижнів, параметр «Середня глибина найбільшої зморшки» зменшився на 3,37 відсотка через 4 тижні та на 4,53 відсотка через 8 тижнів. Параметр «Макс. глибина найбільшої зморшки» зменшився на 4,36 відсотка через 4 тижні та на 7,19 відсотка через 8 тижнів, параметр «Загальна довжина зморшок» зменшився на 1,61 відсотка через 4 тижні та 2,67 відсотка через 8 тижнів, параметр «Ra» зменшився на 4,22 відсотка через 4 тижні та 3,90 відсотка через 8 тижнів, параметр "Ry" знизився на 2,66 відсотка через 4 тижні та 7,11 відсотка через 8 тижнів, параметр "Rz" знизився на 3,69 відсотка через 4 тижні та 6,22 відсотка через 8 тижнів, зменшення становило 3,69 відсоток ‐7,11 відсотка (рис. 4).

4|ВИСНОВОК

Вітамін Сє комерційно важливою, але нестабільною молекулою, тому підвищення її стабільності становить інтерес для різних секторів ринку. Наша робота демонструє, що аптамін С, ДНК-аптамери, потенційно подовжує термін придатності та підвищує ефективність таких продуктів шляхом затримкивітамін С окисленняв розчині. Ми продемонстрували клінічну ефективність комплексу аптамін С у зменшенні зморшок і зволоженні шкіри. Комплекс аптаміну С також може допомогти полегшити стан шкіри.

поліпшити відбілювання шкіри