Специфічна для алкоголю динаміка транскрипції повторної консолідації та рецидиву пам’яті. Частина 4

На додаток до Arc, ми виявили, що рівні мРНК Egr1, але не Bdnf, були збільшені в DH і mPFC шляхом відновлення пам’яті алкоголю.

З плином часу люди поступово набувають нового розуміння таємниці забудькуватості. У цьому процесі нова технологія пошуку пам’яті поступово стала гарячою точкою досліджень.

Отже, чи існує зв’язок між відновленням пам’яті про алкоголь і продуктивністю пам’яті? Приходьте подивіться зараз! Перш за все, ми повинні чітко уточнити: відновлення спогадів про алкоголь не є окремою технологією. Це технологія, яка впливає на нейрони мозку через алкоголь. Цей процес може активувати деякі «сплячі» спогади в мозку, дозволяючи нам оновити ці спогади.

По-друге, ми повинні знати, що покращення пам’яті не просто дозволяє нам «згадувати» більше речей, а є процесом відновлення та реконструкції спогадів різними способами. Цей процес може допомогти нам краще закріпити та зрозуміти знання, які ми навчилися, тим самим покращуючи нашу пам’ять.

Таким чином, ми можемо зробити висновок, що існує взаємозв’язок між відновленням пам’яті про алкоголь і продуктивністю пам’яті. Коли ми використовуємо цю технологію, щоб відновити попередні спогади після вживання алкоголю, ми проходимо процес повторної консолідації цих спогадів, таким чином покращуючи нашу пам’ять до певної міри.

Звичайно, ми також повинні зазначити, що відновлення пам’яті алкоголем не є довготривалим і надійним методом покращення пам’яті. Якщо ми хочемо мати відмінну пам'ять протягом тривалого часу, нам необхідно постійно зміцнювати і вдосконалювати свою пам'ять через щоденне навчання і життя в поєднанні з іншими техніками тренування пам'яті.

У цьому процесі нам потрібно постійно зберігати оптимістичний настрій, щоб краще стимулювати нашу навчальну мотивацію та потенціал пам’яті. Тому давайте активно займатися тренуванням пам’яті, невпинно залишатися самими собою і сміливо рухатися вперед шляхом постійного вдосконалення пам’яті! Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, м’ясо також може покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.

Натисніть зараз, щоб покращити короткочасну пам'ять

Підвищена експресія мРНК Egr1 раніше була залучена до повторної консолідації спогадів про страх і наркотики [19, 21, 48, 61], що підвищує ймовірність того, що цей фактор транскрипції також відіграє роль у повторній консолідації спогадів про алкоголь.

У той час як роль Bdnf у повторній консолідації пам’яті залишається суперечливою [19, 49], відомо, що індукція Bdnf має вирішальне значення для набуття пам’яті та навчання згасання [19, 62]. Таким чином, відсутність змін у експресії Bdnf у нашому дослідженні може свідчити про те, що наша процедура відновлення пам’яті не ініціювала навчання вимирання паралельно з відновленням пам’яті.

Більше того, нещодавно ми повідомили, що хоча рівень мРНК Bdnf у DH не підвищується шляхом відновлення пам’яті про алкоголь саме по собі, експресія фактора росту підвищується, коли за відновленням слідує аверсивне контробумовлення, яке запобігає рецидиву [44], що свідчить про комплексну роль Bdnf в динаміці пам'яті про алкоголь.

Наші висновки показують, що підвищення експресії IEG не є унікальним для повторної консолідації спогадів, пов’язаних з алкоголем.

Дійсно, ARC і EGR1 раніше були залучені до консолідації кількох типів спогадів, включаючи спогади про страх [19, 46, 47, 62], спогади про впізнавання [21] і спогади, пов’язані з різними наркотиками [20, 22, 61].

Проте також з’являється все більше доказів того, що деякі механізми, які лежать в основі прагнення до алкоголю, можуть відрізнятися від тих, що контролюють природне прагнення винагороди [5, 27, 28, 63]. Крім того, є докази того, що спогади про різні винагороди (і про різні ліки, зокрема) обробляються по-різному [29–32]. Результати нашого аналізу RNAseq дійсно виявили унікальну транскриптомічну сигнатуру, спричинену відновленням спогадів про алкоголь.

Зокрема, ми знайшли 44 гени в DH і інший набір з 9 генів у них PFC, які показали значні зміни після відновлення алкогольної пам’яті. Після подальшої перевірки даних ми зосередилися на одному гені в mPFC (Fkbp5) і трьох генах в DH (Adcy8, Scl8a3 і Neto1) і виявили, що на їх експресію не вплинуло відновлення спогадів, пов’язаних із сахарозою.

Це свідчить про те, що, на відміну від Arc і Egr1, ці 4 специфічні гени, швидше за все, не відіграють загальних ролей у обробці спогадів про винагороду, але можуть відігравати вибіркову роль у обробці спогадів про алкоголь.

Цікаво, що ці чотири гени раніше були причетні до розладу вживання алкоголю, а також до навчання та пам’яті. Так, Fkbp5 кодує FK506 Binding Protein 5, регулятор стресової нейроендокринної системи [64].

Варіанти FKBP5 модулюють тяжкість алкогольного абстинентного синдрому [65] і передбачають схильність до пияцтва у людей [66–68]. Було показано, що делеція Fkbp5 посилює тяжкість алкогольної абстиненції [65] і вживання алкоголю [67] у мишей, тоді як фармакологічне інгібування білка знижує помірне споживання алкоголю та відновлення CPP у мишей [69] і знижує споживання алкоголю у стресових самців щурів [70].

Рівні мРНК Adcy8, що кодує аденілатциклазу 8 (AC8), яка каталізує утворення цАМФ у відповідь на надходження кальцію та нещодавно позначена як можливий регулятор споживання алкоголю [28, 71], були знижені в клітинах крові довготривалих абстинентних алкоголіків [72].

Раніше було показано, що делеція Adcy8 зменшує вживання алкоголю та підвищує чутливість до седативних ефектів алкоголю у мишей [73]. Крім того, хронічний вплив алкоголю у щурів посилював експресію в мозку сімейства носіїв розчиненої речовини 8 (натрій/кальцієвий обмінник), член 3 (NCX3), білка, кодованого Scl8a3 [74, 75].

Вживання алкоголю щурами також асоціювалося зі зниженою експресією Neto1 [76] у стовбурі мозку, що кодує нейропілін-толоїд-подібний 1 (NRP1), компонент NMDA-рецепторного комплексу [77].

Цей білок бере участь у синаптичній реорганізації та передачі в гіпокампі [78] і необхідний для просторового навчання та пам’яті [77].

Таким чином, наші результати показують, що просте відновлення спогадів про алкоголь, навіть без будь-яких фармакологічних ефектів алкоголю, впливає на експресію цих генів. Однак їх конкретну роль у відновленні спогадів про алкоголь і рецидиві ще належить перевірити.

Обмеження цього дослідження полягає в тому, що аналіз RNA-seq проводився на об’ємних тканинах mPFC і DH, а не на окремих клітинах, активованих шляхом відновлення пам’яті. Зокрема, нещодавні дослідження припустили, що спогади загалом [79, 80] і, зокрема, спогади, пов’язані з алкоголем [32, 81, 82], кодуються за допомогою активації нейронних ансамблів, що складаються з невеликої кількості нейронів, які можна ідентифікувати за допомогою маркерів нейронаактивації ( наприклад, cFOS) [80].

Дійсно, подібні патерни активації IEG (cFOS) шляхом відновлення оперантно обумовлених спогадів про алкоголь і солодку винагороду були виявлені в mPFC і додаткових мезолімбічних областях у мозку щурів [32, 81]. Таким чином, можливо, вибіркове проведення аналізу RNA-seq на ансамблі нейронів, активованому відновленням пам’яті, дало б більш точні результати.

Підсумовуючи, наші висновки свідчать про те, що відновлення спогадів про алкоголь індукує дві паралельні програми транскрипції. Одна програма, яка передається через загальні молекулярні механізми навчання та пам’яті, включаючи IEG Arc і Egr1, задіяна в консолідації спогадів загалом.

Інша програма транскрипції, запущена відновленням алкогольної пам’яті, контролюється генами, які спеціально сприяють поведінці, пов’язаній з алкоголем. Ця модель подвійної обробки спогадів про алкоголь підвищує ймовірність того, що повторна консолідація пам’яті для різних спогадів може мати подібні молекулярні механізми подвійної обробки, де деякі компоненти спільно використовуються кількома спогадами, а інші — унікальні для кожного типу пам’яті.

Цю гіпотетичну модель ще належить оцінити, перевіривши, чи маніпуляції цими генами по-різному впливають на реконсолідацію пам’яті про алкоголь і сахарозу. Якщо це так, то можна припустити, що можна націлитися на специфічні молекулярні цілі для лікування розладів, пов’язаних із патогенними спогадами, наприклад наркоманії, замість того, щоб порушувати основні молекулярні механізми, необхідні для багатьох функцій, окрім реконсолідації спогадів про алкоголь.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Див. Додаткову інформацію, щоб дізнатися більше про апаратуру, препарати та реагенти, дизайн і підготовку олігодезоксинуклеотидів (ODN), аналізи Вестернблот і ПЛР-ПЛР, а також підготовку бібліотеки RNA-seq.

Тварини

Мишей чоловічої та жіночої статі C57BL/JRccHsd (25–30 г), яких утримували по 3–4 особини в клітці, вирощували в тваринницькому комплексі Тель-Авівського університету (Ізраїль) і утримували під 12-годинним циклом світло-темрява (світло вмикається о 7 ранку), з доступною їжею та водою.

В експериментах з кондиціонуванням сахарози в місці доступ до їжі був обмежений протягом 6 годин перед тренуваннями, щоб підвищити мотивацію мишей збирати гранули сахарози. Ця коротка тривалість депривації їжі ґрунтується на висновках про те, що в денний час 2–6-годинне голодування не впливає на харчову поведінку [83] і не викликає значного зрушення в метаболічних маркерах [84], таким чином мінімізуючи наслідки обмеження їжі саме по собі. .

Мишей зважували двічі на тиждень, щоб контролювати втрату ваги. Усі експериментальні протоколи були схвалені та відповідали вказівкам Інституційного комітету з догляду та використання тварин Тель-Авівського університету та вказівкам NIH (номер гарантії добробуту тварин A5010-01). Були зроблені всі зусилля, щоб мінімізувати кількість тварин.

Поведінкові процедури

Кондиціонування місця

Обумовлене алкоголем перевага місця (CPP): Усі миші були привчені до щоденних внутрішньовенних ін’єкцій фізіологічного розчину протягом 3 днів.

Базовий тест (день 1): у перший день розсувні двері були втягнуті, і мишам дозволили вільно досліджувати весь пристрій протягом 30 хвилин. Кондиціонування місця алкоголем (дні 2–9): навчання розпочалося через 24 години після базового тесту з одного сеансу вводять на день протягом 8 днів із зачиненими дверцятами. На 3, 5, 7 і 9 дні миші отримували алкоголь (1,8 г/кг, 20% об’єм/об’єм; внутрішньовенно) і були негайно обмежені в парному відділенні на 5 хвилин.

Раніше було показано, що ця доза та тривалість кондиціонування спричиняють індукований алкоголем CPP [42, 85]. В інші дні (тобто дні 2, 4, 6 і 8) миші отримували фізіологічний розчин і були обмежені в непарному відділенні на той самий час, що й у день кондиціонування алкоголем.

Парні відсіки були врівноважені. Тест на перевагу місця 1 (день 10): Тестування на перевагу місця було, як описано для базового тесту, і служило для індексування алкоголю-CPP [41]. Перевагу було визначено як збільшення відсотка часу, проведеного в купе з алкогольними напоями під час тесту на перевагу місця 1, порівняно з базовим тестом.

Відновлення пам’яті (день 11): перед цією стадією мишей розподіляли в різні експериментальні умови (зіставляли за балами CPP і статтю). Під час сеансу відновлення пам’яті мишей утримували у відділенні зі спиртом на 3 хвилини, а потім повертали до їхніх домашніх клітин. Контрольних мишей обробляли коротко. Тест на перевагу місця 2 (день 12): мишей піддавали тесту на перевагу місця, ідентичному тесту на перевагу місця 1.

Сахароза CPP: попереднє навчання сахарозі (дні 1–6): у дні 1–3 мишей привчали збирати 5–6 гранул сахарози (45 мг, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) у домашніх клітках. . На 4-6 дні мишей навчали збирати 3 гранули в порожню коробку з оргскла протягом 30-хвилинних сеансів. Миші, які зібрали менше шести гранул (із загальної кількості дев'яти гранул протягом 3 днів) під час навчання сахарозі, були виключені з експерименту (2 миші з 32).

Базовий тест (день 7): на сьомий день розсувні двері в камері CPP відсунули, і мишам дозволили досліджувати весь апарат протягом 30 хвилин. Тут також було прийнято неупереджений апарат/підхід неупередженого призначення, як описано в процедурі алкоголь-CPP. Кондиціонування місця для сахарози (дні 8–15): навчання розпочалося через 24 години після базового тесту з одним сеансом на день протягом 8 днів, з ковзанням двері закриті. На 9, 11, 13 і 15 день мишей поміщали в парне відділення, а через хвилину три гранули сахарози розсипали на підлозі.
Через 15 хвилин мишей повернули до їхніх домашніх клітин. В інші дні (тобто дні 8, 10, 12 і 14) мишей поміщали в непарний відсік на 15 хвилин без втручання.

Парні компартменти були врівноважені. Тест на перевагу місця 1 (день 16): Тест на перевагу місця проводився, як описано для базового тесту, і служив для індексування сахарози-CPP. Перевага була визначена як збільшення відсотка часу, проведеного в парному відділенні сахарози під час тесту на перевагу місця 1, порівняно з базовим тестом. Відновлення пам’яті (дні 17): Процедура відновлення пам’яті про сахарозу була ідентичною процедурі відновлення пам’яті про алкоголь (див. вище ).

Перевірка олігодезоксинуклеотидів (ODN).

Конструкція дугового антисенсового ODN (AS-ODN) і зашифрованого ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Ізраїль) відповідала настановам, описаним раніше [56, 86].

Функціональна перевірка Arc AS-ODN. Arc AS-ODN (2 нмоль/мкл, 0,5 мкл, 0,25 мкл/хв) вводили в DH в одній півкулі, а SCR-ODN (2 нмоль/мкл, { {9}}.5 мкл, 0.25 мкл/хв) вводили в іншу півкулю (бічні сторони були врівноважені). Через дві або чотири години оброблені миші досліджували незнайомий контекст (відсік CPP, див. опис приладу вище) протягом 5 хвилин, щоб індукувати залежну від новизни експресію ARC. Мишей піддавали евтаназії через годину (тобто через 3 або 5 годин після інфузії ODN), тканини головного мозку збирали, а рівень білка ARC оцінювали за допомогою вестерн-блотаналізу (рис. S4).

Хірургічне втручання та інтрагіпокампальна мікроінфузія. Хірургічне втручання та мікроінфузії проводили, як описано раніше [42, 87].

Хірургія. Стереотаксичні операції проводили під ізофлурановою анестезією. Мишей помістили в стереотаксичну раму (RWD Life Science, Шеньчжень, Китай), а двосторонні направляючі канюлі (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Роанок, Вірджинія, США) націлили на DH на наступні координати (-2 мм ззаду від брегми, ±1,3 мм медіолатерально, -1,45 мм вентрально від поверхні черепа). Канюлі були закріплені стоматологічним акрилом. Відповідні фіктивні канюлі (Plastics One Inc., Роанок, штат Вірджинія, США) були вставлені в направляючі канюлі та покриті пилозахисними ковпачками, щоб місце ін’єктора було закрите та очищене від сміття. Мишам давали відновитися протягом 7-10 днів перед тренуванням з алкоголем-CPP.

Внутрішньогіпокампальні інфузії. Актиноміцин D (4 мкг/мкл, 0.5 мкл на сторону, 0.25 мкл/хв, у ДМСО) [19] або еквівалентний об’єм наповнювача був мікроін’єкційний у DH одразу після відновлення пам’яті . Показано, що інфузія актиноміцину D у гіпокамп у подібній концентрації порушує реконсолідацію пам’яті [19]. Arc AS-ODN або контрольний SCR-ODN (2 нмоль/мкл, 0,5 мкл/бік, 0,25 мкл/хв; у PBS) вводили мікроін’єкцією в DH за 4 години за 2 години до або 4 години після відновлення пам'яті.

Після видалення пильної чашки та фіктивних канюль проводили мікроінфузію протягом 2 хвилин мишам, які не спали, використовуючи ін’єкційні канюлі (33 G; Plastics One Inc., Роанок, штат Вірджинія, США), які виходили на 0.5 мм за направляючу наконечник канюлі. Ін’єкційні канюлі залишали на місці ще на 2 хв. Після інфузії фіктивні канюлі вставляли в направляючі канюлі, закріплювали пилозбірником, і тварин повертали до їхніх домашніх клітин. Розташування канюлі було перевірено на корональних зрізах тканини, фіксованої параформальдегідом, товщиною 30 мкм, пофарбованої крезиловим фіолетовим.

Аналіз даних

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75% часу в будь-якому з компартментів під час базового тесту було виключено з дослідження (9 із 267). Встановлення CPP було підтверджено шляхом порівняння балів CPP між вихідним рівнем і CPP тестом 1 і проаналізовано за допомогою парного t-тесту. Оскільки експресія CPP (тобто формування пам’яті) необхідна для відновлення пам’яті, дані мишей, у яких не виявлено CPP (мінімум 5% підвищення переваги між базовим рівнем і тестом 1), були виключені з експерименту (48 із 258).

Алкоголь-CPP після втручання в реконсолідацію пам’яті аналізували за допомогою змішаної моделі ANOVA з фактором лікування між суб’єктами (актиноміцин D або ODN) і фактором тесту всередині суб’єктів (тест CPP 1, тест CPP 2). Значні взаємодії були проаналізовані за допомогою тесту Стьюдента–Ньюмена–Кейлза. Щільність рівнів імунореактивного білка ARC Вестерн-блотим нормалізували до рівня GAPDH і аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з міжсуб’єктним фактором лікування, з подальшим тестом Dunnett’s post hoc. Дані експресії мРНК qRT-PCR нормалізували до Gapdh і виражали як відсоток експресії контрольної групи.

Дані з усіх генів для кожної області мозку були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з фактором лікування між суб’єктами, а потім тестом Даннета для кожного гена для порівняння з даними, отриманими від контрольної групи (без пошуку). Для РНК-послідовності, ми об’єднали тканини від 3 тварин для кожної копії та підготували таку кількість повторів: 3 для дорсального гіпокампу (DH) – без вилучення, 2 для DH – вилучення, 3 для префронтальної кори (PFC) – не вилучення, і 2 для ( PFC)-вилучення. Після повної ізоляції РНК за допомогою Trizol, бібліотеки секвенування були створені за допомогою розробленого нами методу [88].

Бібліотеки були піддані односторонньому секвенуванню 50 bp за допомогою IlluminaHiseq 2000. Після підтвердження якості даних секвенування за допомогою FastQC зчитування були зіставлені з еталонним геномом mm9 за допомогою Bowtie2 [89] і анотовані Tophat2 [90].

Зчитування, зіставлені з генами, кількісно оцінювали за допомогою функціїFeatureCounts [91]. Ми виключили Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a та їхмітохондріальну хромосому, щоб уникнути кількості надмірно ампліфікованих генів, які могли б спотворити нормалізацію бібліотеки, як описано раніше [92]. DESeq2 [58] використовувався для ідентифікації генів з диференціальною експресією (DEG) у групі Retrieval порівняно з контрольною групою No Retrieval зі значенням p, скоригованим на відсічення значущості (p(adj) < 0.05).

ДОСТУПНІСТЬ ДАНИХ Дані RNA-seq доступні в NCBI Gene Expression Omnibus за адресою https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) з маркером рецензента:knyfwwiorbutvuv.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Коллінз П.Й., Патель В., Джоестл С.С., Марч Д., Інсел Т.Р., Даар А.С. та ін. Великі виклики глобальному психічному здоров'ю. природа 2011;475:27-30.

2. Heilig M, Egli M. Фармакологічне лікування алкогольної залежності: цільові симптоми та цільові механізми. Pharmacol Therap. 2006;111:855–76.

3. Сінха Р. Нові відкриття щодо біологічних факторів, що передбачають вразливість до рецидиву залежності. Curr Psychiatry Rep. 2011; 13: 398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Реактивність на стимули, пов’язані з алкоголем, у лабораторії та в польових умовах: предиктори тяги у лікованих алкоголіків. Наркоманія.2000;95:889–900.

5. Барак С., Лю Ф., Бен Гаміда С., Йоуелл К.В., Неаста Дж., Харазія В. та ін. Порушення спогадів, пов’язаних з алкоголем, через інгібування mTORC1 запобігає рецидиву. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Мільтон А.Л. Пияцтво, наркотики та розлад: маніпуляції пам'яттю для лікування залежності. Curr Opin Neurobiol. 2013; 23: 706-12.

7. Надер К., Хардт О. Єдиний стандарт пам’яті: аргументи на користь повторної консолідації. NatRev Neurosci. 2009; 10: 224-34.

8. Дудай Ю. Реконсолідація: перевага перефокусування. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174–8.

9. Пшибиславський Дж., Сара С.Й. Реконсолідація пам'яті після її реактивації. Behav.Brain Res. 1997;84:241-6.

10. Надер К., Шафе Г.Е., Ле Ду Ж.Є. Спогади про страх потребують синтезу білка в мигдалині для повторної консолідації після пошуку. природа 2000;406:722-6.

For more information:1950477648nn@gmail.com