Наночастинки, націлені на нирки для збільшення щільності ниркової лімфи, знижують артеріальний тиск у мишей з гіпертонією

1. Введення

Ідентифікація харчових інгредієнтів з імуномодулюючими властивостями разом з їх відповідними молекулярними мішенями привернула підвищений інтерес в останні роки. Завдяки високій різноманітності лігандів надсімейство іонних каналів транзиторного рецепторного потенціалу (TRP-каналів) представляє дуже цікавий клас потенційних цільових структур.

Надродина каналів TRP у ссавців включає шість споріднених сімейств білків, а саме анкірин (TRPA), канонічний (TRPC), меластатин (TRPM), муколіпін (TRPML), поліцистин (TRPP) і сімейство ванілоїдів (TRPV), усі з яких які зазвичай мають спільні шість трансмембранних сегментів, які збираються у вигляді тетрамерів, утворюючи проникні для катіонів пори з різною катіонною селективністю.[1]Канал TRPV1, можливо, є найбільш інтенсивно дослідженим членом надродини TRP. TRPV1 спочатку ідентифікували як рецептор капсаїцину, гострого компонента перцю чилі.[2] Пізніше також було показано, що гострі інгредієнти імбиру, гінгероли, активують TRPV1.[3]

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ ТРАВ’ЯНИЙ ЦИСТАНЧ ДЛЯ НИРОК

Біологічна роль TRPV1 у ненейрональних типах клітин все ще ретельно досліджується, однак доступні результати свідчать про функції, що виходять далеко за межі сенсорного та теплового сприйняття. Наприклад, 12-тижневе втручання з щоденною дозою 0 .15 мг агоніста TRPV1 ноніваміду, структурного аналога капсаїцину, запобігали збільшенню маси жиру в організмі, спричиненому дієтою, і підвищували рівень серотоніну в плазмі у здорових людей із надмірною вагою.[4]

У адипоцитах 3T3-L1 активація TRPV1 нонівамідом зменшила накопичення ліпідів під час диференціювання та дозрівання шляхом пригнічення експресії PPAR𝛾.[5] У макрофагах капсаїцин і нонівамід послаблювали ЛПС-індуковане вивільнення прозапальних цитокінів, таких як IL6, CXCL8 і TNF-альфа, залежно від TRPV1-[6]. Тим не менш, конкретні функції TRPV1 в лейкоцитах крові людини залишаються неясними. У NK-клітинах людини 10 і 50 мкМ капсаїцину індукували підвищення внутрішньоклітинних концентрацій Ca2+, що вказувало на функціональний канал TRPV1.[7]

Однак ослаблені ефекторні функції NK-клітин, такі як цитотоксична дегрануляція та секреція цитокінів, індуковані попередньою обробкою клітин капсаїцином протягом 1 години в діапазоні концентрацій 10–100 мкМ, були значною мірою незалежними від TRPV1.[7] У Т-клітинах було задокументовано, що TRPV1 бере участь у процесах сигналізації Т-клітинних рецепторів, проліферації та диференціації Т-клітин, а також у виробництві цитокінів.[8] Попередня робота нашої групи також продемонструвала функціональну експресію TRPV1 у первинних Т-клітинах людини.[9] Крім того, аналіз дози-відповіді в концентраціях від 0,03 до 300 мкмоль L-1 показав, що [6]-гінгерол пригнічує секрецію цитокінів первинними людськими лейкоцитами зі значенням IC50 82,2 мкмоль L-1.

Однак кількісне визначення [6]-гінгеролу в зразках плазми здорових суб’єктів виявило середню максимальну концентрацію в плазмі лише 42.0 ±16,3 нмоль/л після прийому 1 л імбирного чаю. Оскільки ці концентрації [6]-гінгеролу не мали суттєвого впливу на секрецію цитокінів у попередніх дослідженнях [9], неясно, чи досягається концентрація 50 нмоль L-1 у плазмі крові після вживання 1 л імбирного чаю. , достатньо для модуляції клітинної імунної відповіді в інших первинних лейкоцитах людини.

Для нейтрофілів людини відомості про функціональну роль TRPV1 обмежені. У той час як Köse та Nazıroglu˘ [10] показали, що потоки Ca2+- в нейтрофілах у відповідь на 10 мкМ капсаїцину знижуються антагоністом TRPV1 капсазепіном, інші результати не продемонстрували, що капсаїцин індукує приплив Ca2+ під час тестування в концентрації в діапазоні 1–100 мкМ, незважаючи на виявлену експресію TRPV1RNA.[11]

Нейтрофіли є найпоширенішими лейкоцитами в крові людини, на них припадає 60–70 % усіх циркулюючих лейкоцитів. Вони є першими імунними клітинами, які рекрутуються до місць інфекції; тому їх часто називають першою лінією оборони.[12] Рекрутинг нейтрофілів ініціюється, серед іншого, бактеріальними або мітохондріальними пептидами N-формілметіонін-лейцил-фенілаланіну (fMLF) або хемокінами, такими як CXCL8 (IL-8).[13]

Захисні механізми нейтрофілів включають фагоцитоз [14], вивільнення антимікробних ферментів через дегрануляцію [15], утворення активних форм кисню (АФК) [16] і утворення позаклітинних пасток нейтрофілів [17]. Крім цих прямих захисних механізмів, нейтрофіли сприяють наступним імунним реакціям через вивільнення різних цитокінів і хемокінів.[18] Крім того, нейтрофіли можуть проходити процес праймінгу, який дозволяє їм сильніше реагувати на подальшу повну активацію.[16b]

Останніми роками з’явилося більше доказів того, що інгредієнти харчових продуктів і лікарських рослин можуть змінювати одну або більше згаданих захисних реакцій нейтрофілів людини. Ці модифікації включають підвищену фагоцитотичну активність [19] і генерацію АФК [20], посилений хемотаксис до fMLF [21] і утворення позаклітинних пасток нейтрофілів [20]. Однак активна(і) сполука(и) не була ідентифікована. Компоненти Ferula akitschkensis (𝛽-пінен, сабінен, 𝛾-терпінен, геранілацетон та ізоборнілацетат) десенсибілізували нейтрофіли до fMLF- та CXCL8-індукованого Ca2+ припливу та пригнічували fMLF-індукований хемотаксис, де геранілацетон індукований ефекти були опосередковані через TRPV1.[22]

Ґрунтуючись на наявних даних, ми припустили, що ліганд-індукована активація TRPV1 [6]-гінгеролом може впливати на загальні функції нейтрофілів або безпосередньо, або через посилення їх відповіді на активаційні подразники. У межах цієї гіпотези ми, зокрема, прагнули з’ясувати, чи є підтверджена концентрація, відповідна харчовим цінностям, достатньою для модуляції клітинної імунної відповіді в первинних нейтрофілах людини як частини популяції лейкоцитів. '

Крім того, ми намагалися порівняти рівні експресії РНК усіх членів надродини TRP у ссавців у п’яти найвідоміших типах клітин у крові людини, щоб отримати повний якісний і кількісний огляд експресії каналів TRP у лейкоцитах людини.

2. Результати

2.1. Численність і відносні рівні транскриптів каналів TRP в лейкоцитах людини

Щоб оцінити експресію РНК TRP-каналу в лейкоцитах крові, із крові здорових донорів було виділено п’ять найбільш помітних типів клітин лейкоцитів, а експресію РНК TRP-каналів аналізували за допомогою кількісної RT-PCR (рис. 1).

Специфічні транскрипти TRPV, а також родини TRPM були виявлені з високою частотою 75–100% у всіх проаналізованих типах клітин. Середня загальна частота з урахуванням усіх типів клітин становила 96% для сімейства TRPV і 98% для сімейства TRPM. TRPC-специфічні транскрипти були значно меншими, коливаючись від 0% у моноцитах, NK-клітинах, Т-клітинах і В-клітинах до 100% у NK-клітинах і Т-клітинах із загальною середньою частотою лише 53% (Малюнок 1А). Специфічний транскрипт TRPC5- було виявлено лише в нейтрофілах із частотою 70%.

Крім того, специфічний транскрипт TRPA1-загалом виявив досить низьку кількість проаналізованих типів клітин із частотою 100% у нейтрофілах, 25% у моноцитах, 80% у NK-клітинах, 100% у Т-клітинах та 60% у B-клітини. Подібним чином, специфічний транскрипт TRPML3- показав низьку частоту в нейтрофілах (50%), моноцитах (25%), NK-клітинах (40%) і B-клітинах (20%), але частоту 100% у Т-клітини. Специфічний транскрипт TRPV1- було виявлено в усіх типах клітин із частотою 100% у моноцитах, NK-клітинах і Т-клітинах і частотою 90% у нейтрофілах і 80% у В-клітинах.

Щодо відносної експресії РНК, порівняно з відповідними частотами, канали TRP виявили більш специфічну для клітинного типу структуру експресії, що видно з порівняння відповідних значень Δct у різних проаналізованих типах клітин (рис. 1B). Наприклад, TRPP3 був виявлений з частотою 100% у всіх типах клітин, але чітко виявив найвищий рівень експресії в моноцитах.

Навпаки, канал TRPV2 був виявлений у всіх досліджених типах клітин із порівняно високим рівнем експресії РНК, а також високою частотою. Подібним чином рівні транскриптів TRPV1 були подібними в усіх досліджених типах клітин (рис. 1B).

2.2. Поверхнева експресія TRPV1 на нейтрофілах

Сучасні знання про функцію TRPV1 у нейтрофілах людини все ще неясні. Для подальшого вивчення ролі TRPV1 у нейтрофілах людини ми далі досліджували, чи експресується канал TRPV1 на поверхні первинних нейтрофілів людини за допомогою проточної цитометрії живих клітин (рис. 2).

Ізольовані нейтрофіли фарбували на CD15 як поверхневий маркер для нейтрофілів (рис. 2A, B) і одночасно фарбували або антитілом, створеним проти епітопу в першій позаклітинній петлі білка TRPV1 (рис. 2B), або відповідним контролем ізотипу, останній служив як сурогат для вимірювання неспецифічного зв'язування (рис. 2A). У популяції CD15+ було проаналізовано інтенсивність флуоресценції для FITC. Фарбування нейтрофілів антитілом TRPV1 призвело до чітко помітного флуоресцентного сигналу порівняно з контролем ізотипу, тим самим підтверджуючи поверхневу експресію TRPV1 у первинних нейтрофілах людини (рис. 2C). Аналіз нейтрофілів від чотирьох окремих донорів виявив порівнянну поверхневу експресію TRPV1 (рис. 2D).

2.3. [6]-гінгерол індуковане збільшення внутрішньоклітинного кальцію2+

Оскільки ліганд-індукована активація TRPV1 призведе до припливу Ca2+[23], внутрішньоклітинні концентрації Ca2+ нейтрофілів визначали за допомогою Ca2+-чутливого барвника Fura-2. На основі наших попередніх висновків [9] було обрано концентрацію 5 0 нМ добре відомого ліганду TRPV1 [6]-гінгеролу та час інкубації 2 години. Аналіз показав, що інкубація нейтрофілів із 50 нМ [6]-гінгеролом призвела до збільшення внутрішньоклітинних концентрацій Ca2+, які становили в середньому 18,4% ± 1,0% від максимального значення, як визначено шляхом застосування 1 мкМ іонофореіономіцину. Збільшення, спричинене ДМСО, становило 4,7% ± 1,2% (рис. 3).

2.4. Вплив [6]-гінгеролу на експресію TRPV1

Далі ми мали на меті проаналізувати вплив стимуляції TRPV1 [6]-гінгеролом на експресію TRPV1 на рівні транскрипту за допомогою q-RTPCR, а також на рівні поверхневого білка за допомогою фарбування живих клітин. З цією метою нейтрофіли людини інкубували з 50 нМ [6]-гінгеролом протягом 2 годин і кількісно визначали відповідні рівні експресії.

Ця 2-годинна інкубація не вплинула ні на рівень транскрипту TRPV1, ні на рівні протеїну (рис. 4), а також не змінила, за винятком IL6, IL17A, IL24, C5 і GDF5, експресію РНК поширених досліджених генів цитокінів і хемокінів (рис. S1, таблиця S2). ,Додаткова інформація).

2.5. Вплив [6]-гінгеролу на експресію поверхневих маркерів нейтрофілів

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ