Гомозиготний Dab1−// є потенційною новою причиною аутосомно-рецесивних вроджених аномалій нирок і сечовивідних шляхів мишей

edmund.chen@wecistanche.com

вступ

Мутантні миші Yotari, отримані шляхом спонтанного придбання мутації в гені Dab1, демонструють гістологічні аномалії в центральній нервовій системі [1, 2], дуже подібні до таких у мишей reeler (reelin//), що свідчить про те, що reelin і DAB1 належать до той самий сигнальний шлях [1–4]. Повідомлялося, що аберації в шляху reelin/DAB1 пов’язані з різними психічними розладами [5–7]. Цікаво, що крім центральної нервової системи, присутність білків DAB1 і reelin також була підтверджена в периферичній нервовій системі та деяких позанейральних тканинах. Присутність DAB1 була виявлена ​​в подоцитах миші [8] і плоді людининирки[9], тоді як про експресію ріліну повідомлялося під час внутрішньоутробного розвитку миші та людини, а також у деяких ендотеліальних клітинах уздовж кровоносних судин у дорослих мишей [9–11]. Канонічний шлях reelin/DAB1 може ініціювати різні білки нижче за течією, включаючи рецептори NOTCH2, які відіграють вирішальну роль у прийнятті рішень щодо долі клітини та диференціації під часниркарозвитку [12–14]. Рецептори NOTCH2 необхідні для формування проксимальних канальців і подоцитів [13], але після досягнення дозрівання нефрону цей шлях здебільшого припиняється [15]. В умовах гострогохвороби нирок,підвищена експресія NOTCH2 потенційно може сприяти регенерації, тоді як стійка експресія причинно пов’язана з інтерстиціальним фіброзом і гломерулосклерозом [15]. Пониження регуляції сигналізації NOTCH може значно зменшити аутофагію та спричинити порушення диференціації подоцитів під час розвитку [16].

Отже, дисфункціональні подоцити відіграють вирішальну роль у захворюваннях клубочків, особливо в ідіопатичному нефротичному синдромі людини [17,18] і в нефротичному синдромі мінімальних змін (MCNS) [19]. Отже, аутофагія підтримує клітинний гомеостаз за нормальних фізіологічних умов, тоді як за патологічних станів вона може прогресувати до аутофагічної смерті [20]. Широко використовуваним біомаркером аутофагії є LC3B, структурний білок аутофагосомних мембран [21]. Складні перехресні перешкоди між аутофагією та апоптозом також сприяють підтримці гомеостатичної рівноваги як відповіді на мікрооточення клітини. Добре відомо, що під час апоптозу збільшується кількість подійниркарозвиток [22] і значно зменшується після завершення дозрівання, за винятком умовураження нирок[23]. Безперечно, апоптоз є складним механізмом, який регулюється через взаємодію кількох шляхів, але в основному завершується активацією каспази3 (CASP3), чия активація є одним із найбільш часто використовуваних маркерів для виявлення апоптозу [23].

У цьому звіті ми мали на меті проаналізувати, як впливає глушіння функції гена Dab1ниркаморфологія та експресія та локалізація білків reelin, NOTCH2, LC3B та розщеплених CASP3 у постнатальних мишейнирки. Ми припускаємо, що ці білки експресуються в постнатальній мишінирка,і їх функціональна взаємодія сприяє підтримці їх структури та функції. Крім того, наявність DAB1 була підтверджена під час внутрішньоутробного розвитку людининиркарозвитку [9], можна припустити, що його інактивація може спричинити розлад у широкому спектрі вроджених аномалійниркаі сечовивідних шляхів (CAKUT).

Ключові слова:йотарі; функції нирок; постнатальний розвиток нирок; імунофлюоресцентне фарбування; трансмісійна електронна мікроскопія

CISTANCHE ПОКРАЩАЄ ФУНКЦІЮ НИРОК

Матеріали та методи

Колекція зразківЯк нульові звичайні мутанти Dab1 ми використовували мишей yotari (Dab1/), раніше описаних Howell et al. [24]. Для генотипування мишей використовували ПЛР-праймери: GCC CTTCAGCATCACCATGCT і CAGTGAGTACATATTGTGTGAGTTCC, дикий тип локусу Dab1: GCCCTTCAGCATCACCATGCT і CCTTGTTTCTTTGCTTTAA-GGCTGT [5]. Мишей C57BL/6 N вирощували та розміщували в стандартних полікарбонатних клітках (включаючи принаймні одну з кожного генотипу) з довільним доступом до їжі та води в кімнаті з контрольованою температурою (23 ± 2 ◦C) з 12-годинним освітленням/ темний цикл. У постнатальні дні 4, 11 і 14 (P4, P11 і P14) мишей глибоко анестезували пентобарбіталом і транскардіально перфузували протягом 10 хвилин фосфатно-сольовим буферним розчином (PBS, pH 7,2) і 4% параформальдегіду (PFA). ) в 0,1 М PBS.ниркивидаляли та фіксували 4 відсотками PFA в 0.1 М PBS протягом ночі для звичайних гістологічних аналізів (гематоксилін-еозин (H&E), імуногістохімічне та імунофлуоресцентне фарбування) та в суміші 2% PFA плюс 2,5% глутарового альдегіду (GA). для дослідження під електронним мікроскопом. Після фіксації тканину готували для подальшого гістологічного дослідження, як ми описували раніше [25,26].

Імунофлюоресценція та імунопероксидазне фарбуванняПісля депарафіфінізації та регідратації зрізи нагрівали протягом 20 хв у 0.01 М цитратному буфері (pH 6,0) у водяному пароварці, а потім охолоджували до кімнатної температури. Блокуючий буфер (ab 64226, Abcam, Cambridge, UK) наносили на 30 хвилин, щоб виключити неспецифічне фарбування. Потім зрізи інкубували у вологій камері протягом ночі з первинними антитілами (таблиця 1). Після промивання в PBS вторинні антитіла (таблиця 1) наносили на одну годину і знову промивали в PBS. Потім ядра фарбували 4060 -діамідіно-2-феніліндолом (DAPI) протягом 2 хвилин, промивали PBS і накривали покривним скельцем. Ми провели преадсорбційний тест, щоб кожне первинне антитіло використовувалося з відповідним пептидом і застосували їх комбінацію до зрізів. Результати показали відсутність фарбування антитіл. Крім того, проводили контролі з пропуском первинного антитіла для визначення рівнів неспецифічного зв'язування вторинних антитіл.

Для фарбування імунопероксидазою кролячі поліклональні анти-CASP3 (1:100 розведення, ab13847, Abcam, Кембридж, Великобританія) застосовували як первинне антитіло протягом однієї години у вологій камері після обробки зрізу 0,1 відсоток H2O2. Після промивання PBS проводили вторинне виявлення з використанням зв’язку та стрептавідинпероксидази, кожного протягом п’ятнадцяти хвилин (DakoCytomation, CA 93013 США, LOT 03477) і діамінобензидину (Dako, CA 93013 США, LOT 10051369), ретельно контролюючи, щоб уникнути надмірного фарбування фону. Ядра забарвлювали гематоксиліном, промивали у водопровідній воді протягом 10 хв, короткочасно зневоднювали у зростаючій серії розчинів етанолу та покривали покривним скельцем.

Підготовка тканини до трансмісійного електронного мікроскопа (ТЕМ)Після фіксації сумішшю 2% PFA і 2,5% GA в 0.1 М PBS протягом 2 годин, зразки промивали PBS і постфіксували у водному розчині 2% чотириокису осмію протягом 2 годин. Усі зразки двічі промивали PBS, зневоднювали етанолом у зростаючій кількості та заливали в Epon 812 (TAAB Laboratories Equipment, Reading, UK). Серійні зрізи (товщиною 70 нм) вирізали на ультрамікротомі Ultracut UCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Німеччина) і фарбували 1% уранілацетату та цитрату свинцю.

Збір та аналіз данихАналіз проводився за допомогою епіфлюоресцентного мікроскопа (Olympus BX51, Токіо, Японія), оснащеного цифровою камерою DP71 (Olympus), трансмісійного електронного мікроскопа JEM 1400 (JEOL, Токіо, Японія), що працював при 80 кВ і фотографувався за допомогою зарядного пристрою JEOL. система камери зі з’єднаним пристроєм (CCD) (Advanced Microscopy Techniques, Денверс, Массачусетс, США) і, нарешті, мікроскоп із яскравим світловим полем (BX40, Olympus, Токіо, Японія). Усі проаналізовані зображення були оброблені за допомогою програмного забезпечення ImageJ та Adobe Photoshop (Adobe, Сан-Хосе, Каліфорнія, США). На досліджувану групу використовували по три-чотири тварини. Все зібранониркибули розрізані на зрізи товщиною 5 мкм і максимумнирка length determined by using these samples was reported. Mean proximal convoluted tubules (PCT), distal convoluted tubules (DCT) and glomeruli diameters were determined by averaging 100 structure diameters per analyzed sample. As nephron segments have irregular shapes, we took the largest diameter of every examined segment as representative. The staining intensity was semiquantitatively evaluated at four degrees: the absence of any reactivity (( ), mild reactivity (+), moderate reactivity (++), and strong reactivity (+++) (Table 2). The number of DAB1, reelin, NOTCH2, LC3B, and cleaved CASP3 immunoreactive cells was counted and expressed as a percentage of total cells. For each sample, we analyzed twenty PCT, DCT, and G at ×40 objective magnifification. We averaged the number of positive cells per group. Any level of nuclear, cytoplasmic, or membrane staining was regarded as positive. Three investigators analyzed the images independently. Interrater agreement was tested with interclass correlation analysis, which yielded a coeffificient >0.75, що вказує на чудову згоду [27].

Статистичний аналізДвосторонній t-критерій був виконаний для аналізу відмінностей у середньому діаметрі між PCT, DCT і G тварин дикого типу та йотарі. Діаметр був представлений як середнє ± стандартне відхилення (SD). Рівень значущості було встановлено на р < 0.05.="" двосторонній="" тест="" anova="" з="" наступним="" тестом="" множинного="" порівняння="" тьюкі="" використовувався="" для="" вивчення="" відмінностей="" у="" відсотках="" позитивних="" клітин="" між="" pct,="" dct="" і="" клубочками="" за="" весь="" час.="" відсоток="" позитивних="" клітин="" виражали="" як="" середнє="" ±="" стандартна="" помилка="" середнього="" (sem).="" рівень="" значущості="" був="" встановлений="" на="" р="">< 0,05.="" аналіз="" проводили="" в="" програмному="" забезпеченні="" graphpad="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca,="">

Результати

Фарбування гематоксилін-еозином (H&E) і вимірювання діаметра ниркиH&E фарбування середньосагітальних відділівниркина всіх розглянутих точках часу виділяє малниркафенотип мишей йотарі порівняно з мишами дикого типу (рис. 1а). На 4P означаєниркадіаметр тварин йотарі був приблизно 55 мкм, ніж приблизно 75 мкм. Крім того, ця різниця була помітна в більш пізні моменти часу через повільніше зростанняниркив йотарі порівняно з прогресивним зростаннямниркиу тварин дикого типу. Щоб визначити, чи є зниження загниркарозміру було спричинено зменшенням розміру сегмента нефрону, ми усереднювали діаметр PCT, DCT та G на групу. Дійсно, спостерігалося зменшення середнього діаметра G, PCT і DCT у групі йотарі порівняно з диким типом (рис. 1b, p < 0.05).="" крім="" того,="" фарбування="" h&e="" виявило="" тоншу="" кору="">нирковийрозширення тазу у тварин йотарі та злегка дифузно розширена DCT на 14P. Основна структура та характер дозрівання клубочків однакові в обох досліджених групах тварин.

Описовий гістологічний аналіз на основі мікрофотографій ПЕМНа мікрофотографіях отримані за допомогою ТЕМ, клубочки мишей дикого типу показали типовий вигляд усіх частин фільтраційного бар’єру, які були нормально розвинені та розпізнавані (рис. 2а). Подоцити, відростки ніжок подоцитів і ніжки, фільтраційні щілини, базальні мембрани клубочків і просвіт капілярів з фенестрованим ендотелієм можна було легко розрізнити (рис. 2а). З іншого боку, в клубочках мишей йотарі можна спостерігати прогресуюче пошкодження подоцитів зі стиранням відростка стопи та відсутністю фільтраційних щілин (Рис. 2b–d). Ці ультраструктурні зміни спостерігалися у всіхниркидосліджено та залучено більшість досліджуваних клубочків. Не було помічено жодних відхилень у PCT або DCT мишей йотарі, ніж у тварин дикого типу (рис. 2e–h). У PCT клітинні інтерфейси були визначені погано через нерегулярність клітинних мембран і переміщення клітин із сусідніми. Цитоплазма була багатою, містила добре помітні ядра, подовжені мітохондрії, базальні складки та багато трубчастих ямок між мікроворсинками, які утворювали щіткову облямівку на апікальній мембрані. Більше збільшення показало апікальну поверхню епітеліальних клітин PCT, що містить довгі мікроворсинки для формування щіткової облямівки та щільні з’єднання між межами клітин просвіту сусідніх трубчастих епітеліальних клітин (рис. 2e,f). З іншого боку, апікальна поверхня епітеліальних клітин DCT містила кілька коротких мікроворсинок і численні везикули (рис. 2g,h).

Малюнок 2. Мікрофотографії дикого типу та йотарі, зроблені трансмісійним електронним мікроскопом (ТЕМ)ниркиКлубочки тварин дикого типу (а) показали нормально розвинений фільтраційний бар’єр з фенестрованим ендотелієм (Е) капіляра (С), базальної мембрани (BM), подоцитів (P) з ніжками (PE) і фільтраційних щілин (FS). ). Вниркитварин йотарі можна помітити стирання ніжок та відсутність фільтраційних щілин (зірочки, б–г). Не було помічено жодних аномалій у проксимальних звивистих канальцях (PCT) або дистальних звивистих канальцях (DCT) мишей йотарі порівняно з тваринами дикого типу (e–h). У PCT цитоплазма була у великій кількості, містила добре помітні ядра (N), подовжені мітохондрії (M), базальні складки (BI) і багато трубчастих ямок (TP) між мікроворсинками, які утворювали щіткову облямівку (BB) на апікальна мембрана (e,f). Більше збільшення показало апікальну поверхню епітеліальних клітин PCT, що містить довгі мікроворсинки для формування щіткової облямівки та щільних з’єднань (TJ) між межами клітин просвіту сусідніх трубчастих епітеліальних клітин (e, f). З іншого боку, апікальна поверхня епітеліальних клітин DCT містить кілька коротких мікроворсинок і численні везикули (g, h). Масштабна шкала на зображеннях (a–d) і вставках (e–h) становить 1 мкм; шкала на зображеннях (e–h) становить 2 мкм.

Локалізація та спільна локалізація Reelin і DAB1Рилін був слабко виражений із легкою та помірною реактивністю (таблиця 2) у клубочках і DCT усіх обстежених тварин у всі спостережувані моменти часу (p < 0.05,="" рис.="" 3a).="" лише="" в="" pct="" мишей="" йотарі="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим,="" ніж="" у="" тварин="" дикого="" типу="" (p=""><0,05, рис.="" 3a).="" у="" клубочкових="" клітинах="" локалізація="" фарбування="" була="" перинуклеарною,="" тоді="" як="" у="" pct="" і="" dct="" вона="" була="" розсіяна="" по="" всій="" цитоплазмі="" (рис.="" a,="">

малюнок 4. Імунофлуоресцентне фарбування постнатального йотаріниркиз маркером Reelin (a) і подвійним імунофлуоресцентним фарбуванням постнатального дикого типуниркиз маркерами DAB1 і бобіни (b). (a, b) Фарбування DAPI ядерної ДНК злито з DAB1, і імунофлуоресценція reelin показана паралельно (злиття). Спостережувані часові точки були P4, P11, P14. Експресія досліджуваних маркерів у клубочках (G), проксимальних звивистих канальцях (PCT) і дистальних звивистих канальцях (DCT) позначена стрілками, тоді як зірочки вказують на експресію reelin у позаклітинному матриксі (a). Вставки показують найбільш помітний вираз на зображенні. Ядерне фарбування DAPI виявило слабку спільну локалізацію DAB1 і ріліна, переважно в DCT (стрілка). Масштабна шкала становить 20 мкм і стосується всіх зображень.

Майже не було імунної реактивності DAB1 у клубочках і PCT тварин дикого типу на P4, тоді як відсоток позитивних клітин із помірною реактивністю (табл. 2) значно збільшився на P11 та P14 (p < 0).05,="" малюнок="" 3b).="" у="" dct="" dab1="" експресувався="" переважно="" в="" апікальній="" і="" бічній="" частинах="" клітинних="" мембран="" (рис.="" 4b)="" із="" сильною="" реактивністю="" (табл.="" 2).="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим,="" ніж="" у="" попередніх="" структурах,="" близько="" 60="" відсотків="" (малюнок="" 3b),="" особливо="" в="" macula="" densa="" (малюнок="" 4b).="" майже="" не="" було="" спільної="" локалізації="" dab1="" і="" reelin,="" за="" винятком="" dct="" тварин="" дикого="" типу="" на="" p14="" (наконечник="" стрілки,="" рис.="" 4b).="" biomolecules="" 2021,="" 11,="" 609="" 8="" of="" 14="" рисунок="" 4.="" імунофлюоресцентне="" фарбування="" постнатального="">ниркиз маркером Reelin (a) і подвійним імунофлюоресцентним фарбуванням постнатального дикого типуниркиз маркерами DAB1 і бобіни (b). (a, b) Фарбування DAPI ядерної ДНК злито з DAB1, і паралельно показана імунофлюоресценція reelin (злиття). Спостережувані часові точки були P4, P11, P14. Експресія досліджуваних маркерів у клубочках (G), проксимальних звивистих канальцях (PCT) і дистальних звивистих канальцях (DCT) позначена стрілками, тоді як зірочки вказують на експресію reelin у позаклітинному матриксі (a). Вставки показують найбільш помітний вираз на зображенні. Ядерне фарбування DAPI виявило слабку спільну локалізацію DAB1 і ріліна, переважно в DCT (стрілка). Масштабна шкала становить 20 мкм і стосується всіх зображень. Майже не було імунної реактивності DAB1 у клубочках і PCT тварин дикого типу на P4, тоді як відсоток позитивних клітин із помірною реактивністю (табл. 2) значно збільшився на P11 та P14 (p <0,05, рис.="" 3b).="" у="" dct="" dab1="" експресувався="" переважно="" в="" апікальній="" і="" бічній="" частинах="" клітинних="" мембран="" (рис.="" 4b)="" із="" сильною="" реактивністю="" (табл.="" 2).="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим,="" ніж="" у="" попередніх="" структурах,="" близько="" 60="" відсотків="" (малюнок="" 3b),="" особливо="" в="" macula="" densa="" (малюнок="" 4b).="" практично="" не="" було="" спільної="" локалізації="" dab1="" і="" reelin,="" за="" винятком="" dct="" тварин="" дикого="" типу="" на="" p14="" (наконечник="" стрілки,="" рис.="">

Просторові та часові шаблони експресії NOTCH2 і LC3BВідсоток NOTCH{{0}}позитивних клітин становив менше 20 відсотків у клубочках обох генотипів тварин у всі спостережувані моменти часу. Лише на P14 відсоток позитивних клітин був значно вищим у клубочках тварин йотарі, ніж у тварин дикого типу (p <0,05, рис.="" 3c).="" інтенсивність="" фарбування="" була="" від="" легкої="" до="" помірної="" (таблиця="" 2),="" переважно="" розташована="" перинуклеарно="" (рис.="" 5a–f).="" у="" pct="" та="" dct="" обох="" генотипів="" тварин="" відсоток="" позитивних="" клітин="" збільшувався="" з="" часом.="" на="" p14="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим="" у="" pct="" та="" dct="" тварин="" йотарі,="" ніж="" у="" pct="" та="" dct="" тварин="" дикого="" типу="" (p=""><0,05, рис.="" 3c).="" інтенсивність="" сигналу="" в="" усі="" спостережувані="" моменти="" часу="" була="" від="" слабкої="" до="" помірної="" (таблиця="" 2)="" і="" розсіяна="" по="" цитоплазмі="" (рис.="" 5a–f).="" рисунок="" 5.="" імунофлуоресцентне="" фарбування="" постнатального="" дикого="" типу="" та="">ниркиз маркерами NOTCH2 і LC3B і імунопероксидазним фарбуванням маркером розщепленої каспази3 (CASP3). (a–f) Фарбування DAPI ядерної ДНК об’єднується з NOTCH2 і LC3B. Спостережувані часові точки були P4, P11, P14. Експресія маркерів NOTCH2 і LC3B в клубочках (G), проксимальних звивистих канальцях (PCT) і дистальних звивистих канальцях (DCT) позначена стрілками. Особливо сильну реактивність LC3B можна спостерігати в капсулі Боумена клубочків, що розпадаються (зірочка, e). Вставки показують найбільш помітний вираз на зображенні. CASP3 був слабко виражений у всіх спостережуваних точках часу. Єдина значна експресія була в клубочках мишей йотарі на P14 (стрілки). Масштабна шкала становить 20 мкм і стосується всіх зображень. Біомолекули 2021, 11, 609 9 з 14 3.4. Просторові та часові моделі експресії NOTCH2 і LC3B Відсоток NOTCH2-позитивних клітин становив менше 20 відсотків у клубочках обох генотипів тварин у всі спостережувані моменти часу. Лише на P14 відсоток позитивних клітин був значно вищим у клубочках тварин йотарі, ніж у тварин дикого типу (p <0,05, рис.="" 3c).="" інтенсивність="" фарбування="" була="" від="" легкої="" до="" помірної="" (таблиця="" 2),="" переважно="" розташована="" перинуклеарно="" (рис.="" 5a–f).="" у="" pct="" та="" dct="" обох="" генотипів="" тварин="" відсоток="" позитивних="" клітин="" збільшувався="" з="" часом.="" на="" p14="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим="" у="" pct="" та="" dct="" тварин="" йотарі,="" ніж="" у="" pct="" та="" dct="" тварин="" дикого="" типу="" (p=""><0,05, рис.="" 3c).="" інтенсивність="" сигналу="" в="" усі="" спостережувані="" моменти="" часу="" була="" від="" слабкої="" до="" помірної="" (таблиця="" 2)="" і="" розсіяна="" по="" цитоплазмі="" (рис.="">

Рисунок 5. Імунофлюоресцентне фарбування постнатального дикого типу та йотаріниркиз маркерами NOTCH2 і LC3B і імунопероксидазним фарбуванням маркером розщепленої каспази3 (CASP3). (a–f) Фарбування DAPI ядерної ДНК об’єднується з NOTCH2 і LC3B. Спостережувані часові точки були P4, P11, P14. Експресія маркерів NOTCH2 і LC3B в клубочках (G), проксимальних звивистих канальцях (PCT) і дистальних звивистих канальцях (DCT) позначена стрілками. Особливо сильну реактивність LC3B можна спостерігати в капсулі Боумена клубочків, що розпадаються (зірочка, e). Вставки показують найбільш помітний вираз на зображенні. CASP3 був слабко виражений у всіх спостережуваних точках часу. Єдина значуща експресія була в клубочках мишей йотарі на P14 (стрілки). Масштабна шкала становить 20 мкм і стосується всіх зображень.

У клубочках і DCT обох генотипів тварин відсоток LC3B-позитивних клітин збільшувався з часом (p < 0.05,="" рис.="" 3d).="" на="" p11="" і="" p14="" відсоток="" позитивних="" клітин="" був="" значно="" вищим="" у="" клубочках="" тварин="" йотарі,="" ніж="" у="" клубочках="" тварин="" дикого="" типу="" (p="">< 0.05,="" рис.="" 3d).="" у="" клубочках="" тварин="" йотарі="" інтенсивність="" фарбування="" була="" переважно="" від="" помірної="" до="" сильної="" (табл.="" 2),="" розташованих="" у="" перинуклеарному="" та="" ядерному="" просторі="" (рис.="" 5a–f),="" у="" всі="" спостережувані="" моменти="" часу,="" тоді="" як="" у="" клубочках="" мишей="" дикого="" типу="" інтенсивність="" була="" переважно="" помірний="" (табл.="" 2).="" pct="" йотарі="" та="" тварин="" дикого="" типу="" містила="" близько="" 20="" відсотків="" позитивних="" клітин="" у="" всі="" спостережувані="" моменти="" часу="" (p=""><0,05, рис.="">

Розщеплений вираз CASP-3Майже не було вираження активованого CASP-3 униркитварин дикого типу в усі спостережувані моменти часу. У PCT та DCT мишей yotari кілька окремих клітин були CASP-3-позитивними (рис. 3e). Лише в клубочках нирок йотарі на P14 (рис. 5e) відсоток позитивних клітин суттєво збільшився порівняно зниркимишей дикого типу (p < 0.05, рис. 3e).

Обговорення

ниркаморфогенез і розвиток є складними процесами, точно скоординованими через взаємодію великої кількості генів. Вроджені аномаліїниркаі сечовивідних шляхів (CAKUT) є найпоширенішим вродженим дефектом, який становить 23 відсотки всіх таких дефектів і є основною причиною термінальної стадіїзахворювання нироку дітей [28,29]. Порушення одного гена можуть бути основним джерелом CAKUT, і до цього часу мутація в більш ніж 20 генах була ідентифікована як причина CAKUT [30]. Оскільки наша попередня робота показала велику експресію DAB1 під час нормального внутрішньоутробного розвитку людининиркарозробки [9], ми припустили, що DAB1 може відігравати значну роль у ссавцяхниркарозвитку. Щоб підтвердити нашу гіпотезу, ми дослідилиниркаморфологія та моделі експресії ріліна, NOTCH2, LC3B та активованих білків CASP3 у мишей з нокаутом Dab1.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ БІЛЬ У НИРКАХ/НИРКАХ

Розрізання мишей йотаріниркивиявили тоншу кору та значно меншу середнюниркаі діаметри PCT, DCT і G порівняно з тваринами дикого типу. Зменшення вниркарозмір, викликаний недостатньою забезпеченістю нефронів, відомий якнирковийгіпоплазія, одне з найпоширеніших розладів CAKUT, яке спричиняє гіпертензію у дорослому віці та хронічну хворобу нирок [31]. Крім того, мікрофотографії, зроблені за допомогою ТЕМ, показали, що миші йотарі демонстрували помітне пошкодження подоцитів зі стиранням відростка стопи та відсутністю фільтраційних щілин. Після пошкодження подоцити зазнають процесу стирання, під час якого вони втрачають свою структуру, що призводить до зниження їх фільтраційної бар’єрної функції [32]. Усі форми нефротичного синдрому, як і фокальний сегментарний гломерулосклероз (ФСГС), характеризуються дефектами структури або функції подоцитів [33].

Наше поточне дослідження показало найвищу експресію DAB1 в апікальній і бічній частинах клітинних мембран DCT, тоді як REELIN був в основному розсіяний по цитоплазмі PCT. У досліджувані моменти часу не спостерігалося жодних морфологічних змін у канальцях мишей йотарі, але необхідні подальші дослідження для з’ясування ролі DAB1 у тубулоінтерстиціальних компартментах. Іноді спостерігалася спільна локалізація білків DAB1 і REELIN, переважно в DCT. Ці висновки є результатом нашої попередньої роботи щодо експресії цих двох білків у плоді людининиркарозвитку [9]. Це може свідчити про те, що DAB1 і reelin виконують однакові ролі у людини та мишіниркишляхом активації деяких низхідних шляхів, таких як сигнальні каскади Crk, MAPK і PI3K/Akt/mTOR [34–36]. Наші дані також виявили підвищену експресію ріліну в клубочках мишей йотарі. Цікаво, що попереднє дослідження показало, що фосфорилювання DAB1 і підвищена експресія ріліну в клубочках супроводжуються гіпертензією, протеїнурією та пошкодженням подоцитів у щурів, яким вводили Ang II [10].

Крім того, імунофлуоресцентне фарбування виявило підвищену експресію рецепторів NOTCH2 у клубочках мишей P14 yotari. Добре відомо, що експресія NOTCH2 знижується після досягнення дозрівання нефрону, за винятком умовураження нирок,таких як діабетична нефропатія та ФСГС [15,37]. Миші з індукованим адріаміцином нефротичним синдромом також продемонстрували підвищену експресію активованого NOTCH2, який полегшує фіфіброз [38]. У досліджувані моменти часу ми не помітили збільшення фіброзу, але залишається з’ясувати точну роль експресованого NOTCH2 у постнатальному йотарінирки.Потрібне подальше спостереження, щоб визначити, чи відбуваються фіброзні зміни на пізніх стадіях. Проте вже є деякі висновки, які свідчать про те, що короткочасний ефект підвищеної активації NOTCH2 пов’язаний із значною перевагою виживання пошкоджених подоцитів, яка втрачається в довгострокових моделях, таких як діабетична нефропатія [39].

Більш висока експресія LC3B в клубочках мишей P11 і P14 йотарі, ймовірно, відображає накопичення аутофагосом в подоцитах. Щоб чітко показати, що аутофагія була прискорена. Необхідно проаналізувати співвідношення експресії білка LC3-II та LC3-I. У нормальних умовах аутофагія необхідна для нормфункції нирок[40], особливо в подоцитах. Через обмежену здатність до поділу та заміни клітин вони демонструють високий базальний рівень аутофагії [41]. Незважаючи на ці висновки, повідомлялося про підвищення експресії LC3B при кількох клубочкових захворюваннях [42–44], головним чином у зв’язку зі стиранням стопи та розвитком нефротичного синдрому, як це спостерігалося у мишей з умовним нокаутом проренінового рецептора [45,46]. Усі ці дослідження свідчать про захисну роль посиленої аутофагії при патологічних станах, що додатково підтверджується висновками про нефропатію, спричинену адріаміцином, де аутофагія активується для захисту від пошкодження подоцитів [43], а також при вікових захворюваннях клубочків, де вона затримується прогресуюче функціональне зниженняфункції нирок[40]. Аналіз людининиркабіопсії також показали ознаки посилення аутофагії у зв’язку зі стиранням відростка стопи при кількох клубочкових захворюваннях, включаючи нефротичний синдром мінімальних змін (MCNS), який є однією з найпоширеніших причин ідіопатичного нефротичного синдрому [19]. В умовах діабетичної нефропатії та ліпополісахарид-індукованої гостроїураження нирок,посилення аутофагії за допомогою деяких терапевтичних засобів шляхом інгібування шляху PI3K/AKT/mTOR покращує функцію нирок [47,48]. Усі ці висновки вказують на те, що аутофагія відіграє незамінну цитопротекторну роль для адаптації до стресу вураження нирок, і його модуляція може бути багатообіцяючою терапевтичною стратегією, хоча за деяких обставин аутофагія також може бути шкідливою та прогресувати до клітинної смерті.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ НИРКОВУ/НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ

За винятком підвищення аутофагії, підвищений рівень апоптозу також можна спостерігати в клубочках мишей P14 yotari. Аутофагія зазвичай запобігає апоптозу, але за певних патологічних обставин вона також може мати протилежний вплив на виживання клітин шляхом посилення та сприяння апоптозу [42]. Після народження апоптоз вниркизначно зменшується, за винятком умовураження нирок,таких як ідіопатичний нефротичний синдром, де сприяє розвитку захворювання [23]. потенційна нова причина аутосомно-рецесивних вроджених аномалійниркаі сечовивідних шляхів. Однак основна роль DAB1 під часниркарозвиток залишається неясним. Крім того, у цих мишей спостерігалися аномалії процесів стопи та підвищений рівень білків reelin, NOTCH2, LC3B та розщеплених CASP3 у клубочках, що може призвести до пошкоджень клубочків, таких як нефротичний синдром, який у зв’язку з гіпоплазією може бути потенційною причиною смерті цих тварин у період відлучення. Щоб підтвердити цю гіпотезу, необхідно надати додаткову інформацію щодо артеріального тиску та інших клініко-лабораторних параметрів, таких як рівні сироваткового креатиніну, альбуміну та білків.