Двовалентна жива аттенуйована вакцина проти вірусу грипу захищає свиней від дрейфованих клінічних ізолятів H1N2 і H3N2. Частина 1

Анотація:

Віруси грипу А (ІГВ) можуть спричинити дуже заразне респіраторне захворювання для багатьох видів ссавців. У свиней ІАВ викликають високу захворюваність і низьку смертність у сприйнятливих популяціях, що може мати значні фінансові та виробничі наслідки. Вони також можуть створювати можливості для мутацій і перегрупування генів, утворюючи штами грипу з потенціалом пандемії.

Грип А є дуже заразним респіраторним захворюванням, яке становить серйозну загрозу для глобальної громадської охорони здоров’я. Дослідження, пов’язані з імунітетом, показали, що сильна імунна система може допомогти людям краще боротися з вірусом, коли вони інфіковані вірусом грипу, тим самим зменшуючи частоту та тяжкість захворювання.

Імунітет - це здатність нашої імунної системи боротися з хворобою. Імунна система людини складається з двох частин: вродженого імунітету та набутого імунітету. Вроджена імунна система – це те, з чим ми народжуємося, і має здатність всього організму захищати від хвороб. Набута імунна система — це імунітет, який поступово виникає у нашому житті, в основному включає гуморальний імунітет, що складається з імунних клітин і антитіл, і клітинний імунітет, що складається з Т-клітин і імунних клітин.

Дослідження показали, що, дотримуючись здорового способу життя та дієти, займаючись спортом і отримуючи достатню кількість вітамінів та інших поживних речовин, ви можете покращити свою імунну систему. Крім того, вакцина також може підвищити імунітет організму до вірусів грипу та знизити захворюваність.

Віруси грипу А є спільними для людей і тварин, тому вони часто мутують. Особливо восени та взимку імунітет людей знижений, і вірус грипу А може легко атакувати, скориставшись цією можливістю. Але якщо ми будемо наполягати на розвитку здорового способу життя, посиленні фізичних вправ і активній вакцинації, ми зможемо покращити наш імунітет і краще протистояти вторгненню вірусу грипу А. Крім того, якщо ви виявили симптоми, схожі на грип, вам слід вчасно звернутися до лікаря та отримати лікування, щоб ваш організм міг швидко відновитися.

Коротше кажучи, між вірусом грипу А та імунітетом існує взаємний вплив. Зміцнення імунітету, дотримання здорового способу життя та харчування, а особливо вакцинація – все це ефективні заходи профілактики та боротьби з вірусом грипу А. Налаштовуймося на позитив і рухаймося до здорового способу життя з точки зору профілактики вірусу грипу А! Видно, що нам потрібно підвищувати імунітет. Цистанхе може істотно підвищити імунітет, тому що м'ясна зола містить різноманітні біологічно активні інгредієнти, такі як полісахариди, два гриби Хуан Лі та ін. Ці інгредієнти можуть стимулювати різні імунні системи. клітиноподібні клітини, підвищуючи їх імунну активність.

Переваги Click cistanche tubulosa

Тому дуже важливо запобігати та контролювати інфекцію грипу у свиней, і головним способом зробити це є вакцинація. Найбільш поширеними у свиней у всьому світі підтипами IAV є H1N1, H1N2 і H3N2; однак генетичне різноманіття цих вірусів може сильно відрізнятися залежно від регіону. Раніше ми розробили еластазозалежну двовалентну живу атенуйовану вакцину з використанням двох ізолятів канадського вірусу свинячого грипу A (swIAV), A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] і A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2) ) [SD69], який захищав від гомологічних штамів.

У цьому дослідженні ми демонструємо, що ця вакцина поширює захист у свиней на більш сучасні, дрейфовані негомологічні штами H1N2 і H3N2, A/Swine/MB/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] і A/Swine/AB/SD0435/ 2019 (H3N2) [SD435].

Вакцина викликала стійку імунну відповідь у сироватці крові та легенях і зменшила реплікацію вірусу, а також патологію легень, пов’язану з цими штамами. Таким чином, ця двовалентна вакцина залишається сильним кандидатом, який буде корисним для ринку вакцин проти свинячого грипу в Північній Америці.

Ключові слова:

грип; вакцина; свинячий.

1. Введення

Віруси грипу А (IAV) є значним патогеном для багатьох видів, включаючи свиней. Інфекція може викликати висококонтагіозне респіраторне захворювання свиней [1]. Інфекція грипу у свиней протікає в легкій формі з дуже низькою смертністю, але рівень захворюваності в стаді може досягати 100 відсотків [2]. Це призводить до економічних втрат для фермерів через зниження приросту ваги у інфікованих свиней, зниження продуктивності та репродуктивної недостатності у свиноматок [3,4].

Коінфекція грипу з іншими збудниками респіраторних шляхів свиней також може призвести до розвитку комплексу респіраторних захворювань свиней і, як наслідок, підвищення смертності та економічних втрат [5].
Крім того, свині сприйнятливі до інфікування IAV птахів і людини, а також IAV свиней (swIAV) через наявність у їхніх дихальних шляхах галактозних зв’язків сіалової кислоти як птахів, так і ссавців [6]. Це робить можливим перегрупування при коінфікуванні кількома штамами, що може призвести до виробництва нових штамів з пандемічним потенціалом [4,7].

Оскільки у людей подібний розподіл зв’язків сіалової кислоти та галактози в дихальних шляхах, між людьми та свинями можливі двонаправлені випадки поширення. Перший відомий випадок цього стався під час пандемії грипу 1918 року, коли IAV був введений свиням від людей [8]. Ця лінія залишалася стабільною в популяціях свиней до 1990-х років, коли людські та пташині штами H3N2 реасортувалися з циркулюючою лінією H1N1, щоб отримати подвійні та потрійні реассортантні штами підтипів H1N1, H1N2 і H3N2 [8,9].

Нещодавно розроблена касета потрійного реассортантного гена (TRIG) призвела до періоду швидкої диверсифікації IAV у північноамериканських свиней [10]. Ця касета TRIG є дуже стабільною та полегшує заміну різних комбінацій HA та NA [5]. З 2005 року багато штамів із цією внутрішньою касетою TRIG, поєднаною з людськими генами HA та NA, поширилися серед свиней у США [9].

Наступна помітна подія відбулася в 2009 році, коли штам H1N1 свинячого походження (H1N1pdm2009) поширився на людей, що призвело до пандемії грипу 2009 року [11]. Передача від людини до свині (зворотний зооноз) пандемічного IAV людини H1N1 (H1pdm) була зареєстрована кілька разів у північноамериканських свиней, що призвело до встановлення нової лінії та нових реассортантних swIAV [8,10,12].

Загалом у північноамериканських свиней було зареєстровано сім антигенно відмінних клад H1 і чотири різних клади H3 вірусів [5]. Нещодавно програма епіднагляду swIAV в Азії ідентифікувала переважаючий євразійський птахоподібний (EA) реассортантний вірус генотипу 4 (G4) з генами H1pdm і потрійним реассортантом.

Цей вірус G4 був виявлений у 10,4 відсотка протестованих свинарських працівників, і він представляє маркери пандемічного потенціалу, здатність передаватися людям і відрізняється антигенністю від вірусів людини, що зараз циркулюють [7]. Тому дуже важливо запобігати та контролювати інфекцію грипу у свиней як з точки зору свинарства, так і з точки зору охорони здоров’я, і головним способом зробити це є вакцинація [4].

У США найпоширенішим типом вакцини є цілий інактивований вірус (WIV), але також була схвалена РНК-векторна вакцина, що експресує HA, і NS1-усічена жива атенуйована вакцина проти вірусу грипу (LAIV) [4] . Підтипи IAV, найбільш поширені у свиней у всьому світі, включаючи Північну Америку, це H1N1, H1N2 і H3N2 [13].

Однак генетичне різноманіття цих вірусів може значно відрізнятися залежно від регіону, і існують відмінності в генетичній еволюції swIAV у Канаді та США, зокрема у вірусах підтипу H1 [12]. Спостереження в Канаді між 2009 і 2016 роками показало, що генетичні клади H1, які домінували в США, H1g (1A.3.3.3) і H1d-1 (1B.2.2), не були виявлені в Канаді, а Віруси H1 у Канаді сильно відрізнялися від вірусів у США [12].

У Канаді було виявлено нову кладу H1 (H1a-3), яка почалася в Манітобі та зазнала швидкого зростання, перш ніж поширитися по країні та в США. Що стосується вірусів H3, шість ліній H3 були задокументовані в американських свиней (IV-A до IV-F), і три з них були знайдені у канадських свиней (IV-B, IV-C і IV-E) [12]. ].

Це підкреслює важливість регіонального нагляду та обізнаності про циркулюючі штами для інформування про ефективні програми вакцинації та вказує на те, що вакцини, розроблені на основі IAV, які циркулюють серед американських свиней, можуть не захистити канадських свиней [12].

Раніше була створена двовалентна вакцина з використанням двох канадських ізолятів swIAV, A/Swine/Alberta/SD0191/2016 (H1N2) [SD191] і A/Swine/Saskatchewan/SD0069/2015 (H3N2), які є представниками H{{ 9}} антигенної групи та нової антигенної групи H3 із Західної Канади (свинячий кластер IV-E), відповідно [14]. Ця нова вакцина є живою аттенуйованою вірусною вакциною, виготовленою з використанням залежних від еластази форм SD191 і SD69, SD191−R342V і SD69-K345V. Дослідження показали, що він захищає як від SD191, так і від SD69, а також від гетерологічного штаму H1N2 A/Swine/Saskatchewan/SD0142/2015 (H1N2), який також був виділений із Західної Канади [14].

Відтоді циркулюючі штами swIAV продовжували дрейфувати. Більш пізні клінічні ізоляти від свиней у Західній Канаді були зібрані та виділені з польових зразків у Західному коледжі ветеринарної медицини Університету Саскачевану, Саскатун, Словаччина, Канада. A/Swine/MB/SD0467/ 2019 (H1N2) [SD467] є членом антигенної групи H -3, але має п’ять амінокислотних замін із 54 ключових антигенних сайтів H1 порівняно з SD191 [10,15, 16].

A/Swine/AB/ SD0435/2019 (H3N2) [SD435] є членом кластера IV-E, але змінився, щоб включити дві амінокислотні заміни з шести ключових антигенних сайтів H3 [17].

У цьому дослідженні ми оцінили, чи зможе двовалентний еластазозалежний LAIV протистояти новим клінічним ізолятам, і ми можемо повідомити, що він захищав свиней при зараженні циркулюючими зараз штамами swIAV SD467 (H1N2) і SD435 (H3N2).

2. Матеріали та методи

2.1. Клітини та віруси

Клітини собачої нирки Мадіна-Дарбі (MDCK) (ATCC, #CRL-2936) зберігали в мінімальному есенціальному середовищі (MEM) (Sigma-Aldrich, M4655, Сент-Луїс, Міссурі, США), що містило 10 відсотків фетальної бичачої сироватки (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Оттава, Онтаріо, Канада 16000-044) і зберігалися у зволоженому 5-відсотковому інкубаторі CO2 при 37 ◦C. A/Swine/Alberta/SD0435/2019 (H3N2) [SD435] і A/Swine/Manitoba/SD0467/2019 (H1N2) [SD467] swIAV були виділені з польових зразків у Західному коледжі ветеринарної медицини Університету Саскачевану, Саскатун , SK, Канада.

Вакцинальні віруси SD191−R342V і SD69- K345V були врятовані, як описано раніше [14]. Усі віруси вирощували в клітинах MDCK у присутності 0.2% бичачого сироваткового альбуміну (BSA) (Sigma-Aldrich, A7030) з 1 мкг/мл L-[(толуол{ {11}}сульфонамід)-2-феніл] етилхлорметилкетон (TPCK)-трипсин (віруси WT) або 0,5 мкг/мл еластази нейтрофілів людини (еластазозалежні віруси) (Sigma-Aldrich, E8140).
2.2. Дизайн випробувань на тваринах

Двадцять чотири чотиритижневі swIAV-негативні свині були отримані з Prairie Swine Center Inc. (Саскатун, SK, Канада). Ці свині були відібрані випадковим чином і розділені на чотири групи по сім свиней на вакциновану групу та п’ять свиней на пробну вакциновану групу.

Призначення групи описано на малюнку 1A. Ці групи розміщували в окремих кімнатах на основі груп вакцинації (групи A плюс B і C плюс D містили разом) і давали акліматизуватися протягом семи днів до зараження.

У віці п’яти тижнів (день 0), а також у віці восьми тижнів (день 21) свиням у групах A та B інтратрахеально вводили 4 мл MEM, тоді як групам C та D вакцинували з бівалентною вакциною, що містить 1 × 106 PFU кожного SD191−R342V та SD69-K345V у 4 мл MEM. Десять днів пізніше (31-й день) свиней заражали або MEM (макет), або 1 × 106 PFU або SD435-WT (H3N2), або SD467-WT (H1N2).

За свинями спостерігали протягом п’яти днів після зараження, щодня вимірювали ректальну температуру та брали мазки з обох ніздрів на 1, 3 та 5 день. Сироватку крові збирали після першої (20-й день) та другої (30-й день) вакцинацій для аналіз сироваткової віруснейтралізації (SVN) та імуноферментний аналіз (ELISA).

На 5-й день після зараження всіх свиней піддали гуманній евтаназії, а легені вилучили та оцінили на наявність характерних для swIAV грубих уражень. Зразки легеневої тканини також були зібрані для виділення вірусу (рис. 1B).

2.3. Заява про етику

Усі процедури з тваринами були схвалені Університетським комітетом з догляду за тваринами (UACC) і Радою з етики досліджень тварин (AREB) Університету Саскачевану. Цей протокол було затверджено 12 листопада 2021 року (Протокол про використання тварин № 20190064). Усі процедури були виконані відповідно до стандартів, які вимагаються Канадською радою з догляду за тваринами (CCAC) в Організації вакцин та інфекційних захворювань (VIDO), Університет Саскачевану, Саскатун, Словаччина, Канада.

2.4. Відбір проб

Назальні мазки з кожної ніздрі поміщали в 1 мл MEM, що містить 1× антибіотик проти грибків (Thermo Fisher Scientific, Оттава, Онтаріо, Канада, 15240-062) і заморожували при –80 ◦C до виконання qRT-PCR. Усіх свиней піддавали гуманній евтаназії шляхом внутрішньовенного введення етанолу (240 мг/мл пентобарбіталу натрію; 2 мл на 4,5 кг). Після евтаназії легені були повністю видалені, щоб визначити як відсоток фіолетово-червоних твердих уражень, так і пневмонію.

Відсотки визначали на основі ваги часток легенів, а також усього об’єму легень [18]. Зразки легень також були взяті з правої верхівки, серця та діафрагми для титрування вірусу. Ці зразки легенів змішували в рівних об’ємах 10% мас./об. MEM, що містило 1× антибіотик-антимікотик для титрування.

Рисунок 1. Групування свиней і дизайн дослідження для оцінки захисної ефективності двовалентного LAIV проти нових клінічних ізолятів. Свиням (n=5 для груп MEM/MEM та n=7 для двовалентних/двовалентних груп) інтратрахеально вакцинували 4 мл MEM або бівалентної вакцини, що складається з 1 × 106 PFU. кожного SD191−R342V і SD69-K345V у дні 0 і 21. На 31 день свиням інтратрахеально заражали MEM або 1 × 106 PFU або SD435 (H3N2), або SD467 (H1N2). (А)

Графік імунізації, зараження та взяття проб для цього випробування на тваринах. Двадцяти чотирьом чотиритижневим свиням, негативним на swIAV, дозволили акліматизуватися протягом семи днів перед зараженням. У віці п’яти тижнів (день 0), а також у віці восьми тижнів (день 21) свиней у групах А та В інтратрахеально вакцинували 4 мл MEM, тоді як групи С і D були вакциновані з двовалентною вакциною, що містить 1 × 106 PFU кожного SD191−R342V та SD69-K345V у 4 мл MEM.

Десять днів пізніше (31-й день) свиней заражали або MEM (імітація), або 1 × 106 PFU або SD435-WT (H3N2), або SD467-WT (H1N2). За свинями спостерігали протягом п’яти днів після зараження, щодня вимірювали ректальну температуру та брали мазки з обох ніздрів на 1, 3 і 5 день. Сироватку крові збирали після першої (20-й день) і другої (30-й день) вакцинацій. На 5-й день після зараження (36-й день) усіх свиней піддали гуманній евтаназії, а легені вилучили для оцінки. (B) Створено за допомогою BioRender.com.

2.5. Імуноферментний аналіз (ELISA)

Щоб отримати покривні антигени, SD435 і SD467 розмножували в клітинах MDCK і очищали за допомогою ультрацентрифугування в градієнті сахарози. Інактивація вірусів відбувалася шляхом додавання до вірусу 97% -пропіолактону в концентрації 1:1000 (об./об.) (Thermo Fisher Scientific, AAB2319703). Цю суміш струшували при 4 ◦C протягом ночі, інкубували при 37 ◦C протягом двох годин, щоб полегшити гідроліз -пропіолактону, потім зберігали при -80 ◦C до використання.

Для вимірювання рівнів swIAV-специфічного IgG, викликаного вакцинацією та контрольним зараженням, сироватку свині відбирали після першої (20-й день) і другої (30-й день) вакцинацій і перед розтином трупа (36-й день).

Очищені -пропіолактон-інактивовані віруси SD435 (1 мкг/мл) і SD467 (2 мкг/мл), розведені в карбонатному/бікарбонатному буфері для покриття (pH 9,6), наносили на планшети з лунками Immulon-2 96- при 1{{ 12}}0 мкл/лунку (Thermo Labsystems, Ottawa, ON, Canada, 3655) та інкубували протягом ночі при 4 ◦C. Після інкубації протягом ночі планшети з покриттям чотири рази промивали TBST (0.1 М Tris, 0,17 M NaCl і 0,05% Tween 20), до яких додавали чотирикратні серійні розведення сироватки або BALF. чашку в двох примірниках з подальшою двогодинною інкубацією при кімнатній температурі. Сироватку додавали у початковому розведенні 1:10, а BALF додавали нерозведеною.

Зразки попередньо визначених позитивних контрольних сироваток і відповідних негативних контролів, сироватки та ЖБАЛ від невакцинованих свиней у попередньому дослідженні проводили на кожній чашці [14]. Планшети промивали чотири рази TBST, після чого козячими анти-свинячими IgG (H плюс L), міченими фосфатазою афінно очищеними антитілами (1:5000) (Sigma Aldrich, SAB3700435) або мишачими анти-свинячими IgA (Serotec, MCA658) ( 1:300), розведений у TBST, додавали та залишали для інкубації при кімнатній температурі протягом однієї години.

IgA ELISA були розроблені шляхом додавання біотинільованих козячих антитіл до мишачих IgG (H плюс L) (CALTAG, Burlingame, CA, США, M30015) і розчину стрептавідин лужної фосфатази (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) протягом однієї години при кімнатній температурі. Після інкубації планшети з IgG та IgA чотири рази промивали TBST, до якого додавали субстрат п-нітрофенілфосфату (PNPP) [10 мг/мл кристалічної солі ді(трис) р-нітрофенілфосфату (Sigma-Aldrich), 1% діетаноламін ( Sigma-Aldrich), додавали 0,5 мг/мл MgCl2 і pH 9,8] (1 мг/мл) та інкубували при кімнатній температурі протягом двох годин.

Реакцію зупиняли додаванням 0,3 М етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA), і пластини зчитували на спектрофотометрі при 405 нм із еталоном 490 нм. Титр зразка визначався як найвище розведення, при якому ОП цього зразка була вищою за визначену межу (середнє ОП відомого негативного зразка плюс подвійне стандартне відхилення).

2.6. Аналіз нейтралізації вірусу (VN).

Клітини MDCK (3,5 × 104) поміщали в 96-лункові планшети. Сироватку та ЖБАЛ інактивували нагріванням при 56 ◦C протягом 30 хв. Двократні розведення сироватки та BALF додавали до планшета в чотирьох повторах, і 60 мкл розведеної сироватки або BALF інкубували з рівним об’ємом SD435 або SD456, що містить 100 TCID50, при 37 ◦C протягом 1 години.

Потім 100 мкл суміші додавали до клітин MDCK і цитопатогенний ефект (CPE) документували через 48 годин і 72 години після інфікування (pi). Титр нейтралізуючих антитіл був найвищим розведенням кожного зразка сироватки, яке повністю захищало клітини від CPE принаймні у 2 з 4 лунок.

2.7. Визначення вірусу

Після збору зразки легень негайно поміщали на лід і заморожували при -80 ◦C до обробки. Для обробки кожну легеневу тканину зважували та додавали 10-відсоткову (масу/об’єм) концентрацію MEM з додаванням 1× антибіотика-антимікотика (Thermo Fisher Scientific, 15240-062). Легеневу тканину гомогенізували в TissueLyser II (Qiagen, Hilden, Німеччина) при 30 Гц протягом 5 хвилин з подальшим центрифугуванням при 5000 × g протягом 10 хвилин при 4 ◦C. Гомогенізований супернатант збирали та зберігали при -80 ◦C до подальшого аналізу.

Назальні тампони перемішували протягом 15 секунд і центрифугували при 1600 × g протягом 25 хвилин при 4 ◦C. Супернатанти збирали та зберігали при -80 ◦C до подальшого аналізу. Вірусні титри визначали за допомогою аналізу TCID50 для легенів і кількісної RT-PCR для мазків з носа.

2.8. Екстракція РНК і кількісна RT-PCR (qRT-PCR)
Для визначення рівнів вірусної РНК SD467 і SD435 у мазках з носа після зараження було проведено ПЛР-ПЛР. Стандартна крива була зроблена з використанням РНК, екстрагованої з SD435 і SD467 з відомим титром. Коротко кажучи, міні-набір RNeasy Plus (Qiagen, Торонто, Онтаріо, Канада, 74136) використовувався для екстракції vRNA з 200 мкл рідини для промивання носа.

РНК перетворювали на кДНК за допомогою універсального праймера грипу Uni12 і SuperScript III Transcriptase (Invitrogen, Burlington, ON, Canada) [19]. КПЦР проводили в трьох повторах на системі ПЛР у реальному часі StepOnePlusTM (Applied Biosystems, Каліфорнія, США) з Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems), 5 мкл кДНК і 1 мкл 10 мкМ прямого та зворотного праймерів. Реакції ПЛР проводили при температурі відпалу 58 ◦C протягом 40 циклів. Усі послідовності праймерів qPCR доступні за запитом.

2.9. Статистичний аналіз

Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8. Використовували непараметричні критерії Манна-Уітні та Краскела-Уолліса. Достовірні відмінності позначені * (p < 0.05), ** (p < 0.01), *** (p < 0,001) або **** (p < 0,0001). ns=незначний.

For more information:1950477648nn@gmail.com