Неструктурний білок 4B вірусу Зіка взаємодіє з DHCR7, щоб полегшити вірусну інфекцію

АНОТАЦІЯ

Вірус Зіка (ZIKV) виробляє неструктурні білки, щоб уникнути імунної відповіді та забезпечити ефективну реплікацію в клітинах-господарях. Нещодавно повідомлялося, що метаболічний фермент холестерину 7-дегідрохолестерин-редуктаза (DHCR7) впливає на вроджену імунну відповідь при інфекції ZIKV. Однак життєво важливий неструктурний білок і механізми, задіяні в DHCR7-опосередкованому уникненні вірусу, недостатньо з’ясовані. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що інфекція ZIKV полегшує експресію DHCR7. Примітно, що посилений DHCR7, у свою чергу, сприяв зараженню ZIKV, а блокування DHCR7 пригнічувало інфекцію ZIKV. Механічно неструктурний білок 4B (NS4B) ZIKV взаємодіяв з DHCR7, щоб індукувати експресію DHCR7. Крім того, DHCR7 інгібував TANK-зв’язуючу кіназу 1 (TBK1) і фосфорилювання регуляторного фактора інтерферону 3 (IRF3), що призводило до зниження вироблення бета-інтерферону (IFN-) та інтерферон-стимульованих генів (ISG). Таким чином, ми припускаємо, що ZIKV NS4B зв’язується з DHCR7 для пригнічення активації TBK1 та IRF3, що, у свою чергу, пригнічує IFN- та ISG, тим самим полегшуючи ухилення від ZIKV. Це дослідження розширює уявлення про те, як вірусні неструктурні білки протидіють вродженому імунітету, щоб полегшити вірусну інфекцію через метаболічні ферменти холестерину та проміжні продукти.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

1. Введення

Вірус Зіка (ZIKV) як флавівірус, що передається комарами, був спочатку ідентифікований у макаки-резус в Уганді в 1947 році. Зазнавши кількох спалахів у всьому світі, епідемія ZIKV стала загальною глобальною загрозою для здоров’я через вибухове поширення москітними шляхами, подорожі по всьому світу безсимптомні переносники та передача статевим шляхом. Більшість інфекцій ZIKV під час минулих епідемій були безсимптомними або легкими (Wang et al., 2016), однак під час кількох останніх епідемій інфекція ZIKV призвела до руйнівних захворювань, включаючи неврологічні наслідки під час вагітності (мікроцефалія та загибель плода) і неврологічні розлади (синдром Гійєна-Барре) у дорослих (Cao-Lormeau et al., 2016; Pierson and Diamond, 2020; Rasmussen et al., 2016). Вроджена імунна система є першою та критичною лінією імунного захисту господаря від вірусної інфекції. Після інфікування ZIKV РНК вірусу розпізнавалася внутрішньоклітинним геном I, індукованим ретиноєвою кислотою (RIG-I) (Chazal та ін., 2018; Hertzog та ін., 2018; Kato та ін., 2006), який ініціював подальший вроджений імунітет. відповіді, включаючи активацію TANK-зв’язуючої кінази 1 (TBK1), фосфорилювання регуляторного фактора інтерферону 3 (IRF3), а потім призводить до виробництва інтерферонів I типу (IFN-I) (Fitzgerald та ін., 2003; Grant та ін., 2016; Xia et al., 2018) і експресія десятків інтерферон-стимульованих генів (ISG) з різними противірусними ефектами (Savidis et al., 2016; Schneider et al., 2014). Імунна система хазяїна виробляє IFN та ISG для обмеження вірусної інфекції, однак сам ZIKV розробив різноманітні механізми виходу для забезпечення успішного виживання та реплікації в клітині хазяїна, наприклад кодування специфічних неструктурних (NS) білків. Геномна РНК ZIKV генерує сім неструктурних білків, включаючи NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B і NS5 (Berthoux, 2020). ZIKV NS1 рекрутує деубіквітіназу USP8 господаря для стабілізації каспази-1 та послаблює передачу сигналів ІФН типу I для сприяння інфекції ZIKV (Zheng et al., 2018). Повідомлялося, що мутантний NS1 зв’язується з TBK1 і знижує фосфорилювання TBK1, що призводить до зниження виробництва IFN (Xia et al., 2018). ZIKV NS3 зв’язується з людськими каркасними білками (14-3-3ε і 14-3-3η) і секвеструє їх (Riedl та ін., 2019), тоді як NS4A взаємодіє з MAVS, щоб послабити RIG-I- і MDA{{50} }опосередковані вроджені імунні відповіді (Ma et al., 2018). Зокрема, ZIKV NS5 зв’язує та руйнує перетворювач сигналу та активатор транскрипції 2 (STAT2), щоб послабити передачу сигналів IFN типу I (Grant та ін., 2016; Kumar та ін., 2016). Крім того, було доведено, що NS5 взаємодіє з RIG-I і пригнічує K63-пов’язане поліубіквітування RIG-I, тим самим пригнічуючи продукцію IFN (Li et al., 2020). Крім того, було продемонстровано, що ZIKV NS2A, NS2B, NS4A та NS4B перевищують вироблення IFN, націлюючись на дискретні елементи шляху RIG-I (Xia et al., 2018). Для досягнення ефективної реплікації в клітинах ссавців ZIKV також покладається на ліпідні метаболічні компоненти клітини хазяїна для формування оболонки та повної збірки вірусних частинок (Chen та ін., 2020; Леєр та ін., 2020). Холестерин є одним із ліпідних компонентів клітинних мембран і бере участь у багатьох біологічних функціях (Ikonen, 2008). Клітинний гомеостаз холестерину тісно модулюється синтезом холестерину, включаючи поглинання з частинок ліпопротеїнів і виділення до позаклітинних акцепторів. Практично всі клітини ссавців залежать від метаболізму холестерину (Luo et al., 2020). Накопичення доказів вказує на те, що метаболізм холестерину бере участь у вродженій імунній відповіді проти вірусної інфекції (Blanc та ін., 2013; Petersen та ін., 2014; York та ін., 2015). Після вірусної інфекції синтез холестерину помітно змінювався і супроводжувався посиленням експресії IFN-I та ISG у макрофагах (Li та ін., 2017; Liu та ін., 2008; York та ін., 2015). Будучи ключовим ферментом у метаболізмі холестерину, холестерол-25-гідроксилаза (CH25H) перетворює холестерин у 25-гідроксихолестерин (25HC), який був ідентифікований як біологічний продукт, який сприяє вродженій імунній відповіді проти переважної більшості вірусів, включаючи вірус імунодефіциту людини 1 (ВІЛ-1), вірус везикулярного стоматиту (VSV), вірус простого герпесу 1 (ВПГ-1), вірус Ебола (EBOV), ZIKV, вірус гамма-герпесу мишей ( MHV68), вірус лихоманки долини Рифт (RVFV) і вірус російського весняно-літнього енцефаліту (RSSEV) (Blanc et al., 2013; Li et al., 2017; Liu et al., 2013). Поточні дослідження обмежені у дослідженні того, як продукти метаболізму холестерину (наприклад, 25HC) можуть маніпулювати передачею сигналу та брати участь у вродженому імунітеті. На сьогоднішній день ферменти або проміжні продукти біосинтезу холестерину ще недостатньо вивчені. Будучи життєво важливим метаболічним ферментом холестерину, 7-дегідрохолестеролредуктаза (DHCR7) може стерти подвійний зв’язок С (7–8) у В-кільці стеролів і каталізувати холестерин із 7-дегідрохолестерину ({{100} }DHC) (Luu et al., 2015). 7-DHC також є попередником вітаміну D, і мутації DHCR7 пов’язані з більш високим вмістом вітаміну D, що свідчить про складні біологічні ефекти DHCR7 у перетворенні холестерину та вітаміну D (Kuan та ін., 2013; Прабху та ін. , 2016a). Добре представлене дослідження показало, що мовчання DHCR7 може активувати шлях PI3K-AKT3, що призводить до фосфорилювання IRF3 Ser385 і сприяє виробленню IFN для інгібування множинної вірусної інфекції in vitro та in vivo (Xiao et al., 2020). Однак розуміння метаболізму холестерину, опосередкованого DHCR7-, у опосередкованому протеїном ZIKV NS імунному ухиленні є погано визначеним. Тут ми пояснюємо чіткий механізм, який ZIKV NS4B націлює на DHCR7, ключовий фермент у синтезі холестерину, щоб послабити відповідь IFN-I та полегшити інфекцію ZIKV. Ми виявили, що інфекція ZIKV збільшила експресію DHCR7. Цікаво, що посилений DHCR7 сприяє зараженню ZIKV, тоді як знищення або націлювання на DHCR7 інгібіторами може пригнічувати інфекцію ZIKV. Крім того, ZIKV NS4B міг зв’язувати DHCR7 і, таким чином, індукувати експресію DHCR7, яка пригнічувала активацію TBK1 та IRF3 і призводила до зниження виробництва IFN- та ISG. Таким чином, ми припускаємо, що зв’язування ZIKV NS4B з DHCR7 зменшує активацію IRF3, яка, у свою чергу, пригнічує IFN- та ISG для полегшення ухилення від ZIKV. Це дослідження розширює нові погляди на те, як неструктурний білок ZIKV скасовує вроджений імунітет, щоб полегшити вірусну інфекцію через взаємодію з метаболічними ферментами холестерину.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Матеріали та методи

2.1. Клітинні лінії

Клітини U251 були придбані в Китайському центрі колекції типових культур (CCTCC) (Ухань, Китай). Клітини нирки Cercopithecus aethiops (Vero), клітини ембріональної нирки людини (HEK 293T) і клітини аденокарциноми легенів людини (A549) були придбані в Американській колекції культур тканин (ATCC). Клітини витримували в модифікованому середовищі Ігла за Дульбекко (DMEM) (Gibco) з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (FBS) (Gibco), пеніциліну (100 ОД/мл) і стрептоміцину сульфату (100 мкг/мл) при 37°C і 5°C. % CO2. Клітини Aedes albopictus (C6/36) культивували в мінімально необхідному середовищі (MEM), доповненому 10% FBS, пеніциліном (100 ОД/мл) і стрептоміцину сульфатом (100 мкг/мл) при 28°C з 5% CO2.

2.2. Ампліфікація, титрування та інфекція ZIKV

Ізолят ZIKV z16006 (номер доступу GenBank, KU955589.1) культивували в клітинах C6/36, і ZIKV ділили на аліквоти у флакони для заморожування та зберігали при 80°C. Титри ZIKV вимірювали за допомогою аналізу нальоту. Клітини інфікували ZIKV при вказаній множинності інфекції (MOI) протягом 2 годин, після чого промивали фосфатно-сольовим буферним розчином (PBS), а потім культивували, збирали та досліджували.

2.3. Плазміди та реактиви

Експресійну плазміду pcDNA3.1(þ)-3 Flag використовували для клонування окремих генів ZIKV з відповідних фрагментів кДНК ZIKV. Щоб сконструювати pGEX6p-1-NS4B, ZIKV NS4B було субклоновано у вектор pGEX6p-1 за допомогою набору для одноетапного клонування ClonExpress II (Vazyme Biotech, Нанкін, Китай). КДНК, що кодують DHCR7, RIG-I, TBK1 та IRF3 людини, клоновані у вектор pCAGGS-HA або вектор pcDNA3.1 (þ)-3 Flag, були сконструйовані стандартним методом молекулярного клонування. Місенс-мутація G410S DHCR7 була сконструйована за допомогою методу сайт-сайт-спрямованого мутагенезу. Моноклональний кролячий анти-ZIKV конверт (GTX133314) був придбаний у GeneTex (Ірвайн, Каліфорнія, США). Кролячі поліклональні анти-DHCR7 (A8049), кролячі моноклональні анти-ISG15 (A2416), кролячі моноклональні анти-TBK1 (A3458), кролячі моноклональні анти-P-TBK1 на Ser172 (AP1026), кролячі поліклональні анти-IRF3 (A11118), анти -кролячий IgG (ac005) і антимишачий IgG (ac011) були придбані в ABclonal Technology (Вухань, Китай). Вторинні антитіла проти мишачого FITC і проти кролика Cy3 були придбані в Abbkine (Ухань, Китай). Кролячі моноклональні анти-P-IRF3 на Ser396 (29047S) і кролячі моноклональні анти-ISG56 (14769S) були придбані в Cell Signaling Technology (CST, Бостон, Массачусетс, США). Мишачий моноклональний анти-Flag (F3165), кролячий моноклональний анти-HA (H6908) і мишачий моноклональний анти-GAPDH (G9295) були придбані у Sigma (Сент-Луїс, Міссурі, США). Мишачі моноклональні антиген-антитіла проти флавівірусної групи (MAB10216) були придбані у Millipore (Массачусетс, США). Ліпофектамін 2000 (11668-027) і Тризол (15596018) були придбані в Invitrogen Corporation (Карлсбад, Каліфорнія, США). Poly(I:C) було придбано в InvivoGen (Сан-Дієго, Каліфорнія, США).

2.4. Аналіз зубного нальоту

Супернатант, що містить ZIKV, розбавляли DMEM, що не містить сироватки, і інфікували клітини Vero в 12-лунковому планшеті протягом 2 годин, після чого двічі промивали 1 мл PBS. DMEM, що містить 2% FBS і 2% агарози з низькою температурою плавлення, добре перемішували відповідно до об’ємного співвідношення 1:1 і додавали 1 мл суміші в кожну лунку. Інфіковані клітини культивували при 37 °C з 5% CO2 протягом 5–7 днів. Клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 1 год і фарбували 0.5% кристалічним фіолетовим протягом 30 хв. Планшет із 12-лунками промивали водою та підраховували бляшки.

2.5. Продукція та інфекція лентивірусу

Цільові послідовності shRNA для DHCR7 людини були такими: sh-DHCR7-1: 50 -ATTGCCAGCACAGACGGATTT-30, sh-DHCR7-2: 50 -CGTGATTGACTTCTTCTGGAA{ {8}}. Вектор pLKO.1, що несе зашифровану shRNA для негативного контролю (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі, США), або специфічну цільову послідовність трансфікували в клітини HEK293T разом з psPAX2 і pMD2.G ліпофектаміном 2{{19} }00. Вірусні частинки, що містять супернатанти, збирали через 36 годин після трансфекції, а потім центрифугували при 210 g протягом 10 хвилин. Безклітинну супернатантну фазу фільтрували через фільтр 0,45 мкм для видалення залишків клітин. Клітини U251 інфікували лентивірусними частинками в присутності 8 мкг/мл полібрену. Через 48 годин культивування клітини U251 відбирали з пуроміцином (2 мкг/мл, Sigma). Ефективність нокдауну sh-DHCR7 визначали за допомогою RT-PCR та вестерн-блот-аналізу.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

2.6. Вестерн-блот

Клітини лізували буфером RIPA, доповненим інгібіторами протеази та інгібіторами фосфатази, на льоду протягом 1 години, потім центрифугували при 4°C, 13,000 g протягом 1{{10}} хвилин, щоб зібрати клітини лізат. Концентрацію білка в клітинному лізаті вимірювали за допомогою аналізу білка біцинхонінової кислоти (BCA). Білок відокремлювали за допомогою SDS-PAGE і потім переносили на мембрану з полівінілдифториду (PVDF). Мембрану PVDF блокували буфером для імуноблотингу TBST (10 ммоль/л трис-HCl, pH 7,4, 0,15 моль/л NaCl і 0,05% Tween-20), що містив 5% BSA, протягом 1 години. Після промивання TBST мембрану інкубували з первинними антитілами та вторинними антитілами, а потім виявляли за допомогою хемілюмінесцентної системи візуалізації (Bio-Rad).

2.7. Аналіз загального холестерину

Загальний холестерин у клітинах виявляли за допомогою набору для аналізу загального холестерину в тканинах від Applygen Technologies Inc. (Пекін, Китай). Стандарт холестерину 5 ммоль/л піддавали послідовному розведенню безводним етанолом, щоб побудувати стандартну криву, і кількість загального холестерину в клітинах розраховували відповідно до стандартних кривих. Експеримент проводився відповідно до процедури, наданої виробником.

2.8. Коімунопреципітаційні аналізи

Клітини HEK293T трансфікували зазначеними плазмідами. Клітини збирали та лізували буфером для лізису RIPA, доповненим інгібіторами протеази. Після центрифугування при 18,000 g протягом 15 хвилин при 4°C клітинні лізати збирали та імунопреципітували за допомогою Flag-Trap ProteinG Sepharose (GE Healthcare, Мілуокі, Вісконсин, США) протягом 4 годин при 4°C. Зв’язані білки елюювали 2 завантажувальними буферами та аналізували за допомогою імуноблоттингу.

2.9. ПЛР в реальному часі

Загальні РНК екстрагували з клітин за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen Life Technologies), а кДНК отримували за допомогою набору для зворотної транскриптази M-MLV (Promega, Madison, WI, USA). RT-PCR проводили за допомогою наборів SYBR RT-PCR (DBI Bio-science) на Roche LC480. МРНК гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогенази (GAPDH) була встановлена ​​як ендогенна еталонна для нормалізації мРНК, а рівні експресії генів були розраховані за допомогою методу 2 ΔΔCT. Послідовності праймерів RT-PCR показані в додатковій таблиці S1. 2.10. Конфокальна мікроскопія

Клітини U251 трансфікували плазмідою та культивували протягом 3 0 год, потім тричі промивали PBS. Клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 15 хвилин і просочували PBS, що містить 0,1% TritonX-100 протягом 5 хвилин. Після промивання PBS клітини герметизували PBS, що містить 5% BSA, на 30 хв. Клітини тричі промивали PBS та інкубували з анти-НА, анти-FLAG та антифлавівірусом, потім інкубували з вторинними антитілами проти мишачого FITC та антитілами проти кролика Cy3. Клітини фарбували 40,6-діамідіно-2-феніліндол дигідрохлоридом (DAPI) і досліджували за допомогою конфокального мікроскопа Olympus.

2.11. Випадаючі аналізи GST

Плазміду pGEX6p-1-NS4B трансфікували штамом Escherichia coli (E. coli) BL21. GST і GST-NS4B індукували IPTG з кінцевою концентрацією 0,5 ммоль/л, і культури вирощували протягом додаткових 6–8 годин при 37 C. А потім білок GST і GST- Білок NS4B очищали з бактерій E. coli. Білок GST або GST-NS4B інкубували з кульками глутатіон-сефарози (Novagen) і тричі промивали PBS. Білок GST і GST-NS4B інкубували з еукаріотичним білком злиття HA-DHCR7, який походить від плазмід, що кодують HA-DHCR7-експресовані клітинні лізати HEK293T, протягом 4 годин при 4°C. Осади промивали п’ять разів, кип’ятили в 2 SDS завантажувальний буфер і виявлений Вестерн-блоттингом з анти-GST і анти-HA антитілами.

2.12. Сайт-спрямований мутагенез HA-DHCR7

Відповідні пари мутагенних праймерів (додаткова таблиця S1) були синтезовані та використані для створення мутованої конструкції за допомогою ПЛР. HA-DHCR7 використовували як шаблон для преміксу PrimeSTAR® HS (Takara). Після ПЛР плазміду дикого типу, що залишилася в продукті ПЛР, селективно розщеплювали DpnI (New England Biolabs). Розщеплений продукт ПЛР трансфікували штам E. coli DH5. Бажаний мутант був підтверджений аналізом послідовності Сенгера.

цистанхе рослина, що підвищує імунну систему

2.13. Статистичний аналіз

Усі експерименти повторювали принаймні тричі з однаковими результатами. Дані виражені як середнє стандартне відхилення (SD). Значущість мінливості визначали за допомогою двостороннього непарного t-критерію Стьюдента для двогрупового або одностороннього дисперсійного аналізу з використанням тесту множинних порівнянь Даннета або двостороннього дисперсійного аналізу з тестом множинних порівнянь Сідака для порівнянь кількох груп за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism. (версія 8.0.1). Значення P < 0.{{10}}5 вважалося статистично значущим, а P > 0.05 було визначено як статистично незначуще. Для всіх даних значущість була представлена ​​як *P <0,05, **P <0,01 і ***P <0,001.

3. Результати

3.1. Інфекція ZIKV індукує експресію DHCR7

Накопичення доказів продемонструвало, що метаболізм холестерину впливає на вроджену імунну відповідь організму проти флавівірусної інфекції, такої як ZIKV і вірус денге (DENV) (Leier et al., 2020; Randall, 2018). DHCR7 кодує фермент, який перетворює 7-DHC на холестерин, що є останнім етапом біосинтезу холестерину (Moebius et al., 1998). Ми вперше виявили експресію DHCR7 при інфікуванні ZIKV. Астроцит U251 людини був інфікований ZIKV, який залежно від дози збільшував експресію DHCR7 як на мРНК, так і на білку (рис. 1A–C). Щоб підтвердити це явище, ми потім дослідили експресію DHCR7 у клітинах Vero і виявили, що інфекція ZIKV істотно індукувала експресію DHCR7 (рис. 1D–F), що узгоджувалося з результатами в клітинах U251.

Cistanche корисний для зміцнення імунної системи

3.2. Націлювання на DHCR7 викликає критичну активність проти ZIKV

Щоб оцінити вплив DHCR7 на інфекцію ZIKV, клітини U251 і A549 трансфікували плазмідою, що кодує HA-DHCR7, а потім інфікували ZIKV (MOI=1). Результати показали, що надмірна експресія DHCR7 значно посилює експресію мРНК ZIKV (рис. 2A і B). Примітно, що з накопиченням білка DHCR7 експресія структурного білка E ZIKV також була збільшена (рис. 2C і D). Крім того, ми додатково провели аналіз бляшок, використовуючи надосадову рідину з рис. 2C, і виявили, що надмірна експресія DHCR7 значно збільшила одиниці, що утворюють бляшки, порівняно з контрольною групою (рис. 2E і F). Повідомлялося, що міссенс-мутація G410S DHCR7 скасовує активність ферменту (Fitzky et al., 1998; Shim et al., 2004; Witsch-Baumgartner et al., 2000). Для подальшого визначення впливу DHCR7 на інфекцію ZIKV ми сконструювали неактивний мутант DHCR7 (G410S). Порівняно з диким типом DHCR7, мутант G410S міг значно пригнічувати інфекцію ZIKV (рис. 2G). Ми також провели конфокальний мікроскопічний аналіз, щоб підтвердити спостереження. Як показано на рис. 2H, надмірна експресія DHCR7 посилила інфекцію ZIKV. Щоб визначити, чи є ендогенна активність ферменту DHCR7 критичною для інфекції ZIKV, ми розробили дві короткі шпилькові РНК (shDHCR7-1 і sh-DHCR7-2), спеціально націлені на DHCR7, і створили DHCR7-заглушену клітину U251 лінії з системою shRNA (рис. 3A). Нарешті, ми вибрали sh-DHCR7-1 за його вищу ефективність глушіння. Порівняно з клітинною лінією трансдукованої контрольної shRNA, ці нокдаун-клітини DHCR7 показали меншу чутливість до інфекції ZIKV (рис. 3B і C). Потім ми використали селективний інгібітор DHCR7 AY9944, який запобігає 7-перетворенню DHC на холестерин (Xu et al., 2011), який, як було продемонстровано, пригнічує активність ферменту DHCR7 (Horlick, 1966; Moebius et al., 1998). Порівняно з контролем, введення AY9944 залежно від дози пригнічувало інфекцію ZIKV у клітинах U251 (рис. 3D–F). Аналіз бляшок також проводили в клітинах Vero для подальшої оцінки ефектів DHCR7 і показу, що AY9944 може значно пригнічувати інфекцію ZIKV (рис. 3G і H). Примітно, що конфокальна мікроскопія показала, що білок ZIKV E був суттєво знижений у присутності AY9944 (рис. 3I). Ці результати показали, що націлювання на DHCR7 може пригнічувати інфекцію ZIKV.

Рис. 1. Інфекція ZIKV індукує експресію DHCR7. Клітини A–F U251 і Vero були інфіковані ZIKV (MOI ¼ 0, 1 і 2) протягом 24 годин, і рівні внутрішньоклітинної РНК ZIKV (A, D) і DHCR7 (B, E) визначали за допомогою RT-PCR з GAPDH як внутрішній контроль. Відносні рівні білка оболонок DHCR7 і ZIKV були виявлені за допомогою вестерн-блоттингу (C, F). Дані отримані принаймні з трьох незалежних експериментів (середнє SD) або репрезентативні дані (C, F). Статистичну значущість розраховували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу з тестом множинних порівнянь Даннета (A, B, D, E). **P < 0.01, ***P < 0,001. SD, стандартне відхилення.

3.3. DHCR7 пригнічує активацію TBK1 та IRF3, щоб зменшити виробництво IFN- та ISG

Оскільки DHCR7 є життєво важливим ферментом для перетворення 7-DHC на холестерин (Moebius et al., 1998), а інфекція ZIKV може збільшити експресію DHCR7, ми виміряли рівень холестерину під час інфекції ZIKV. Ми виявили, що інфекція ZIKV мало впливає на синтез холестерину в клітинах U251 і Vero (рис. 4A і B), хоча рівень DHCR7 був підвищений (рис. 1A–D). Враховуючи посилення DHCR7 при інфікуванні ZIKV і ключову роль IFN у протистоянні інфекції ZIKV, ми потім визначили вплив DHCR7 на сигнальний шлях IFN-I. Контрольні та клітини U251, що глушать DHCR7-, інфікували ZIKV або трансфікували полі(I:C), і досліджували експресію IFN. Порівняно з контрольною групою, інфекція ZIKV або лікування полі(I:C) помітно посилювало експресію IFN у DHCR7-клітинах U251, що глушили (рис. 4C і D). ISG є ефекторами дії інтерферону та відіграють важливу роль у вродженому імунному захисті від інфекції ZIKV. Ми також продемонстрували, що блокування DHCR7 може значно підсилити експресію ISG15 та ISG56 як на рівні мРНК, так і на рівні білка (рис. 4E–J). Відповідно, лікування інгібітором DHCR7 AY9944 може індукувати експресію IFN-, ISG15 та ISG56 (рис. 4K, L). Важливо те, що неактивний мутант G410S може частково скасувати інгібуючі ефекти DHCR7 на експресію IFN- та ISG (рис. 4M, N). Активація TBK1 та IRF3 є важливою для індукції IFNs-ISG, тому ми далі досліджували вплив DHCR7 на експресію та активацію TBK1 та IRF3. Ми продемонстрували, що DHCR7 не тільки залежно від дози пригнічує рівень білка, але також пригнічує рівень фосфорилювання TBK1 та IRF3 (рис. 5A–C). Крім того, неактивний мутант G410S не повністю скасував інгібуючі ефекти DHCR7 на фосфорилювання IRF3 і TBK1 (рис. 5D). Несумісно з результатами надекспресії DHCR7, лікування AY9944 могло індукувати активацію IRF3 і TBK1 у клітині U251 (рис. 5E).

3.4. ZIKV NS4B взаємодіє з DHCR7, щоб інгібувати фосфорилювання TBK1 та IRF3

Все більше доказів показало, що ZIKV виробив специфічні білки NS для сприяння ефективній реплікації в клітинах-господарях шляхом прямого ухилення від вродженого та адаптивного імунітету хазяїна за допомогою безлічі окремих механізмів. Ми провели ко-ІП-аналіз для виявлення окремого білка ZIKV NS, який міг би взаємодіяти з DHCR7. Клітини HEK293T були спільно трансфіковані pCMV-DHCR7-HA та плазмідою, що експресує індивідуальний білок NS, злитий з Flag-tag. Як показано на рис. 6A, DHCR7 зв’язується лише з NS4B, але не взаємодіє з іншими білками NS. Далі були проведені реципрокні ко-IP аналізи, які показали, що білок NS4B взаємодіє з DHCR7 у клітинах HEK293T (рис. 6B і C). Щоб підтвердити взаємодію NS4B і DHCR7, ми потім провели конфокальний мікроскоп і виявили, що білок NS4B і білок DHCR7 були спільно локалізовані в цитоплазмі (рис. 6D). Випадковий аналіз GST додатково продемонстрував взаємодію NS4B і DHCR7 (рис. 6E). Крім того, тимчасова трансфекція NS4B в клітинах U251 може різко індукувати експресію DHCR7 (рис. 6F). Важливо, що NS4B міг залежно від дози блокувати фосфорилювання як TBK1, так і IRF3, що позитивно корелювало з посиленою активацією TBK1 і IRF3 у відповідь на DHCR7 (рис. 6G і H). Однак надмірна експресія NS4B у клітинах HEK293T значно знизила рівень білка TBK1, але мало вплинула на білок IRF3 (рис. 6G і H). Для подальшого підтвердження цих спостережень NS4B трансфікували в нокдаунні клітини U251 DHCR7 і продемонстрували інгібуючий вплив на ендогенний білок і рівні фосфорилювання TBK1 і IRF3 (рис. 6I). У сукупності ці результати продемонстрували, що ZIKV NS4B взаємодіє з DHCR7 і посилює експресію DHCR7, блокуючи активацію TBK1 і IRF3, а потім сприяючи зараженню ZIKV.

Рис. 2. Надмірна експресія DHCR7 сприяє реплікації ZIKV. Клітини A–D U251 і A549 трансфікували HA-вектором або HA-DHCR7 у зазначених концентраціях протягом 12 годин, а потім інфікували ZIKV ще протягом 36 годин. Рівні РНК ZIKV були виявлені за допомогою RT-PCR з GAPDH як внутрішнім контролем (A, B), а рівні білка оболонки ZIKV, HA-DHCR7 і GAPDH були виявлені за допомогою вестерн-блоттингу (C, D). Клітини E, F Vero інфікували супернатантом, що містить ZIKV, з рис. 2C протягом 48 годин для визначення копій ZIKV за допомогою аналізу бляшок. Клітини G U251 трансфікували HA-вектором, HA-DHCR7 або HA-DHCR7 (G410S) протягом 12 годин та інфікували ZIKV протягом 36 годин, а рівні білка оболонки ZIKV, HA-DHCR7 і GAPDH виявляли Вестерн-блоттингом. Клітини H U251 трансфікували HA-вектором або HA-DHCR7 (1 мкг) протягом 12 годин, інфікували ZIKV протягом 36 годин, а потім інкубували з мишачими анти-флавівірусними та кролячими анти-HA антитілами, після чого фарбували FITC-кон’югованим антимишачим і Cy3-кон’юговані антикролячі вторинні антитіла. Ядра фарбували DAPI. Зображення візуалізували за допомогою конфокальної мікроскопії. Масштаб ¼ 100 мкм. Дані отримані принаймні з трьох незалежних експериментів (середнє SD) або репрезентативні дані (C, D, E, G, H). Статистичну значущість розраховували за допомогою двостороннього непарного t-тесту Стьюдента (F) або одностороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту множинних порівнянь Даннета (A, B). *P <0,05, ***P <0,001. SD, стандартне відхилення.

4. Обговорення

ІФН типу I та їх наступні ISG протистоять великій серії патогенів і відіграють вирішальну роль в імунному захисті господаря від ZIKV (Lazear та ін., 2016). Щоб уникнути опосередкованого IFN спостереження та досягти достатньої реплікації, ZIKV виробляє білки NS, націлені на різні точки сигнального шляху IFN, щоб уникнути вродженої клітинної імунної системи (Lee et al., 2021). Дослідження встановлення показали, що ZIKV NS1, NS3, NS4A та NS5 інгібують окремі модулі шляху RIG-I/IFN-I та сприяють вірусній інфекції за допомогою незалежних та різноманітних механізмів (Grant та ін., 2016; Kumar та ін., 2016). ; Ma та ін., 2018; Riedl та ін., 2019; Xia та ін., 2018; Zheng та ін., 2018). Однак конкретний механізм протидії імунній рестрикції ZIKV NS4B недостатньо визначений. ZIKV NS4B є надзвичайно гідрофобним білком, що складається з 251 амінокислоти та розташований у мембрані ендоплазматичного ретикулуму з N-кінцем (Zou et al., 2014). Інгібування NS4B сигнального шляху IFN-I було виявлено в різних флавівірусах (Ding та ін., 2013; Munoz-Jordan та ін., 2003, 2005; Shan та ін., 2021; Yi та ін., 2016; Zhang та ін., 2021). Нещодавнє дослідження показало, що штам ZIKV INMI1, виділений у Бразилії, використовує NS4B для протидії сигнальному шляху IFN-I, що йде далі, шляхом пригнічення фосфорилювання STAT1 і, як наслідок, переривання ядерного транспорту STAT1 (Fanunza et al., 2021). У цьому дослідженні ми виявили чіткий механізм, у якому ZIKV NS4B скасовує продукцію IFN шляхом пригнічення фосфорилювання TBK1 та IRF3, компонента вище за течією сигнального шляху IFN-I. Примітно, що амінокислотна заміна (G18R) була виявлена ​​в ZIKV NS4B, яка сприяла зниженню продукції IFN і послабленню експресії ISG, і, отже, сприяла вірусній інфекції у мишей, що вказує на значення NS4B як детермінанти патогенезу (Gorman et al. ., 2018). Нові дані вказують на критичну важливість метаболізму холестерину, який бере участь у вродженій імунній відповіді (Akula та ін., 2016; Dang та ін., 2017; Reboldi та ін., 2014; York та ін., 2015). Хоча було підтверджено, що кілька проміжних продуктів у метаболізмі холестерину мають широкий противірусний ефект (Blanc та ін., 2013; Лі та ін., 2017; Лю та ін., 2013; Сяо та ін., 2020), наше дослідження проілюструвало новий механізм що метаболічний фермент холестерину DHCR7 був залучений до інфекції ZIKV шляхом послаблення активації TBK1 та IRF3 для полегшення вірусної інфекції. Будучи ключовим ферментом, який бере участь у метаболізмі десмостеролу та холестерину, DHCR7 являє собою перемикач перетворення 7-DHC на вітамін D у клітинах шкіри, які піддаються впливу УФВ (Prabhu et al., 2016b). Крім того, DHCR7 розташований не тільки на вході шляху Блоха, але також і в кінці шляху Кандуча-Рассела (Prabhu et al., 2016a, 2016b), який відіграє життєво важливу роль у контролі синтезу холестерину. Перехресні перешкоди DHCR7 і його взаємодія з іншими ферментами в декількох шляхах можуть розширити можливості багатьох функцій у різних типах клітин або органах. Попереднє дослідження показало, що блокування DHCR7 може зменшити десмостерол, безпосередній попередник біосинтезу холестерину, забезпечуючи таким чином достатній захист від інфекції ВГС (Luu та ін., 2015; Роджерс та ін., 2012). Важливо, що Xiao et al. показали, що інфекція VSV знижує експресію DHCR7, що призводить до зниження рівня холестерину, але значно більше накопичує 7-DHC у макрофагах і печінці (Xiao et al., 2020). Макрофаги, оброблені 7-DHC, викликали посилену противірусну відповідь; тоді як додавання холестерину показало незначний захист. Інгібітори DHCR7 і введення 7-DHC можуть бути корисними підходами до боротьби з вірусними інфекціями, такими як HIN1, HSV і VSV. У цьому дослідженні ми виявили, що інгібітор DHCR7 AY9944 може пригнічувати інфекцію ZIKV. Однак наше дослідження показало, що інфекція ZIKV індукувала експресію DHCR7, але мало впливала на біосинтез холестерину в гліальних клітинах. Ми не досліджували рівень експресії 7-DHC після інфікування ZIKV, однак варто додатково дослідити, чи мають 7-DHC та AY9944 синергетичну терапевтичну ефективність для лікування пацієнтів, інфікованих ZIKV інфекція в головному мозку. Надмірна експресія DHCR7 сприяла зараженню ZIKV, тоді як лікування селективним інгібітором DHCR7 (AY9944) сильно збільшувало виробництво IFN проти інфекції ZIKV. Активація TBK1 і IRF3 життєво важлива для праймінгу сигналізації IFN-I. Попереднє дослідження показало, що глушіння DHCR7 або лікування 7-DHC активує шлях PI3K-AKT3 для фосфорилювання IRF3, але не TBK1 у макрофагах (Xiao et al., 2020). Тим не менш, наші результати показали, що DHCR7 залежно від дози знижує як експресію IRF3, так і TBK1, а також фосфорилювання IRF3 і TBK1. Ці дослідження показали, що DHCR7 може сприяти зараженню ZIKV у незалежному від метаболізму холестерину механізмі в мозку. Було добре з’ясовано, що ZIKV використовував білки NS для прямої взаємодії з різними компонентами шляху RIG-I/IFN-I, щоб уникнути імунної відповіді та полегшити реплікацію вірусу. Раніше ми повідомляли про взаємодію ZIKV NS5 з RIG-I для послаблення продукції IFN (Li та ін., 2020). Інші продемонстрували, що ZIKV NS1 і NS2B націлені на TBK1, NS3 націлені на RIG-I і MDA5, щоб зменшити продукцію IFN-I та ISG (Lee та ін., 2021; Riedl та ін., 2019). Однак функція білків ZIKV NS, спрямованих на метаболізм холестерину, залишається в основному невловимою. У цьому дослідженні ми також проілюстрували невідому взаємодію між метаболічним ферментом холестерину DHCR7 і білками ZIKV NS. Ми показали, що DHCR7 специфічно зв’язаний з NS4B, а не з іншими білками NS. Ми надали критичні докази того, що ZIKV NS4B взаємодіє з DHCR7 і суттєво індукує його експресію, що узгоджується з результатами в клітинах U251 після інфікування ZIKV. Важливо, що окрім безпосередньої демонстрації взаємодії DHCR7 і ZIKV NS4B, ми також виявили, що ZIKV NS4B посилює експресію DHCR7, щоб інгібувати фосфорилювання TBK1 і IRF3 і полегшити інфекцію ZIKV. Згідно з нашими результатами, нещодавнє дослідження показало, що дефіцит DHCR7 може активувати передачу сигналів IRF3 та IFN для інгібування VSV та інших вірусів у макрофагах.

Рис. 3. Нокдаун DHCR7 зменшує інфекцію ZIKV у клітинах U251. Клітини U251 трансдукували лентивірусними частинками, що містять shRNA проти DHCR7 (shDHCR7-1 і sh-DHCR7-2) або нецільової послідовності (sh-NTC), з подальшим відбором пуроміцину протягом 14 днів. Ефективність нокдауну визначали методом ЗТ-ПЛР. B, C DHCR7-заглушення клітин U251 (sh-DHCR7) і sh-NTC U251 були імітовано інфіковані або інфіковані ZIKV (MOI=1) протягом 36 годин. Рівень внутрішньоклітинної РНК ZIKV був виявлений за допомогою RT-PCR з GAPDH як внутрішнім контролем (B), а рівні білка оболонки ZIKV, DHCR7 і GAPDH були виявлені за допомогою вестерн-блоттингу (C). Клітини D, E U251 обробляли інгібітором DHCR7 AY9944 у вказаній концентрації протягом 2 годин, потім інфікували ZIKV (MOI=1) протягом 48 годин. Клітини піддавали RT-PCR для виявлення РНК ZIKV (D). Рівні білка оболонки ZIKV, DHCR7 і GAPDH були виявлені методом вестерн-блоттингу (E). Клітини F U251 обробляли інгібітором DHCR7 AY9944 у зазначеній концентрації протягом 36 годин, і DHCR7 і GAPDH виявляли Вестерн-блоттингом. Клітини G, H Vero інфікували супернатантом, що містить ZIKV, з рис. 3E протягом 48 годин для визначення копій ZIKV за допомогою аналізу бляшок. Клітини I U251 обробляли AY9944 у вказаній концентрації протягом 2 годин, потім інфікували ZIKV при MOI=1 протягом 36 годин. Зображення візуалізували за допомогою конфокальної мікроскопії. Масштаб ¼ 100 мкм. Дані отримані принаймні з трьох незалежних експериментів (середнє SD) або репрезентативні дані (C, E, F, G та I). Статистична значущість розраховується за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту множинних порівнянь Даннета (A, D, H) або двостороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту множинних порівнянь Сідака (B). ***P <0,001. SD, стандартне відхилення.

Рис. 4. DHCR7 пригнічує продукцію IFN- та ISG. Клітини A, B U251 і Vero інфікували ZIKV (MOI ¼ 0, 0.5 і 1) протягом 24 годин, а клітинний холестерин вимірювали за допомогою набору для аналізу загального холестерину в тканинах. Клітини U251 (sh-DHCR7) і sh-NTC U251, що глушать C–H DHCR7-, інфікували ZIKV (MOI ¼ 1) або обробляли Poly(I:C) (1 мкг/мл) протягом 6 годин. Загальну клітинну РНК екстрагували та піддавали RT-PCR для експресії мРНК з GAPDH як внутрішнім контролем. Відносні експресії IFN- та ISG були нормалізовані до зразків sh-NTC у імітаційній групі, а зміни кратності були показані надмірними. IFN- (C, D), ISG15 (E, F) та ISG56 (G, H). Клітини U251 (sh-DHCR7) і sh-NTC U251, що глушать I, J DHCR7-, інфікували ZIKV (MOI ¼ 1) або трансфікували Poly(I:C) (1 мкг/мл) протягом 24 годин, і рівні білка ISG15, ISG56 і GAPDH були виявлені Вестерн-блоттингом. Клітини K U251 обробляли зазначеною дозою AY9944 протягом 2 годин, потім інфікували ZIKV (MOI=1) протягом 6 годин. Рівень IFN-РНК визначали за допомогою RT-PCR з GAPDH як внутрішнім контролем. Клітини L U251 обробляли зазначеною дозою AY9944 протягом 2 годин, а потім інфікували ZIKV (MOI=1) протягом 24 годин. Рівні білків ISG15, ISG56 і GAPDH були виявлені методом вестерн-блоттингу. Клітини M U251 трансфікували HA-вектором, HA-DHCR7 або HA-DHCR7 (G410S) протягом 24 годин та інфікували ZIKV (MOI=1) протягом 6 годин. Рівні IFN-РНК були виявлені за допомогою RT-PCR з GAPDH як внутрішнім контролем. Клітини N U251 трансфікували HA-вектором, HA-DHCR7 або HA-DHCR7 (G410S) протягом 24 годин, а потім інфікували ZIKV (MOI=1) протягом 24 годин. Рівні білків ISG15, ISG56 і GAPDH були виявлені методом вестерн-блоттингу. Дані отримані принаймні з трьох незалежних експериментів (середнє SD) або репрезентативні дані (I, J, L, N). Статистична значущість розраховується за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту множинних порівнянь Даннета (A, B, K, M) або двостороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту множинних порівнянь Сідака (C–H). ns, P > 0,05, ***P < 0,001. SD, стандартне відхилення.

Рис. 5. DHCR7 інгібує активацію TBK1 та IRF3. A, B клітини HEK293T були спільно трансфіковані плазмідою, що кодує TBK1-, разом із плазмідою, що експресує DHCR7-, або порожнім вектором (A). Клітини HEK293T були спільно трансфіковані плазмідою, що кодує IRF3-, плазмідою, що кодує RIG-I, разом із плазмідою, що експресує DHCR7-, або порожнім вектором (B). Клітини збирали через 24 години після трансфекції та піддавали Вестерн-блоттингу із зазначеними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-PIRF3(S396), анти-HA та анти-GAPDH ]. Клітини C U251 трансфікували зазначеною дозою плазміди, що експресує DHCR7, або порожнього вектора протягом 24 годин. Потім клітини інфікували ZIKV (MOI ¼ 1), зібраним через 6 годин після зараження, і піддавали Вестерн-блоттингу із зазначеними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3( S396), анти-HA та анти-GAPDH]. Клітини D U251 трансфікували HA-вектором, HA-DHCR7 або HA-DHCR7 (G410S) протягом 24 годин. Потім клітини інфікували ZIKV (MOI ¼ 1), зібраним через 6 годин після зараження, і піддавали Вестерн-блоттингу із зазначеними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-PIRF3(S396) , анти-HA та анти-GAPDH]. Клітини E U251 обробляли зазначеною дозою AY9944 протягом 2 годин і інфікували ZIKV (MOI ¼ 1) протягом 6 годин, потім піддавали Вестерн-блоттингу з вказаними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти -IRF3, анти-P-IRF3(S396) і анти-GAPDH]. Дані отримані принаймні з трьох незалежних експериментів і представлені як репрезентативні дані (A–E).

Рис. 6. ZIKV NS4B взаємодіє з DHCR7, щоб інгібувати фосфорилювання TBK1 та IRF3. Клітини A HEK293T були спільно трансфіковані плазмідами, що кодують HA-DHCR7, і плазмідами, що кодують неструктурні білки ZIKV (FLAG-NS1, FLAG-NS3, FLAG-NS4A, FLAG-NS4B і FLAG-NS5), або порожньою контрольною плазмідою протягом 3 0 год. Клітинні лізати імунопреципітували антитілами проти Flag, а потім аналізували за допомогою імуноблоттингу з вказаними антитілами. Клітини B, C HEK293T котрансфікували плазмідами, що кодують HA-DHCR7, плазмідами, що кодують FLAG-NS4B, або порожньою контрольною плазмідою протягом 30 годин. Клітинні лізати були імунопреципітовані за допомогою анти-НА антитіл (В) або анти-FLAG антитіл (С), а потім проаналізовано імуноблоттингом із зазначеними антитілами. Клітини D U251 трансфікували плазмідою FLAG-NS4B разом із плазмідами, що кодують HA-DHCR7. Локалізацію FLAG-NS4B (зелений), HA-DHCR7 (червоний), ядерний маркер DAPI (синій) і злиття аналізували за допомогою конфокальної мікроскопії. Масштабна шкала ¼ 10 мкм. E Клітинні лізати з клітин HEK293T, трансфікованих HA-DHCR7, інкубували з білком GST або білком GST-NS4B, який інкубували з кульками глутатіон-сефарози. Суміші були виявлені за допомогою Вестерн-блоттингу з антитілами проти HA та анти-GST (угорі). Лізати з трансфікованих клітин HEK293T і очищені білки були виявлені Вестерн-блоттингом з антитілами проти HA і GST (внизу). Клітини F U251 трансфікували плазмідою, що кодує FLAG-NS4B (0, 1, 2 мкг). Відносні рівні білка DHCR7, FLAG-NS4B і GAPDH були виявлені за допомогою вестерн-блоттингу. Клітини G, H HEK293T були котрансфіковані плазмідою, що експресує NS4B, або порожнім вектором разом із плазмідою, що кодує TBK1- (F), плазмідою, що експресує IRF3-, і плазмідами, що кодують RIG-I (G) . Клітини збирали через 24 години після трансфекції та піддавали Вестерн-блоттингу із зазначеними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3(S396), анти-FLAG та антиGAPDH ]. I DHCR7-клітини U251 (sh-DHCR7) і sh-NTC U251 були трансфіковані плазмідою, що експресує NS4B, або порожнім вектором. Клітини збирали через 6 годин після трансфекції та піддавали Вестерн-блоттингу із зазначеними антитілами [анти-TBK1, анти-P-TBK1(S172), анти-IRF3, анти-P-IRF3(S396), анти-FLAG та антиGAPDH ]. Дані є репрезентативними для трьох незалежних експериментів.

5. Висновки

Таким чином, попереднє дослідження показало, що фермент метаболізму холестерину DHCR7 бере участь у вродженій імунній відповіді проти різних вірусних інфекцій. Наше дослідження показало, що ZIKV NS4B взаємодіяв з DHCR7 і індукував експресію DHCR7. Збільшення DHCR7 значною мірою пригнічує активацію TBK1 та IRF3 і призводить до зниження виробництва IFN- та ISG, що, таким чином, сприяє зараженню ZIKV у гліальних клітинах. Ці знахідки виявили новий механізм імунної втечі вірусу, за допомогою якого ZIKV долає імунну відповідь шляхом прямого націлювання на DHCR7 за допомогою NS4B.

Список літератури

Акула, М. К., Ши, М., Цзян, З., Фостер, Ч. Е., Мяо, Д., Лі, А. С., Чжан, X., Гевін, Р. М., Форде, С. Д., Жермен, Г., Карпентер, С., Росадіні, К.В., Гріцман, К., Че, Дж.Дж., Хемптон, Р., Сільверман, Н., Граваллезе, Е.М., Каган, Дж.К., Фіцджеральд, К.А., Кастнер, Д.Л., Голенбок, Д.Т., Берго, МО, Ванг, Д. ., 2016. Контроль вродженої імунної відповіді мевалонатним шляхом. Нац. Immunol. 17, 922–929.

Berthoud, L., 2020. Обмеження флавівірусів. Вірол. гріх. 35, 363–377.

Бланк, М., Се, Вайомій, Робертсон, К.А., Кропп, К.А., Форстер, Т., Шуй, Г., Лаказе, П., Уоттерсон, С., Гріффітс, С.Дж., Спанн, Нью-Джерсі, Мельон, А., Тальбот, С., Крішнан, К., Кові, Д. Ф., Венк, М. Р., Крейгон, М., Рузікс, З., Хаас, Дж., Ангуло, А., Гріффітс, В. Дж., Гласс, К. К., Ванг, Ю. , Ghazal, P., 2013. Транскрипційний фактор STAT-1 поєднує макрофагальний синтез 25-гідроксихолестерину з противірусною відповіддю інтерферону. Імунітет 38, 106–118.

Cao-Lormeau, V.-M., Blake, A., Mons, S., Lastere, S., Roche, C., Vanhomwegen, J., Dub, T., Baudouin, L., Teissier, A., Ларре, П., Віал, А.-Л., Декам, К., Шуме, В., Халстед, С.К., Віллісон, Х.Дж., Мюссе, Л., Манугерра, Ж.-К., Депре, П., Фурньє , E., Mallet, H.-P., Musso, D., Fontanet, A., Neil, J., Ghawche, F., 2016. Спалах синдрому Гієна-Барре, пов’язаний з інфекцією вірусу Зіка у Французькій Полінезії: випадок - контрольне дослідження. Lancet 387, 1531–1539.

Шазал, М., Боклер, Г., Грасіас, С., Найбург, В., Симон-Лор’єр, Е., Тангі, Ф., Комарова, А.В., Жувене, Н., 2018. RIG-I визнає 5' області геномів вірусів денге та Зіка. Cell Rep. 24, 320–328.

Чен, К., Гуйлі, Дж., Ферра, Ю. Дж., Еспіно, А., Глазіу, К., Картрон, Г., Ель Коста, Х., АльДакчак, Р., Джабране-Феррат, Н., 2020. Метаболічний перепрограмування вірусом Зіка провокує запалення в плаценті людини. Нац. Комун. 11, 2967. Dang, EV, McDonald, JG, Russell, DW, Cyster, JG, 2017. Стримування синтезу холестерину оксистеролом запобігає активації запалення AIM2. Комірка 171, 1057–1071 e1011.

Ding, Q., Cao, X., Lu, J., Huang, B., Liu, YJ, Kato, N., Shu, HB, Zhong, J., 2013. Вірус гепатиту C NS4B блокує взаємодію STING і TBK1, щоб уникнути вродженого імунітету господаря. Ж. Гепатол. 59, 52–58.

Фанунза, Е., Гранді, Н., Кварту, М., Карлетті, Ф., Ермелліно, Л., Мілія, Дж., Корона, А., Капобіанкі, М.Р., Іпполіто, Г., Трамонтано, Е., 2021 NS4B вірусу Зіка INMI1 антагонізує передачу сигналів інтерферону, пригнічуючи фосфорилювання STAT1. Віруси 13, 2448.

Фіцджеральд К.А., Маквіртер С.М., Файя К.Л., Роу О.К., Латц Е., Голенбок Д.Т., Койл А.Дж., Ляо С.М., Маніатіс Т., 2003. IKKε і TBK1 є важливими компонентами сигналізації IRF3 шлях. Нац. Immunol. 4, 491–496.

Фітці, Б.У., Вітш-Баумгартнер, М., Ердел, М., Лі, Дж.Н., Пайк, Ю.-К., Глоссманн, Х., Утерманн, Г., Мебіус, Ф.Ф., 1998. Мутації в Δ{{ 3}}ген стеролредуктази у пацієнтів із синдромом Сміта–Лемлі–Опіца. Proc. Natl. акад. Sci. США 95, 8181–8186.

Горман, М.Дж., Кейн, Е.А., Зайцев, К., Беглі, М.Ц., Вегер-Лукареллі, Дж., Учелліні, М.Б., Тріпаті, С., Моррісон, Дж., Йонт, Б.Л., Діннон 3-й, К.Х., Рукерт, С. ., Янг, MC, Чжу, Z., Робертсон, SJ, McNally, KL, Ye, J., Cao, B., Mysorekar, IU, Ebel, GD, Baric, RS, Бест, SM, Артьомов, MN, Гарсія -Sastre, A., Diamond, MS, 2018. Імунокомпетентна мишача модель інфекції вірусу Зіка. Клітинний мікроб-господар 23, 672–685.e6.

Грант, А., Понія, С. С., Тріпаті, С., Баласубраманіам, В., Міорін, Л., Суриссо, М., Шварц, МС, Санчес-Секо, М. П., Еванс, М. Дж., Бест, С. М., Гарсіа-Састр , A., 2016. Вірус Зіка націлений на STAT2 людини, щоб пригнічувати передачу сигналів інтерферону I типу. Cell Host Microbe 19, 882–890.

Герцог Дж., Діас Джуніор А.Г., Рігбі Р.Е., Дональд К.Л., Майєр А., Сезгін Е., Сонг Ч., Джін Б., Хубліц П., Еггелінг К., Коль, A., Rehwinkel, J., 2018. Зараження бразильським ізолятом вірусу Зіка генерує стимулюючу РНК RIG-I, а вірусний білок NS5 блокує індукцію та передачу сигналів ІФН типу I. Євро. J. Immunol. 48, 1120–1136.

Horlick, L., 1966. Вплив нового інгібітора біосинтезу холестерину (AY 9944) на сироваткові та тканинні стероли у щурів. J. Lipid Res. 7, 116–121.

Іконен, Е., 2008. Клітинний обмін холестерином і компартменталізація. Нац. Преподобний мол. Cell Biol. 9, 125–138.

Като, Х., Такеуті, О., Сато, С., Йонеяма, М., Ямамото, М., Мацуї, К., Уемацу, С., Юнг, А., Каваї, Т., Іші, К. Дж., Ямагучі , O., Otsu, K., Tsujimura, T., Koh, CS, Reis e Sousa, C., Matsuura, Y., Fujita, T., Akira, S., 2006. Диференціальні ролі MDA5 і RIG-I гелікази в розпізнаванні РНК-вірусів. Природа 441, 101–105.

Kuan, V., Martineau, AR, Griffiths, CJ, Hypp€onen, E., Walton, R., 2013. Мутації DHCR7, пов’язані з вищим статусом вітаміну D, дозволили ранню міграцію людини до північних широт. BMC Evol. Biol. 13, 144.

Кумар, А., Хоу, С., Айро, А.М., Лімонта, Д., Манчінеллі, В., Брентон, В., Пауер, К., Хобман, Т.К., 2016. Вірус Зіка пригнічує вироблення інтерферону типу I та подальші сигналізація. EMBO Rep. 17, 1766–1775.

Lazear, HM, Govero, J., Smith, AM, Platt, DJ, Fernandez, E., Miner, JJ, Diamond, MS, 2016. Мишача модель патогенезу вірусу Зіка. Cell Host Microbe 19, 720–730. Лі, Л.Ж., Комарасамі, Т.В., Аднан, НАА, Джеймс, В., Р.М.Т. Баласубраманіам, В., 2021. Хованки: взаємодія між вірусом Зіка та імунною відповіддю господаря. Фронт. Immunol. 12, 750365.

Леєр, Х.К., Вайнштейн, Дж.Б., Кайл, Д.Є., Лі, Дж.Й., Брамер, Л.М., Страттон, К.Г., Кемпторн, Д., Навратіл, А.Р., Тафесс, Е.Г., Хорнеманн, Т., Мессер, В.Б., Денніс, Е.А., Metz, TO, Barklis, E., Tafesse, FG, 2020. Глобальна ліпідна карта визначає мережу, необхідну для реплікації вірусу Зіка. Нац. Комун. 11, 3652.

Лі А., Ван В., Ван Ю., Чень К., Сяо Ф., Ху Д., Хуей Л., Лю В., Фен Ю., Лі Г., Тан, К., Лю, Ю., Ву, К., Ву, Дж., 2020. Консервативний сайт NS5 необхідний для вірусу Зіка, щоб обмежити передачу сигналів RIG-I. Фронт. Immunol. 11, 51.

Лі, К., Ден, YQ, Ван, С., Ма, Ф., Аліярі, Р., Хуан, XY, Чжан, Н.Н., Ватанабе, М., Донг, Х.Л., Лю, П., Лі, XF, Є, К., Тянь, М., Хун, С., Фан, Дж., Чжао, Х., Лі, Л., Вішлагі, Н., Бут, JE, Ау, К., Лю, Ю., Лу , Н., Ду, П., Цинь, Ф.Х., Чжан, Б., Гун, Д., Дай, X., Сун, Р., Новіч, Б.Г., Сю, З., Цінь, К.Ф., Ченг, Г. , 2017. 25- Гідроксихолестерин захищає хазяїна від інфікування вірусом Зіка та пов’язаної з ним мікроцефалії у моделі миші. Імунітет 46, 446–456.

Лю Ч.І., Лю Г.Ю., Сонг Ю., Інь Ф., Хенслер М.Е., Дженг В.Й., Нізет В., Ван А.Х., Олдфілд Е., 2008. Інгібітор біосинтезу холестерину блокує вірулентність Staphylococcus aureus . Наука 319, 1391–1394.

Лю, С. Й., Аліярі, Р., Чікере, К., Лі, Г., Марсден, доктор медичних наук, Сміт, Дж. К., Пернет, О., Го, Х., Нусбаум, Р., Зак, Д. А., Фрайберг, А. Н., Su, L., Lee, B., Cheng, G., 2013. Індукована інтерфероном холестерол-25-гідроксилаза широко пригнічує проникнення вірусу шляхом виробництва 25- 25-гідроксихолестерину. Імунітет 38, 92–105.

Ло, Дж., Янг, Х., Сонг, Б.Л., 2020. Механізми та регуляція гомеостазу холестерину. Нац. Преподобний мол. Cell Biol. 21, 225–245.

Luu, W., Hart-Smith, G., Sharpe, LJ, Brown, AJ, 2015. Кінцеві ферменти синтезу холестерину, DHCR24 і DHCR7, взаємодіють фізично та функціонально. J. Lipid Res. 56, 888–897.

Ма, Дж., Кеткар, Х., Ген, Т., Ло, Е., Ван, Л., Сі, Дж., Сун, К., Чжу, З., Цуй, Ю., Ян, Л., Wang, P., 2018. Неструктурний білок 4A вірусу Зіка блокує передачу сигналів RLR-MAVS. Фронт. мікробіол. 9, 1350. Мебіус Ф.Ф., Фіцкі Б.Ю., Лі Дж.Н., Пайк Ю.К., Глоссманн Х., 1998.

Молекулярне клонування та експресія дельта7-стеролредуктази людини. Proc. Natl. акад. Sci. США 95, 1899–1902.

Munoz-Jordan, JL, Laurent-Rolle, M., Ashour, J., Martinez-Sobrido, L., Ashok, M., Lipkin, WI, Garcia-Sastre, A., 2005. Інгібування передачі сигналів альфа/бета інтерферону білком NS4B флавівірусів. Ж. Вірол. 79, 8004–8013.

Munoz-Jordan, JL, Sanchez-Burgos, GG, Laurent-Rolle, M., Garcia-Sastre, A., 2003. Інгібування передачі сигналів інтерферону вірусом денге. Proc. Natl. акад. Sci. США 100, 14333–14338.

Петерсен, Дж., Дрейк, М. Дж., Брюс, Е. А., Ріблет, А. М., Дідігу, Каліфорнія, Вілен, К. Б., Малані, Н., Мале, Ф., Лі, Ф. Х., Бушмен, Ф. Д., Черрі, С., Домс, RW, Bates, P., Briley Jr., K., 2014. Для інфікування вірусом Анд необхідний основний шлях регуляції клітинного стеролу. PLoS Pathog. 10, e1003911.

Pierson, TC, Diamond, MS, 2020. Постійна загроза нових флавівірусів. Нац. мікробіол. 5, 796–812. Прабху, А.В., Луу, В., Лі, Д., Шарп, Л.Ж., Браун, А.Й., 2016a. DHCR7: життєво важливий фермент, що перемикає виробництво холестерину та вітаміну D. Прог. Lipid Res. 64, 138–151.

Прабху, А.В., Луу, В., Шарп, Л.Ж., Браун, А.Й., 2016b. Опосередкована холестерином деградація 7-дегідрохолестерин-редуктази перемикає баланс із синтезу холестерину на синтез вітаміну D. J. Biol. Chem. 291, 8363–8373. Рендалл, Г., 2018. Метаболізм крапель ліпідів під час інфекції вірусу денге. Trends Microbiol. 26, 640–642.

Расмуссен, SA, Джеймісон, DJ, Honein, MA, Петерсен, LR, 2016. Вірус Зіка та вроджені дефекти – перегляд доказів причинності. Н. англ. J. Med. 374, 1981–1987.

Reboldi, A., Dang, EV, McDonald, JG, Liang, G., Russell, DW, Cyster, JG, 2014. Запалення. 25-Гідроксихолестерин пригнічує запалення, викликане інтерлейкіном-1-, після інтерферону I типу. Наука 345, 679–684.

Riedl, W., Acharya, D., Lee, JH, Liu, G., Sherman, T., Chiang, C., Chan, YK, Diamond, MS, Gack, MU, 2019. Вірус Зіка NS3 імітує клітинний { {2}}мотив зв’язування для протидії RIG-I- та MDA5-опосередкованому вродженому імунітету. Cell Host Microbe 26, 493–503 e496.

Роджерс, Массачусетс, Віллареал, Вірджинія, Шефер, Е.А., Пенг, Л.Ф., Корі, К.Е., Чунг, Р.Т., Янг, П.Л., 2012. Профілювання ліпідного метаболіту визначає метаболізм десмостеролу як нову противірусну мішень для вірусу гепатиту С. J. Am. Chem. Соц. 134, 6896–6899. Savidis, G., Perreira, JM, Portmann, JM, Meraner, P., Guo, Z., Green, S., Brass, AL, 2016. IFITM пригнічують реплікацію вірусу Зіка. Cell Rep. 15, 2323–2330.

Schneider, WM, Chevillotte, MD, Rice, CM, 2014. Інтерферон-стимульовані гени: складна мережа захисту господаря. Annu. Rev. Immunol. 32, 513–545.