Гранула Yishen Qingli Heluo у лікуванні хронічної хвороби нирок: мережевий фармакологічний аналіз та експериментальна перевірка

фон:Хронічна хвороба нирокХХН вважається глобальною проблемою охорони здоров’я з високим рівнем захворюваності та смертності. Гранула Yishen Qingli Heluo (YQHG) є представникомтрадиційна китайська медицина(TCM) засіб дляклінічне лікування ХХН. Це дослідження спрямоване на вивчення механізму YQHG при ХХН за допомогою мережевої фармакології та експериментальної перевірки.

Методи:Системи традиційної китайської медициниФармакологічна база даних (TCMSP) і широкомасштабний пошук літератури були застосовані для скринінгу активних сполук YQHG. Нами було застосовано численні біоінформаційні інструменти та онлайн-бази даних, щоб отримати відповідні цілі YQHG та ХХН. Цілі перетину між YQHG і CKD розглядалися як потенційні цілі. Мережі сполуки-мішені, трави-кандидата-мішені та мережі взаємодії білок-білок були побудовані та візуалізовані для топологічного аналізу. Були проведені аналізи збагачення GO та KEGG для визначення біологічних процесів та сигнальних шляхів. Для перевірки надійності мережевої фармакології використовувався молекулярний докінг. Нарешті, була проведена фармакологічна оцінка, щоб дослідити механізм YQHG проти ХХН на моделі нефректомії 5/6.

Результати:Було перевірено сімдесят дев'ять кандидатів-мішеней, десять основних біологічних процесів і один ключовий сигнальний шлях (p53). PTGS2 було визначено як ключову ціль на основі мережі H-CT. Молекулярний докінг показав, що кверцетин, кемпферол і лютеолін були трьома ключовими сполуками з найкращою активністю зв'язування. Крім того, IL6 і кверцетин можуть утворювати стабільний комплекс із високою афінністю зв’язування (–7,29 ккал/моль). Експерименти in vivo показали, що YQHG покращує функцію нирок і фіброз у 5/6 нефректомованих щурів. Крім того, у нирковій тканині спостерігали зниження експресії PTGS2, IL6 та підвищення експресії р53. Примітно, що кишкова мікробіота щурів, які отримували YQHG, була змінена, що характеризувалося зниженим співвідношенням Firmicutes/Bacteroidota.

Висновок: наші результати передбачили та підтвердили потенційні цілі YQHG наХХНз цілісної точки зору та забезпечив цінний напрямок для подальших досліджень YQHG.

Ключові слова:Гранула Yishen Qingli Heluo, мережева фармакологія,хронічні захворювання нирок, 5/6 нефректомія, кишкова мікробіота

ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК

вступ

Хронічна хвороба нирок(ХНЗ) все більше визнається глобальною проблемою охорони здоров’я з високим рівнем захворюваності (8724 на 100, 000 осіб) і смертності (15,9 на 100, 000 осіб).1 Фактори ризику та шляхи розвитку захворювань, які які призводять до порушення функції нирок, різноманітні та погано з’ясовані. Отже, доступно небагато стратегій для затримки прогресування ХХН, при цьому більшість сучасних стратегій лікування зосереджені навколо зменшення протеїнурії та зниження артеріального тиску та сечової кислоти. Наприклад, інгібітори ренін-ангіотензинової системи є основними терапевтичними препаратами для лікування ХХН з точки зору зменшення протеїнурії та захисту функції нирок.2,3 Однак дослідження показало, що ці препарати можуть не допомагати запобігатипрогресування ХХНдотермінальна стадія захворювання нирок(ESRD);4 крім того, вони можуть викликати низку побічних ефектів, таких як підвищення рівня калію в сироватці крові, креатиніну та ризик раку.5–8 На даний момент кількість людей, які отримують замісну ниркову терапію, перевищила 2,6 мільйона і, як очікується, буде подвоїться до 5,4 мільйона в усьому світі до 2030 року.9 Коли ХХН прогресує до ESRD, це не лише спричинить економічний тягар для пацієнтів, але й значною мірою вплине на якість їхнього життя. Відповідно, існує нагальна потреба вивчити потенційні терапевтичні препарати для профілактики та лікування ХХН у цій галузі.

Традиційна китайська медицина (ТКМ) була визнана потенційним варіантом лікування ХХН через її доведену ефективність, широкий спектр застосування та незначну кількість побічних ефектів. Багато випадків показали, що трави ТКМ розглядаються як альтернативне джерело для уповільнення прогресування ХХН завдяки традиційному досвіду та багатоцільовим характеристикам.10–12 Гранула Yishen Qingli Heluo (YQHG) була незалежно розроблена лікарнею китайської медицини провінції Цзянсу як Засіб TCM для клінічного лікування ХХН. Клінічні дослідження показали, що YQHG може покращити клінічні симптоми та знизити рівень сироваткового креатиніну (Scr). Крім того, YQHG також може сповільнювати прогресування ХХН3 до ХХН4.13,14 Наше попереднє дослідження показало, що YQHG може пом’якшувати ураження нирок шляхом регуляції аутофагії, апоптозу та запальної відповіді.15 Однак більшість досліджень гранул зосереджувалися навколо деяких класичні сигнальні шляхи, такі як MAPK, TGF- та споріднені шляхи, які були недостатніми. Через відсутність ефективних систематичних методів у минулому дослідження ефективних сполук, мішеней і відповідних фармакологічних механізмів YQHG проти ХХН обмежені. Отже, дослідження були зосереджені на механізмі мономеру або активної сполуки YQHG у лікуванні ХХН. Однак YQHG схожий на складний оркестр різноманітних інструментів. Як ці 10 трав працюють разом, щоб грати ідеальний репертуар, ще потрібно дослідити. Тому важливо знайти нові шляхи для всебічного розуміння механізмів YQHG проти ХХН. Мережева фармакологія є передовою методологією, яку вперше запропонував Гопкінс.16 Цей метод узгоджується з цілісним поглядом ТКМ. В останні роки він широко використовується для з’ясування механізмів ТКМ у лікуванні хронічних захворювань, включаючи ХХН.17–19

У цьому дослідженні ми вперше використали підхід мережевої фармакології як інструмент для вивчення активних сполук YQHG та дослідження його основного механізму дії при лікуванні ХХН. Потім молекулярний докінг був використаний для перевірки надійності мережевої фармакології. Крім того, ми підтвердили нефропротекторний потенціал YQHG і ключову цільову експресію у 5/6 щурів з нефректомією. Варто зазначити, що попередні дослідження показали, що кишкова мікробіота відіграє важливу роль у терапевтичному ефекті ТКМ.20–22 Кишкова мікробіота може змінити хімічний склад трав ТКМ, щоб зробити їх біодоступність, біологічну активність або токсичність іншою, ніж трави ТКМ. попередник. Трави TCM можуть також змінити різноманітність і склад кишкової мікробіоти, щоб полегшити пов’язані захворювання.23 Отже, секвенування 16S рРНК використовується для аналізу зв’язку між травами TCM, ХХН і профілем кишкової мікробіоти, закладаючи основу для подальших досліджень YQHG. Деталі процесу аналізу цього дослідження показано на малюнку 1.

Матеріали та методи

Мережевий фармакологічний аналіз

Придбання активних сполук і відповідних цілей у YQHG Сполуки кожної трави в YQHG були отримані з бази даних TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) і широкомасштабного аналізу літератури. Сполуки фільтрували через систему оцінки ADME, в якій основними параметрами були оральна біодоступність (OB) і схожість з лікарським засобом (DL). OB більше або дорівнює 30% і DL більше або дорівнює 0,18 були пороговими значеннями методу фільтрації ADME, рекомендованого базою даних TCMSP.24 TCMSP, STITCH (http://stitch.embl.de) /), бази даних PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) і Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) були використані для визначення цілей, що відповідають кожній активній сполукі в YQHG . Для стандартизації результатів використовувалася база даних Uniprot (https://www. uniprot.org/).

Пошук мішеней-кандидатів YQHG при лікуванні ХХН Цілі, пов’язані з ХХН, були отримані від GeneCards (https://www.genecards.org/), OMIM (http://www.omim.org/), DisGeNET (https:// www.disgenet.org/), бази даних TTD (http://db.idrblab.net/ttd/) і MalaCards (https://www.malacards.org/). Усі зібрані цілі CKD та YQHG були об’єднані після стандартизації базою даних Uniprot.

Можливі цілі YQHG проти ХХН були визначені платформою Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/web tools/Venn/), а результати були використані для подальшого аналізу.

Побудова мережі

(1) Compound-target (C-T) network of YQHG: The data of active compounds and their corresponding targets were imported into Cytoscape software (v3.6.0, Boston, MA, USA) to construct the C-T interaction network. The degree centrality, betweenness centrality, and closeness centrality were evaluated by the Network Analyzer plug-in of Cytoscape software. According to the three topological parameters of each node, the key active compound of YQHG was selected and analyzed. (2) Herb-Candidate target (H-CT) network of YQHG: The data of 10 herbs and candidate targets were imported into Cytoscape software to construct the H-CT interaction network. The pie chart was used to indicate the herb to which the candidate target (represented by circular nodes) belonged. (3) Protein-protein interaction (PPI) network of candidate targets: The visualization of PPI network was obtained by combining the STRING database (https://string-db.org/) and Cytoscape software. The species were limited to Homo sapiens, and the PPI confidence score>0.9 був параметром фільтрації, рекомендованим базою даних STRING.25 Вузли та ребра представляють потенційні цілі та взаємодії білок-білок у мережі PPI відповідно. У цьому дослідженні основні цільові білки були відібрані та ідентифіковані за параметром «Ступінь». Ступінь використовувався для оцінки топологічної важливості вузлів у мережі, яка була розрахована за допомогою плагіна Network Analyzer програмного забезпечення Cytoscape.

Аналіз збагачення шляху GO та KEGG

Для дослідження ключових умов біологічного процесу GO та критичних сигнальних шляхів кандидатів-мішеней використовувався пакет R (clusterProfiler, версія 4.1.0) для аналізу збагачення GO та KEGG.26 Скориговане значення P<0.05 was considered statistically significant.

Молекулярний докінг

У дослідженні молекулярного докінгу програмне забезпечення Autodock Vina 1.1.2 використовувалося для визначення режиму зв’язування та взаємодії між ключовими активними сполуками YQHG і концентраційними білками, ідентифікованими на основі PPI та аналізу мережевого аналізатора. Цей підхід включав такі основні етапи: (1) Підготовка молекули ліганду. Тривимірні структури активних сполук завантажували у форматі mol2 з бази даних TCMSP. AutodockTools 1.5.6 використовувався для відкриття молекули ліганду, додавання водню, заряду Гаштайгера, виявлення кореня ліганду, пошуку та визначення поворотного зв’язку та, нарешті, збереження у форматі pdbqt. (2) Підготовка молекули рецептора. Тривимірні структури концентраційних білків були завантажені з RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org). Для завантаження протеїну використовувався AutodockTools 1.5.6. Після додавання всіх атомів водню, обчислення заряду Гаштайгера та об’єднання неполярного водню він визначається як рецептор і зберігається у форматі pdbqt. (3) Налаштування параметрів стикування. Інструмент AutoGrid для встановлення параметрів док-бокса (координати XYZ і розмір сітки). Для підвищення точності розрахунку значення вичерпності встановлено рівним 20. (4) Виконання та вихід. Програмне забезпечення Autodock Vina 1.1.2 використовувалося для напівгнучкого стикування, і найкраща конформація була обрана як остаточна конформація стикування. (5) Аналіз та візуалізація. Конформацію з найкращою спорідненістю зв'язування було обрано для аналізу режиму докінгу. Спорідненість зв'язування білка була меншою за -5 ккал/моль, що свідчить про те, що білок мав певну активність зв'язування зі з'єднанням.27 Результати стикування з'єднання та білка з найкращою конформацією були проаналізовані та візуалізовані програмним забезпеченням PyMol.

Приготування YQHG

YQHG (номер партії 20051031) складався з 10 окремих гранул TCM: Angelicae Sinensis Radix (Danggui, DG), Achyranthis Bidentatae Radix (Niuxi, NX), Centella Asiatica (L.) Urban (Jixuecao, JXC), Polygonati Rhizoma (Huangjing, HJ), Smilacis Glabrae Rhixoma (Tufuling, TFL), Radix Rhei Et Rhizome (Dahuang, DH), Pyrrosiae Folium (Shiwei, SW), Hedysarum Multijugum Maxim (Huangqi, HQ), Serissa Japonica (Thunb.) Thunb (Liuyuexue, LYX) ), Polygoni Cuspidati Rhizoma Et Radix (Huzhang, HZ), який був виготовлений Jiangyin Tianjiang Pharmaceutical Co., Ltd. (Вусі, Цзянсу, Китай). Співвідношення однієї гранули TCM до відповідного необробленого лікарського засобу наведено в таблиці 1. Усі наведені вище гранули були підтверджені професором Вей Суном (Нанкінський університет китайської медицини, Нанкін, Цзянсу, Китай). Формат дозування препарату на основі ваги (на кг) використовувався в цьому дослідженні для розрахунку доз YQHG у щурів.28 Розрахована з масою тіла дорослої людини 70 кг, клінічна еквівалентна доза, перерахована на щурів, становила 2,8 г/кг, що було використовується як середня доза YQHG. Низька доза та висока доза в цьому дослідженні становили половину та подвійну середню дозу YQHG відповідно. УВЕРХ-МС було проведено для підтвердження стабільності та ефективності екстракту YQHG.

Конструкція 5/6 нефректомії та введення YQHG

Самці щурів Sprague Dawley (SD) (№ 20210312Aazz0619000112, 6–8 тижнів, 200–230 г) були надані Vital River Experimental Animal Co., Ltd. (Чжецзян, Китай). Щурів містили в спеціальному центрі експериментальних тварин, вільному від патогенів Нанкінського університету китайської медицини. Зокрема, щурів утримували в пластикових клітках і їм безкоштовно давали достатню кількість стандартної їжі та води. Умови навколишнього середовища в приміщенні, де вирощували щурів, включали температуру (22±2 градуси), вологість (50±10%) і 12/12-годинний цикл світло/темрява. Усі експерименти на тваринах проводили згідно з протоколом, затвердженим Комітетом з догляду та використання тварин Нанкінського університету китайської медицини [номер дозволу 202101A047]. Рекомендації щодо добробуту лабораторних тварин — «Рекомендації щодо етичної перевірки добробуту тварин для лабораторних тварин» (GB/T 35892–2018). Усі операції проводилися під відповідним наркозом, і було зроблено все можливе, щоб мінімізувати страждання тварини.

ХХН була викликана у 24 щурів за допомогою двоетапної 5/6 нефректомії, як описано раніше.29 Процедура двох операцій була наступною: видаляли 2/3 паренхіми лівої нирки (уникаючи ниркового хребта), а потім швидко вводили желатиновою губкою на поверхні розрізу, щоб зупинити кровотечу на 4–5 хвилин. Через тиждень виконана правобічна однобічна нефректомія. Ніжку нирки перев’язали стерильним швом 3–0, а потім резецували праву нирку. Черевну порожнину промивали 0,9% стерильним фізіологічним розчином, щоб уникнути післяопераційного зрощення черевної порожнини після двох хірургічних операцій. Вступну та підтримуючу анестезію (витрата ізофлурану становило 6 мл/год та 3 мл/год відповідно) під час операції проводили за допомогою Rodent Gas Anesthesia Machine (Yuyan-ABS). В якості контролю використовували шість щурів, яким зробили фіктивну операцію. Щури з ХХН були випадковим чином розділені на чотири групи (n=6 для кожної групи). Підгрупи та добова доза речовин, що вводилися через зонд, були такими: I) модельна група (стерильна вода); II група низьких доз YQHG (1,4 г/кг YQHG); III) Середня доза YQHG (2,8 г/кг YQHG); IV) Висока доза YQHG (5,6 г/кг YQHG). Під час експерименту всіх щурів зважували двічі на тиждень і відповідно коригували дози препарату. Наприкінці експерименту у щурів перед умертвінням відібрали зразки сечі та фекалій. Зразки крові та тканини нирок були зібрані для подальших досліджень.

Реагенти

Scr, азот сечовини крові (BUN) і набори для кількісного визначення білка в сечі (C011-2-1, C013-2-1, C035-2-1) були придбані в Nanjing Jiancheng Biotech Co., Ltd. (Нанкін, Цзянсу, Китай). Набір IL-6 ELISA (bsk00042) був придбаний у Nanjing Jinyibai Biotech Co., Ltd. (Нанкін, Цзянсу, Китай). Набір для аналізу концентрації білка BCA (PC0020) був отриманий від Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Пекін, Китай). Анти-PTGS2 антитіла (ab179800), анти-p53 антитіла (ab227655), анти-GAPDH антитіла (ab181602) і козячі анти-кролячі IgG H&L (HRP) (ab6721) були придбані в Abcam (Кембридж, Великобританія).

Scr, BUN і кількісне визначення білка в сечі за 24 години

Scr, BUN і 24-годинний рівень білка в сечі вимірювали за допомогою Scr, BUN і наборів для кількісного визначення білка в сечі відповідно до інструкцій. Серед них кількісне визначення білка в сечі проводилося шляхом 24-годинного збору сечі з метаболічних клітин за день до забиття щурів. Формула має такий вигляд: білок у сечі (мг/24 год)=концентрація білка в сечі (мг/л) × об’єм сечі за 24 години (л).

Гістопатологічна оцінка ниркових тканин

Нирки щурів промивали попередньо охолодженим PBS (Solarbio), а потім фіксували в 4% параформальдегіді (biosharp). Зрізи (4 мкм) вирізали з залитої парафіном ниркової тканини та фарбували гематоксиліном і еозином (H&E) або трихромом Массона (Masson) (Solarbio). Зображення світлового мікроскопа були сфотографовані за допомогою цифрового сканера слайдів (специфікація типу: Pannoramic DESK, P-MIDI, P250; компанія: 3D HISTECH; країна: Угорщина; програмне забезпечення для сканування: Pannoramic Scanner). Кроки для обчислення площі клубочкового та тубулоінтерстиціального фіброзу були наступними: Спочатку програмне забезпечення CaseViewer2.4 було використано для вибору клубочкової (тубулоінтерстиційної) області для зображення 40×. Спробуйте заповнити серветкою все поле зору та переконайтеся, що фонове освітлення кожного зображення було однаковим. По-друге, програмне забезпечення Image-Pro Plus 6.0 виконало аналіз зображення, встановило піксель як стандартну одиницю, і для кожного зрізу було обрано два поля зору. Нарешті оцінювали площу фіброзу, тобто відсоток площі фіброзу (%)=площа клубочкового (тубулоінтерстиціального) фіброзу/площа клубочкового (тубулоінтерстиціального) × 100%.

Аналіз кишкової мікробіоти

Фекалії всіх щурів у п’яти групах (Sham, Model, LD YQHG, MD YQHG, HD YQHG) збирали для аналізу кишкової мікробіоти. Чотири основні етапи секвенування кишкової мікробіоти були такими: I) Екстракція геномної ДНК: загальну ДНК фекалій екстрагували за допомогою набору EZNA® Soil DNA Kit (Omega Bio-tek) згідно з протоколами виробника. Концентрацію та чистоту ДНК контролювали на 1% агарозному гелі. II) ПЛР-ампліфікація: Область V3-V4 гена 16S рРНК ампліфікували за допомогою специфічного праймера (338F_806R) зі штрих-кодом. ПЛР-ампліфікацію проводили за допомогою набору ДНК-полімерази TransStart Fastpfu. III) Кількісне визначення продуктів ПЛР, змішування та очищення: зверніться до попередніх результатів кількісного визначення електрофорезу, для виявлення та кількісного визначення продуктів ПЛР використовувався набір для аналізу QuantiFluor™ -ST (Promega), а потім змішайте відповідні пропорції відповідно до вимог секвенування кожного зразка. Потім суміш продуктів ПЛР очищали за допомогою набору для гель-екстракції GeneJET (Thermo Fisher Scientific). IV) Підготовка бібліотеки та секвенування: Профілювання проводилося на платформі MiSeq (Illumina, Inc., Сан-Дієго, Каліфорнія). Для фільтрації даних секвенування 16S рРНК використовували функцію швидкого налаштування довжини коротких зчитувань (FLASH, версія 1.2.11). Операційні таксономічні одиниці (OTU) були вибрані за 97% схожості, а очищені амплікони були секвеновані на платформі Illumina MiSeq у Majorbio Biopharm Technology Co. Ltd. (Шанхай, Китай) відповідно до стандартних протоколів.

Вестерн-блот і ІФА

Загальний білок із заморожених зразків нирок екстрагували буфером для лізису RIPA (Beyotime), що містить 1% PMSF (Beyotime). Концентрацію білка визначали за допомогою набору для визначення концентрації білка BCA (Solarbio) згідно з інструкцією. Білки розділяли SDS-PAGE гелями та переносили на мембрани PVDF (Solarbio). Після блокування 5% BSA (Solarbio) мембрани інкубували з первинними антитілами PTGS2 (1:1000), p53 (1:1000), GAPDH (1:10 000) при 4 градусах на ніч. Згодом мембрани промивали TBST (Solarbio) та інкубували протягом 60 хвилин при кімнатній температурі з козячим антикролячим IgG H&L (HRP) (1:20 000). Мембрани інкубували за допомогою Ultrasensitive ECL Detection Kit (Proteintech) протягом 1–2 хвилин, а потім виявляли на BIO-RAD ChemiDoc XRS+ Gel Imaging System (Bio-Rad, Каліфорнія, США). Значення сірого кольору білкових смуг аналізували за допомогою програмного забезпечення Image Lab (Bio-Rad).

PBS додавали до ниркової тканини (1 мл/0,1 г), і електрогомогенізований зразок центрифугували, щоб зібрати супернатант. Згодом щурячий IL-6 ELISA набір використовувався для виявлення експресії IL-6 згідно з інструкціями.

Статистичний аналіз

Усі дані були виражені як середнє ± SEM. Для статистичного аналізу та побудови зображень використовували програмне забезпечення GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, Каліфорнія, США). Ми поєднали графіки QQ (додатковий малюнок 1) із тестом Шапіро–Вілка, щоб оцінити нормальність даних. Для нормально розподілених даних використовувався односторонній дисперсійний аналіз з наступним тестом Тьюкі. Для ненормально розподілених даних використовувався критерій Краскела–Уолліса з наступним непараметричним критерієм суми рангів Вілкоксона. стор<0.05 was considered statistically significant.

Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:

Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Тел.:+86 15292862950

Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

ОТРИМАЙТЕ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНХИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК