Широко спрямований метаболомічний аналіз для виявлення механізму трансформації активних сполук Cistanche Deserticola під час процесів пропарювання та сушіння

Cistanche deserticola є однією з найцінніших рослин, традиційно в китайській медицині, і останнім часом використовується у фармацевтичній промисловості та промисловості здорового харчування. Пропарювання та сушіння є двома важливими етапами обробки Cistanche deserticola.

На жаль, повне розуміння змін хімічного складу Cistanche deserticola під час термічної обробки обмежене. У цьому дослідженні для дослідження механізму трансформації активних сполук Cistanche deserticola під час процесів пропарювання та сушіння використовувався широкоспрямований метаболомічний аналіз надефективної рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії (UHPLC-MS/MS). Загалом 776 метаболітів було ідентифіковано в Cistanche deserticola під час термічної обробки, серед яких 77 метаболітів диференційовано регулювалися (p < 0.05), з яких 39 були активовані (UR), а 38 були знижені (DR). Сорок сім (17 UR, 30 DR) і 30 (22 UR, 8 DR) диференціальних метаболітів були ідентифіковані під час пропарювання та сушіння відповідно.

Найбільше розмаїття хімічних речовин спостерігалося під час процесу пропарювання. Аналіз метаболічного шляху показав, що метаболізм фенілпропаноїдів, флавоноїдів і метаболізм аланіну спостерігався під час пропарювання, тоді як метаболізм гліцину, серину та треоніну, метаболізм тіаміну та біосинтез ненасичених жирних кислот спостерігався під час сушіння. Можливі механізми хімічних змін під час термічної обробки також були надані аналізом шляху Кіотської енциклопедії генів і геномів (KEGG). Крім того, почорніння зовнішнього вигляду Cistanche deserticola в основному відбувалося на стадії пропарювання, а не на стадії сушіння, яка пов’язана з метаболізмом амінокислот. Усі результати показали, що утворення активних сполук під час обробки Cistanche deserticola в основному відбувалося на стадії пропарювання.

click cistanche tubulosa доповнення ефекти продукти

ВСТУП

Cistanche deserticola, що належить до сімейства Orobanchaceae, є одним із найвідоміших тонізуючих засобів і в основному поширений у тропічних і субтропічних регіонах світу, таких як Китай, Іран, Індія, Монголія тощо (1–3). Cistanche deserticola служить одним із найбільш часто використовуваних рослинних лікарських засобів для лікування ниркової недостатності, імпотенції, жіночого безпліддя, патологічної лейкореї, профузної метрорагії та старечого віку (4, 5). Сучасні фармакологічні дослідження показали, що Cistanche deserticola покращує імунітет, запобігає втомі, старінню та покращує здатність до навчання та запам’ятовування (6). Завдяки цим перевагам для здоров’я чай із стеблових бульб цистанчі пустерної був розроблений як поживна добавка, і споживачі все більше віддають перевагу. Активні інгредієнти Cistanche deserticola відповідають за його лікувальні функції (7). У попередніх дослідженнях повідомлялося про деякі активні інгредієнти Cistanche deserticola, такі як фенілпропаноїди (наприклад, фенілетаноїдні глікозиди), флавоноїди, полісахариди, олігосахариди, іридоїди та лігнани (6, 8).

У зв’язку зі швидкопсувністю та сезонністю цілорічна пропозиція свіжої цистанки пустельної недоступна, відповідно основною формою споживання стає оброблена цистанка пустерна. Якість Cistanche deserticola залежить від багатьох факторів, таких як клімат, середовище існування, господарі, час збору врожаю, технологія обробки та розташування рослини, серед яких технологія обробки є особливо важливою (4). Пропарювання та сушіння є двома важливими етапами обробки Cistanche deserticola. Зазвичай зібране кореневище Cistanche deserticola пропарювали в паровому котлі при 93 °C протягом 30 хвилин, а потім сушили при 60 °C до досягнення вмісту вологи 10 відсотків у вологому розрахунку (wb) (9).

Попередні дослідження показали, що пропарювання може сприяти накопиченню активних інгредієнтів у Cistanche deserticola, таких як фенілетаноїдні глікозиди, розчинні цукри та полісахариди, що супроводжується почорнінням зовнішнього кольору (9–11). Однак більшість попередніх досліджень були зосереджені на певних конкретних сполуках, і дуже рідкісні дослідження стосуються змін у всіх хімічних сполуках і механізмі перетворення метаболітів під час обробки. Тому необхідно уточнити зміни метаболітів Cistanche deserticola на різних етапах обробки.

Метаболоміка зазвичай застосовується для якісного та кількісного аналізу всіх малих молекул (а саме цільових і нецільових сполук), виявлених у зразку (12). Аналіз змін різних хімічних компонентів під час переробки харчових продуктів допомагає поглибити розуміння механізму перетворення хімічних компонентів під час переробки харчових продуктів (12). В останні роки метаболоміка також застосовувалася для вивчення Cistanche deserticola для розрізнення різних частин (11) і різних видів Cistanche deserticola (13).

Методи виявлення метаболітів у цих дослідженнях здебільшого базувалися на цільовій і нецільовій метаболоміці. Серед них цільова метаболоміка базується на стандартних продуктах з високою точністю та надійністю даних, однак обмежене охоплення метаболітів. Цільова метаболоміка є важливою частиною метаболомічних досліджень, це цілеспрямоване та специфічне виявлення та аналіз конкретних груп метаболітів, а не всіх компонентів у зразку. Технологія нецільової метаболоміки може якісно визначати метаболіти на основі існуючих баз даних з високим охопленням сполук, однак, низькою точністю. Ключові метаболіти повинні бути підтверджені стандартними продуктами (14). Широко спрямована метаболоміка — це нова технологія, яка поєднує в собі переваги технологій нецільового та цільового виявлення метаболітів для досягнення широкого охоплення, високої пропускної здатності та чутливості (15).

Отже, ця технологія широко використовується у вивченні змін інгредієнтів у різних матеріалах під час обробки, таких як активні інгредієнти у функціональних харчових продуктах різними методами обробки (16), флавоноїди та фенілпропаноїди в китайському водяному каштані, оброблені різними методами (17). , механізм пожовтіння рису під час процесу пожовтіння (18) і механізм утворення характерних нелетких хімічних речовин під час процесу виробництва чаю улун (19). Таким чином, теоретично доцільно використовувати технологію метаболітів широкого призначення для вивчення механізму перетворення активних інгредієнтів під час обробки Cistanche deserticola.

Таким чином, завдання цього дослідження полягали в тому, щоб (1) надати корисну інформацію про хімічні зміни в Cistanche deserticola під час процесів пропарювання та сушіння за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії та тандемної мас-спектрометрії (UHPLC-MS/MS) у поєднанні з широко спрямованим метаболічним методом. підхід; (2) визначити диференціальні метаболіти та правила їх регуляції, а також виявити можливі шляхи перетворення в Cistanche deserticola під час обробки. Таким чином, очікується, що це дослідження надасть теоретичну довідку для механізму формування високоякісної Cistanche deserticola.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ Матеріали та хімікати

Сировина: свіжі зразки Cistanche deserticola були отримані з регіону Хетянь у провінції Сіньцзян Китаю. Ретельно відбирали зразки однакового розміру (середня довжина, діаметр і вага становили 11,7 ± 1,1 см, 7.0 ± 1,1 см і 360 ± 8,9 г відповідно). Зразки зберігалися при кімнатній температурі в темному середовищі з початковим вмістом вологи приблизно 78,56% ± 3,47%. Перед експериментами зразки Cistanche deserticola промивали водопровідною водою, щоб видалити пил з поверхні. Надлишки води з його поверхні видаляли промокальним папером.

Хімічні речовини: метанол, ацетонітрил і мурашина кислота були отримані за рідинною хроматографією мас-спектрометрії (LC-MS) і придбані у Merck (Sigma Aldrich, MO, США). Інші аналітичні стандарти показали чистоту вище 98 відсотків (Sigma Aldrich, MO, США).

Експериментальний дизайн

Попередні дослідження показали, що хімічні сполуки нерівномірно розподіляються в поздовжньому напрямку Cistanche deserticola (1). Тому, щоб отримати однаковий початковий вміст хімічних сполук у кожному зразку, у цьому дослідженні всі відібрані Cistanche deserticola розрізали на три рівні частини для свіжої групи (A), пропарювали без сушіння (B) і сушили після пропарювання. (C), відповідно, поздовжньою сегментацією з поздовжньою віссю симетрії як центром (20).

Для групи B зразки послідовно пропарювали протягом 8 хв відповідно до попередніх експериментів. Імпульсне вакуумне пропарювальне обладнання (саморозроблене Китайським сільськогосподарським університетом, Пекін, Китай) використовувалося для пропарювання свіжого Cistanche deserticolas. Пропарені зразки сушили у вакуумній сублімаційній сушарці (LGJ-25C, Si Huan Scientific Instrument Factory Co., Пекін, Китай). Температури нагрівальної пластини та холодної пастки становили 30 і −60 ◦C відповідно. Для групи C зразки послідовно пропарювали за допомогою імпульсного вакуумного обладнання протягом 8 хвилин і сушили в сушарці з гарячим повітрям (власної розробки Китайським сільськогосподарським університетом, Пекін, Китай) до остаточного вмісту вологи 10 відсотків (wb). Швидкість повітряного потоку та температура були встановлені на рівні 6 м/с та 60°C відповідно, посилаючись на результати дослідження Zou et al. (11). Усі зразки зберігалися при –20◦C не більше 7 днів перед подальшим аналізом.

Визначення зовнішнього кольору Cistanche Deserticola

Колір зовнішнього вигляду Cistanche deserticola до та після кожної термічної обробки вимірювали за допомогою колориметра (SMY2000SF, Shengming Yang Co., Пекін, Китай), а чорноту характеризували значенням L*.

Підготовка та екстракція зразків

Екстракцію метаболіту проводили відповідно до методу, описаного раніше Chen et al. (21) з деякими незначними модифікаціями. Коротше кажучи, висушені зразки подрібнювали за допомогою міксера (MM 400, Retsch Company, Haan, Німеччина) з цирконієвою кулькою протягом 2 хвилин при 60 Гц. Потім 50 мг порошку (просіяного через сито 65 меш) кожного зразка точно зважували, переносили в пробірку Епендорфа та екстрагували 1 мл суміші метанол/вода (v:v=3:1). Після 30-секундного завихрення суміш двічі гомогенізували при 35 Гц протягом 4 хвилин, обробляли ультразвуком протягом 15 хвилин у бані з крижаною водою, а потім струшували протягом ночі при 4 °C. Після центрифугування при 12,000 об/хв протягом 15 хв при 4°C супернатант збирали та фільтрували через мембрану 0.22-мкм, потім отриманий екстракт переносили у 2 мл скляні флакони та зберігали. при -80 ◦C до аналізу UHPLC-MS/MS.

Аналіз метаболітів за допомогою УВЕРХ-МС в умовах УВЕРХ

Розділення UHPLC проводили за допомогою системи EXIONLC (Sciex Technologies, Framingham, MA, USA). Аналітичні умови були такими: колонка: Waters ACQUITY UHPLC HSS T3 C18 (1,8 мкм, 2,1 × 100 мм); система розчинників: рухома фаза А (0.1% мурашиної кислоти у воді) і рухома фаза В (містить ацетонітрил). Програма градієнта: 98 відсотків A/2 відсотки B через 0 хвилин, 50 відсотків A/50 відсотків B через 10 хвилин, 5 відсотків A/95 відсотків B через 11 хвилин, 98 відсотків A/2 відсотки B через 13,1 хвилини та 98 відсоток A/2 відсотка B через 15 хв. Швидкість потоку: 0,40 мл/хв; температура колонки: 40◦C; об'єм ін'єкції: 2 мкл; температура автоматичного впорскування: 4◦C.

Умови ESI-QTRAP-MS/MS

Потрійний квадрупольний (QQQ)-лінійний мас-спектрометр з іонною пасткою (QTRAP, API 6500 QTRAP UHPLC-MS/MS) плюс спектрометр QQQ, оснащений інтерфейсом ESI turbo ion-spray (Sciex Technologies, Фремінгем, Массачусетс, США), застосовувався для MS аналіз. Аналітичні умови були такими: напруга розпилення іонів: плюс 5500 В (режим позитивних іонів)/-4500 В (режим негативних іонів), завісний газ: 35 psi, температура джерела: 400 ◦C, газ джерела іонів 1: 60 psi, Газ джерела іонів 2: 60 фунтів на кв.

Якісний і кількісний аналіз метаболітів

Якісний і кількісний аналізи метаболітів проводили згідно з методами Liu et al. (18). Дані первинної та вторинної мас-спектрометрії були якісно проаналізовані на основі самостійно створеної бази даних метаболомів людини (MWDB) (Metware Biotechnology Co., Ltd. Ухань, Китай) і загальнодоступної бази даних. Тим часом, щоб забезпечити точність якісного аналізу деяких речовин, перешкоди від повторюваних сигналів Na plus, NH plus 4, K plus і іонів, а також повторювані сигнали іонів-фрагментів, отриманих від інших відносно великих молекул, і сигнали ізотопів були видалені під час ідентифікація. Структурний аналіз метаболітів проводили щодо загальнодоступних баз даних (Mass Bank, KNApSAck, HMDB, MoTo DB і METLIN).

Кількісне визначення метаболітів проводили за допомогою режиму MRM мас-спектрометрії QQQ. У режимі MRM іони-попередники (батьківські іони) цільових речовин і виключені іони, що відповідають іншим речовинам з різною молекулярною масою, спочатку перевірялися за допомогою квадрупольного стрижня, щоб спочатку усунути перешкоди. Потім іони-попередники прориваються через камеру зіткнень, утворюючи багато фрагментів заліза після іонізації, які були відфільтровані QQQ для вибору окремих фрагментів іонів з потрібними характеристиками, одночасно усуваючи перешкоди від нецільових іонів. Нарешті, після отримання даних мас-спектрометрії метаболітів різних зразків, піки мас-спектрів усіх речовин були інтегровані, а піки мас-спектрів того самого метаболіту в різних зразках були інтегровані та скориговані за допомогою Multi Quant версії 3.0 .2 (ABSCIEX, Конкорд, Онтаріо, Канада). Відповідні відносні вмісти метаболітів були представлені як інтеграли площі хроматографічного піку.

Обробка та аналіз даних

Метаболічні дані обробляли за допомогою ортогонального часткового дискримінантного аналізу найменших квадратів (OPLS-DA) та ієрархічного кластерного аналізу (HCA). OPLS-DA використовувався для дискримінації кожної групи; він більш чутливий, ніж інші статистичні методи, до змінних з низькою кореляцією (17). Моделі OPLS-DA були перевірені за допомогою аналізу перестановки (200 разів). Модель вважалася стабільною, коли обидва параметри моделі (R2 і Q2) були близькі до 1.

Було розраховано значення проекції змінної важливості (VIP) метаболітів. Будь-які метаболіти зі значеннями VIP більше 1.0 і p-значеннями менше 0.05 були обрані як біомаркери для кожного парного порівняння між різними стадіями термічної обробки Cistanche deserticola. Скринінг різних метаболітів візуалізувався у вигляді графіка вулкана. Накопичення метаболітів серед різних зразків аналізували за допомогою пакета R (www.rproject.org/). Діаграма Венна була побудована за програмою web-based smart diagram R (https://cloud.smartdraw.com/). Комерційні бази даних, такі як Кіотська енциклопедія генів і геномів (KEGG) (https: //www.kegg.jp/kegg/), Pub Chem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), База даних шляхів малих молекул (SMPDB) (https://smpdb.ca/) і HMDB (https://hmdb.ca/) використовувалися для аналізу збагачення диференціальних метаболітів і пошуку метаболічних шляхів.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ Зміни зовнішнього вигляду забарвлення Cistanche Deserticola під час термічної обробки

Різниця у зовнішньому кольорі Cistanche deserticola між свіжими, пропареними та висушеними зразками представлена ​​на малюнку 1. Від свіжих до висушених зразків на стадії обробки колір зовнішнього вигляду зразків змінювався від жовто-коричневого до темно-чорного. , і темний колір ставав все більш очевидним (відповідне значення L ∗ було зменшено з 50,26 до 24,90). Зовнішній вигляд Cistanche deserticola в основному відбувався в процесі пропарювання. Реакція Майяра, під час якої цукри реагують з амінокислотами в теплових умовах (22), значною мірою відповідає за темний колір оброблених кореневищ Cistanche deserticola. Попередні дослідження показали, що прекурсори перетворювалися на барвники та створювали речовини темного кольору в реакції Майяра (23). Подібні результати також спостерігалися в попередніх дослідженнях пропарювання Polygonum multiflorum (24) і кореневищ Polygonatum cystoma (25). Після сушіння оброблені парою зразки потемніли. Ймовірно, це явище було пов’язане зі зменшенням концентрації пігменту під час процесу сушіння.

Огляд метаболітів у сирих і термічно оброблених зразках Cistanche Deserticola

Загальна іонна хроматограма (TIC) зразка контролю якості (QC) (суміші всіх досліджуваних зразків) і багатопіковий графік виявлення хімічних речовин у режимі MRM того самого зразка проілюстровано на Додатковому малюнку 1. Різнокольорові піки представлені різних компонентів у зразку. Як показано на малюнку 2, у поточному дослідженні (додаткова таблиця 1) у свіжих зразках Cistanche deserticola було ідентифіковано загальну кількість 776 метаболітів, які були розділені на 15 класів, включаючи 40 амінокислот і похідних, 33 фенілпропаноїди, 23 флавоноїди, 68 флавонів, 67 терпенів, 67 фенолів, 87 алкалоїдів, 13 вуглеводів, 28 нуклеотидів і похідних, 5 спиртів і поліолів, 3 пуринових нуклеозидів, 15

карбонових кислот і похідних, 14 органічних кислот і похідних, 12 фітогормонів і 28 інших хімічних речовин. Серед них найбільшу групу становили амінокислоти та похідні, відносний вміст яких становив 30,26% від загального складу метаболітів. Крім того, 10 видів фенілетаноїдних глікозидів, таких як ехінакозид і вербаскозид, були виявлені та класифіковані в групі фенілпропаноїдів.

Схема накопичення метаболітів у різних групах лікування була проаналізована HCA. Як показано на малюнку 3, 107 ідентифікованих метаболітів Cistanche deserticola були кластеризовані на теплових картах на основі арифметики евклідової відстані. Метаболіти, ідентифіковані на різних етапах термічної обробки, були зібрані в три кластери відповідно до дендрограми. Більш яскравий колір вказує на вищий вміст певного метаболіту у відповідному зразку. Теплова карта HCA показала більші відмінності у кількості між свіжими та пропареними зразками, ніж між пропареними та висушеними зразками, що вказує на те, що метаболіти в Cistanche deserticola можуть мати різні перетворення під час пропарювання та сушіння, а також типи та кількості метаболітів, які беруть участь у процес обробки парою більше, ніж процес сушіння.

Диференціальний аналіз метаболітів Cistanche Deserticola на різних стадіях термічної обробки

Для кращого розуміння впливу кожної обробки на метаболіти Cistanche deserticolas, показники розкиду OPLS-DA для парних порівняльних груп показані на малюнку 4A, показуючи, що свіжі, пропарені та сушені після пропарювання Cistanche deserticolas значно відрізнялися. Крім того, R2Y і Q2 (як показано на додатковому малюнку 2) з високими тестовими значеннями показали, що ця модель була високонадійною без переобладнання.

Для скринінгу рівня експресії метаболітів між свіжими, пропареними та висушеними після пропарювання Cistanche deserticola, було додатково застосовано аналіз графіка вулкана серед усіх 776 метаболітів, ідентифікованих відповідно до кратності зміни, у поєднанні зі значеннями VIP для скринінгу диференціально виражених метаболіти. Істотні диференціальні метаболіти були відібрані відповідно до критерію зміни кратності: більше або дорівнює 2 або менше або дорівнює 0.5 з VIP, більшим або дорівнює 1. Результати скринінгу проілюстровано на Малюнок 4B. На вулканічній карті кожна точка представляє метаболіт, а колір розкиданих крапок представляє кінцевий результат скринінгу. Червоний колір позначає метаболіти зі значною активацією (UR), зелений – метаболіти зі значною зниженою регуляцією (DR), а сірий – метаболіти, які відрізняються несуттєво. Як показано на малюнку 4B, 47 метаболітів у свіжій групі порівняно з приготованою на пару (17 UR і 30 DR), 30 метаболітів у групі, приготованій на пару проти висушеної групи (22 UR і 8 DR), і 65 метаболітів у свіжій групі проти сушеної групи (29 UR і 36 DR) були вибрані як суттєво відмінні. Кількість суттєво різних метаболітів у свіжій групі порівняно з групою, приготованою на пару, була вищою, ніж у групі, приготованій на пару проти сушеної, що вказує на те, що вплив на метаболіти в процесі обробки парою є вищим, ніж у процесі сушіння.

Диференціальні метаболіти, що утворюються під час термічної обробки Cistanche deserticola, були додатково класифіковані та порівняні. Ці диференціально експресовані метаболіти були класифіковані на 21 клас, головним чином амінокислоти та їх похідні, флавоноїди та їх похідні, фенілпропаноїди, алкалоїди, терпени, феноли та нуклеотиди та їх похідні (табл. 1). У групі свіжих і приготованих на пару можна виявити, що флавоноїди (такі як ізокверцитрин, троксерутин, ціанідин і фізетин), фенілпропаноїди (такі як хлорогенова кислота та 3-(3,4-дигідрокси{ {5}}метокси)-2-пропенова кислота), нуклеотиди та їх похідні (урацил і бета-нікотинамід мононуклеотид) були значною DR, тоді як амінокислоти та їх похідні (такі як N6-ацетил-L-лізин , 1- метил-L-гістидин і L-фенілаланін) були значною UR.

Однак у групі, що готується на пару проти сушеної, тенденції експресії цих типів диференціальних метаболітів були протилежними. Деякі аміногрупи та їх похідні (такі як N,N-диметилгліцин), нуклеотиди та їх похідні (такі як 2′-дезоксиуридин; дезоксиуридин) були значно DR, тоді як більшість фенолів (такі як метилгаллат і 4′-пренілоксиресвератрол), флавоноїди (такі як ізокверцитрин і ціанідин), фенілпропаноїди (вербаскозид) і терпени (такі як терпінолен і фуранон) були значно UR. Ці результати показали, що хімічний склад Cistanche deserticola піддався перетворенню під час термічної обробки, що в основному відображається на перетворенні флавоноїдів, фенілпропаноїдів та амінокислот, а механізм перетворення цих компонентів відрізняється на різних етапах обробки.

Раніше було встановлено, що використання високої температури під час процесів пропарювання та сушіння сприяє гідролізу, окислювально-відновному процесу, ізомеризації, заміщенню та іншим теплофізичним і хімічним реакціям метаболітів (26). У цьому дослідженні було виявлено, що метаболіти, такі як флавоноїди та фенілпропаноїди, значно накопичувалися в приготованих на пару Cistanche deserticola порівняно з їх відповідними свіжими, що вказує на те, що деякі ключові фізіологічні та метаболічні дії, що призводять до синтезу флавоноїдів і фенілпропаноїдів, можуть бути активується при високій температурі та вологості. Цей результат також може підтверджуватися звітом Peng et al. (10), які виявили, що вміст PhGs (що належать до фенілпропаноїдів) збільшився після пропарювання. Однак накопичення цих компонентів у висушеному зразку після обробки парою показало значне зменшення, що можна пояснити термічним розкладанням цих термочутливих компонентів під час тривалого процесу сушіння. Попередні дослідження показали, що флавоноїдні глікозиди можуть розкладатися на цукрові тільця та флавоноїдні аглікони в теплових умовах, а на втрату флавоноїдів під час процесу сушіння синтетично впливають температура та час сушіння (26, 27). Підвищена регуляція амінокислот та їх похідних (N6-ацетил-L-лізину, 1-меті-L-гістидину та фенілаланіну) пояснюється високотемпературним розкладанням білка під час обробки парою. Крім того, було також помічено, що деякі інші амінокислоти та їх похідні N, N-диметилгліцину, L-кінуреніну, гліцину, серину та треоніну були DR. Зменшення вмісту цих амінокислот може бути пов’язане з термічно індукованою реакцією Майяра, під час якої відновлюючі цукри реагують з амінокислотами з утворенням 5-HMF, що сприяє утворенню чорного кольору у Cistanche deserticola (22) .

Результати зміни кольору зовнішнього вигляду розрізу цистанки пустирної під час термічної обробки додатково підтвердили цю гіпотезу. Отже, почорніння Cistanche deserticola під час пропарювання, ймовірно, пов’язане з метаболізмом амінокислот. Діаграму Венна використовували для диференціації загальних і ексклюзивних метаболітів Cistanche deserticola на різних етапах термічної обробки. Як показано на малюнку 4C, між різними групами порівняння існують як загальні, так і унікальні метаболіти. Двадцять один загальний метаболіт спостерігався між групою свіжих і приготованих на пару, тоді як лише 5 і 1 0 метаболіти були виявлені спільними для групи свіжих і сушених, а також груп, приготованих на пару і сушених, відповідно. Таким чином, загалом 23 та 17 ексклюзивних метаболітів (p < 0,05) спостерігалися у Cistanche deserticola під час термічної обробки на стадії пропарювання та сушіння відповідно. Цей результат додатково підтвердив, що пропарювання було особливо важливим для перетворення метаболітів під час обробки Cistanche deserticola.

Аналіз збагачення та аналіз впливу диференційних метаболітів на шлях KEGG

Диференціальні метаболіти (p < 0,05) у свіжих і оброблених зразках були зіставлені в онлайн-бази даних KEGG, HMDB і PubChem, які містять інформацію про молекулярну взаємодію, реакції та зв’язки, а також результати збагачення і детальні метаболічні шляхи показані в Додатковій таблиці 2 і на малюнку 5. Як показано на малюнках 5a1 і a2, вплив шляху виявив збагачення біосинтезу фенілпропаноїдів, біосинтезу флавоноїдів, метаболізму аланіну, метаболізму рибофлавіну, метаболізму таурину і гіпотаурину, а також нікотинату і нікотинаміду метаболізм при пропарюванні Cistanche deserticola. Тоді як під час процесу сушіння після пропарювання метаболічні шляхи диференціальних метаболітів в основному містили метаболізм гліцину, серину та треоніну, метаболізм тіаміну, метаболізм піримідину та біосинтез ненасичених жирних кислот.

Крім того, деякі метаболічні шляхи між цими двома попарними порівняннями перекривалися, наприклад метаболізм нікотинату та нікотинаміду, біосинтез фенілпропаноїдів та біосинтез флавоноїдів, але їхні рівні збагачення були дуже різними в двох попарних порівняннях. Ці результати свідчать про те, що шляхи перетворення метаболітів між процесами пропарювання та сушіння Cistanche deserticola відрізняються, і відмінності в метаболічних шляхах можуть пояснити відмінності в присутності диференціально виключних метаболітів під час термічної обробки. Ці біохімічні зміни можуть бути використані для розуміння впливу стадій термічної обробки на склад Cistanche deserticola.

чотири метаболічні шляхи (біосинтез фенілпропаноїдів, біосинтез флавоноїдів, метаболізм аланіну та метаболізм гліцину, серину та треоніну) були обрані як ключові метаболіти для характеристики перетворення основних активних компонентів Cistanche deserticola під час термічної обробки (рис. 5b1, b2). Поточне дослідження показало, що фенілпропаноїди та флавоноїди були накопичені, але амінокислоти були розщеплені в пропареному Cistanche deserticola порівняно зі свіжими та висушеними зразками. Шлях біосинтезу фенілпропаноїдів проходить вище за шлях біосинтезу флавоноїдів. Подібні висновки опублікували Liu et al. (18), які повідомили, що рівень накопичення фенілпропаноїдів у процесі пожовтіння рису значно збільшився порівняно зі звичайним рисом. Фенілпропаноїди отримують з коричної кислоти, а їхнім попередником є ​​фенілаланін, який може бути синтезований шляхом активації активності фенілаланін-амоніазу (PAL) при нагріванні (28).

Попередні дослідження показали, що фенілпропаноїдний шлях призводить до біосинтезу кумаринів, флавонів, ізофлавонів і флавонолів, які є важливою зброєю для захисту рослин (29), і для запобігання загибелі клітин, спричиненої сильним тепловим стресом у процесі пропарювання, фенілпропаноїд шлях може бути посилений через біологічний стрес, спричинений високою температурою (30, 31). Флавоноїди є основними вторинними метаболітами, отриманими з фенілпропаноїдів (32), і їх накопичення може захистити рослини від окисного пошкодження вільними радикалами (33). Порівняно зі свіжим і висушеним Cistanche deserticola, вищий біосинтез флавоноїдів у пропареному Cistanche deserticola може бути пов’язаний із посиленим тепловим стресом під час процесу пропарювання, що захищає активні форми кисню (АФК) (34, 35). Як показано на малюнках 5b3 і b4, метаболізм амінокислот відіграв важливу роль у термічній обробці Cistanche deserticola. Зміни вмісту аланіну, гліцину, серину та треоніну після пропарювання, виявлені в лікарських травах, були використані для вказівки на виникнення реакції Майяра (36).

Тим не менш, через складний процес пропарювання Cistanche deserticola, всебічна оцінка пропарювання Cistanche deserticola, наприклад, почорніння зовнішнього вигляду, активні сполуки та метаболічні біомаркери, повинна бути додатково досліджена.

ВИСНОВКИ

У цьому дослідженні для вивчення механізму утворення активних сполук на різних стадіях термічної обробки Cistanche deserticola використовувався метаболомічний підхід широкого призначення на основі UHPLC-MS/MS. Поточні результати показали, що біосинтез деяких ключових метаболітів, таких як фенілпропаноїди та флавоноїди, був значно посилений під час процесу пропарювання. Рівень експресії амінокислот у пропареній Cistanche deserticola був підвищений, що вказує на трансформацію між первинними та вторинними метаболітами. Крім того, почорніння зовнішнього вигляду Cistanche deserticola в основному відбувалося на стадії пропарювання, а не на стадії сушіння, ця характеристика пов’язана з метаболізмом амінокислот. Однак рівні вищевказаних метаболітів значно знизилися під час процесу сушіння, що свідчить про те, що утворення активних сполук в основному відбувалося на стадії пропарювання під час термічної обробки Cistanche deserticola. Наскільки нам відомо, це перший раз, коли широко спрямований метаболомічний метод був використаний для виявлення механізму змін активних сполук під час термічної обробки та їх вирішального внеску в почорніння Cistanche deserticola. Однак необхідні подальші дослідження для кращого розуміння зв’язку між біосинтезом активних сполук і почорнінням зовнішнього вигляду під час термічної обробки.

Аналіз збагачення та аналіз впливу диференційних метаболітів на шлях KEGG

Диференціальні метаболіти (p < 0,05) у свіжих і оброблених зразках були зіставлені в онлайн-бази даних KEGG, HMDB і PubChem, які містять інформацію про молекулярну взаємодію, реакції та зв’язки, а також результати збагачення і детальні метаболічні шляхи показані в Додатковій таблиці 2 і на малюнку 5. Як показано на малюнках 5a1 і a2, вплив шляху виявив збагачення біосинтезу фенілпропаноїдів, біосинтезу флавоноїдів, метаболізму аланіну, метаболізму рибофлавіну, метаболізму таурину і гіпотаурину, а також нікотинату і нікотинаміду метаболізм при пропарюванні Cistanche deserticola. Тоді як під час процесу сушіння після пропарювання метаболічні шляхи диференціальних метаболітів в основному містили метаболізм гліцину, серину та треоніну, метаболізм тіаміну, метаболізм піримідину та біосинтез ненасичених жирних кислот. Крім того, деякі метаболічні шляхи між цими двома попарними порівняннями перекривалися, наприклад метаболізм нікотинату та нікотинаміду, біосинтез фенілпропаноїдів та біосинтез флавоноїдів, але їхні рівні збагачення були дуже різними в двох попарних порівняннях. Ці результати свідчать про те, що шляхи перетворення метаболітів між процесами пропарювання та сушіння Cistanche deserticola відрізняються, і відмінності в метаболічних шляхах можуть пояснити відмінності в присутності диференціально виключних метаболітів під час термічної обробки. Ці біохімічні зміни можуть бути використані для розуміння впливу стадій термічної обробки на склад Cistanche deserticola.

На основі анотації та аналізу збагачення KEGG чотири метаболічні шляхи (біосинтез фенілпропаноїдів, біосинтез флавоноїдів, метаболізм аланіну та метаболізм гліцину, серину та треоніну) були обрані як ключові метаболіти для характеристики перетворення основних активних компонентів Cistanche deserticola під час термічної дії. обробки (рис. 5b1,b2). Поточне дослідження показало, що фенілпропаноїди та флавоноїди були накопичені, але амінокислоти були розщеплені в пропареному Cistanche deserticola порівняно зі свіжими та висушеними зразками. Шлях біосинтезу фенілпропаноїдів проходить вище за шлях біосинтезу флавоноїдів. Подібні висновки опублікували Liu et al. (18), які повідомили, що рівень накопичення фенілпропаноїдів у процесі пожовтіння рису значно збільшився порівняно зі звичайним рисом. Фенілпропаноїди отримують з коричної кислоти, а їхнім попередником є ​​фенілаланін, який може бути синтезований шляхом активації активності фенілаланін-амоніазу (PAL) при нагріванні (28).

Попередні дослідження показали, що фенілпропаноїдний шлях призводить до біосинтезу кумаринів, флавонів, ізофлавонів і флавонолів, які є важливою зброєю для захисту рослин (29), і для запобігання загибелі клітин, спричиненої сильним тепловим стресом у процесі пропарювання, фенілпропаноїд шлях може бути посилений через біологічний стрес, спричинений високою температурою (30, 31). Флавоноїди є основними вторинними метаболітами, отриманими з фенілпропаноїдів (32), і їх накопичення може захистити рослини від окисного пошкодження вільними радикалами (33).

Порівняно зі свіжим і висушеним Cistanche deserticola, вищий біосинтез флавоноїдів у пропареному Cistanche deserticola може бути пов’язаний із посиленим тепловим стресом під час процесу пропарювання, що захищає активні форми кисню (АФК) (34, 35). Як показано на малюнках 5b3 і b4, метаболізм амінокислот відіграв важливу роль у термічній обробці Cistanche deserticola. Зміни вмісту аланіну, гліцину, серину та треоніну після пропарювання, виявлені в лікарських травах, були використані для вказівки на виникнення реакції Майяра (36). Тим не менш, через складний процес пропарювання Cistanche deserticola, всебічна оцінка пропарювання Cistanche deserticola, наприклад, почорніння зовнішнього вигляду, активні сполуки та метаболічні біомаркери, повинна бути додатково досліджена.

ВИСНОВКИ

У цьому дослідженні для вивчення механізму утворення активних сполук на різних стадіях термічної обробки Cistanche deserticola використовувався метаболомічний підхід широкого призначення на основі UHPLC-MS/MS. Поточні результати показали, що біосинтез деяких ключових метаболітів, таких як фенілпропаноїди та флавоноїди, був значно посилений під час процесу пропарювання. Рівень експресії амінокислот у пропареній Cistanche deserticola був підвищений, що вказує на трансформацію між первинними та вторинними метаболітами. Крім того, почорніння зовнішнього вигляду Cistanche deserticola в основному відбувалося на стадії пропарювання, а не на стадії сушіння, ця характеристика пов’язана з метаболізмом амінокислот. Однак рівні вищевказаних метаболітів значно знизилися під час процесу сушіння, що свідчить про те, що утворення активних сполук в основному відбувалося на стадії пропарювання під час термічної обробки Cistanche deserticola. Наскільки нам відомо, це перший раз, коли широко спрямований метаболомічний метод був використаний для виявлення механізму змін активних сполук під час термічної обробки та їх вирішального внеску в почорніння Cistanche deserticola. Однак необхідні подальші дослідження для кращого розуміння зв’язку між біосинтезом активних сполук і почорнінням зовнішнього вигляду під час термічної обробки.

ЗАЯВА ПРО НАЯВНІСТЬ ДАНИХ

Оригінальний внесок, представлений у дослідженні, включено до статті/додаткового матеріалу, подальші запити можна направляти відповідним авторам/авторам.

АВТОРСЬКИЙ ВНЕСОК

ZA провів експериментальний дизайн, виконав експерименти, згенерував дані та написав цей рукопис. YZ виконав метаболомічний аналіз. XL надав статистичний аналіз. WS проводив обробку даних та дослідження. Придбання фінансування, загальна структура та написання та рецензування були завершені YL. Усі автори долучилися до статті та схвалили подану версію.

ФІНАНСУВАННЯ

Ця робота була підтримана Департаментом науки і технологій провінції Гуандун (№ 2018B020241003).

ДОДАТКОВИЙ МАТЕРІАЛ

Додатковий матеріал до цієї статті можна знайти в Інтернеті за адресою: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnut.2021. 742511/повний#доп.матеріал

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Wang X, Wang J, Guan H, Xu R, Luo X, Su M та ін. Порівняння хімічних профілів і антиоксидантної активності різних частин культивованої Cistanche deserticola за допомогою ультраефективної рідинної хроматографії, квадрупольної часопролітної мас-спектрометрії та аналізу на основі 1,1-дифеніл-2-пікрилгідразилу. Молекули. (2017) 22:2011. doi: 10.3390/molecules22112011

2. Fu Z, Fan X, Wang X, Gao X. Cistanches Herba: огляд його хімії, фармакології та фармакокінетики. J Етнофармакол. (2018) 219:233–47. doi: 10.1016/j.jep.2017.10.015

3. Piwowarczyk R, Carlón L, Kasinska J, Tofil S, Furma ´ nczyk P. ´ Мікроморфологічна внутрішньовидова диференціація нектароводів і посадкової платформи для запилювачів у іберійської паразитичної рослини Cistanche phelypæa (Orobanchaceae). Бот Летт. (2016) 163:47–55. doi: 10.1080/12538078.2015.1124287

4. Jiang Y, Tu P. Аналіз хімічних складових у видах Cistanche. J Хроматогр а. (2009) 1216:1970–9. doi: 10.1016/j.chroma.2008. 07.031

5. Li Z, Lin H, Gu L, Gao J, Tzeng C. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): один із найкращих фармацевтичних подарунків традиційної китайської медицини. Фронт Фармакол. (2016) 7:41. doi: 10.3389/fphar.2016.00041

6. Song Y, Zeng K, Jiang Y, Tu P. Cistanches Herba, від зникаючих видів до великого бренду китайської медицини. Med Res Rev. (2021) 5:1–39. doi: 10.1002/med.21768

7. Xiong Q, Kadota S, Tani T, Namba T. Антиоксидантні ефекти фенілетаноїдів з Cistanche deserticola. Biol Pharmac Bull. (1996) 19:1580–5. doi: 10.1248/bob.19.1580

8. Wang L, Ding H, Yu H, Han L, Lai Q, Zhang L та ін. Cistanches herba: хімічний склад і фармакологічна дія. Chin Herbal Med. (2015) 7:135–42. doi: 10.1016/S1674-6384(15)60017-X

9. Peng F, Xu R, Wang X, Xu C, Liu T, Chen J. Вплив процесу пропарювання на якість післязбирального Cistanche deserticola для використання в медицині під час сушіння на сонці. Біол Фарм Бюл. (2016) 39:2066–70. doi: 10.1248/bob.b16- 00250

10. Peng F, Chen J, Wang X, Xu C, Liu T, Xu R. Зміни рівнів фенілетаноїдних глікозидів, антиоксидантної активності та інших якісних ознак у скибочках Cistanche deserticola шляхом обробки парою. Chem Pharm Bull. (2016) 64:1024-30. doi: 10.1248/CPB.c16-00033

11. Zou P, Song Y, Lei W, Li J, Tu P, Jiang Y. Застосування метаболоміки на основі 1 H ЯМР для розрізнення різних частин і розробки нового робочого процесу для Cistanche deserticola. Acta Pharm Sin B. (2017) 7:647–56. doi: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

12. Zheng J, Wu Z, Yang N, Zhou K, Hu W, Ou S та ін. Широко спрямований метаболомічний аналіз UHPLC-MS/MS на хімічні варіації випічки з чорничною начинкою під час обробки. Кордони в харчуванні. (2020) 7:569172. doi: 10.3389/fnut.2020.569172

13. Liu W, Song Q, Cao Y, Xie N, Li Z, Jiang Y та ін. Від нецільової метаболомічної стратегії на основі 1H ЯМР до ​​цільової метаболоміки на основі РХ-МС для поглибленого порівняння ромашки серед чотирьох видів Cistanche. J Pharmaceut Biomed. (2019) 162:16–27. doi: 10.1016/j.jpba.2018.09.013

14. Wang H, Hua J, Yu Q, Li J, Wang J, Deng Y та ін. Широко спрямований метаболомічний аналіз виявляє динамічні зміни нелетких і летких метаболітів під час обробки зеленого чаю. Харчова хім. (2021) 363:130131. doi: 10.1016/j.foodchem.2021.130131

15. Койстінен В. М., Да Сілва А. Б., Абранко Л. Лоу Д., Віллалба Р. Г., Барберан Ф. Т. та ін. Міжлабораторний тест охоплення біологічно активних сполук рослинної їжі та їх метаболітів за допомогою нецільової метаболоміки на основі мас-спектрометрії. Метаболіти. (2018) 8:46. doi: 10.3390/metabo8030046

16. Сантін М., Лучіні Л., Кастанья А., Чіоделлі Г., Хаузер М., Раньєрі А. УФ-В випромінювання після збору врожаю модулює профіль метаболітів у плодах персика. Postharvest Biol Tec. (2018) 139:127– 34. doi: 10.1016/j.postharvbio.2018.02.001

17. Ні Х, Чень Х, Лі Г, Су К, Сон М, Дуань З та ін. Порівняння флавоноїдів і фенілпропаноїдних сполук у китайському водяному каштані, обробленому різними методами. Харчова хім. (2021) 335:127662. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.127662

18. Liu Y, Liu J, Wang R, Sun H, Li M, Strappe P та ін. Аналіз вторинних метаболітів, викликаних процесом пожовтіння, для розуміння механізму пожовтіння рису. Харчова хім. (2021) 342:128204. doi: 10.1016/j.foodchem.2020.128204

19. Wu L, Huang X, Liu S, Liu J, Guo Y, Sun Y та ін. Розуміння механізму утворення характерних нелетких хімічних речовин чаю улун під час виробничих процесів за допомогою інтегрованого аналізу метаболомів і протеомів DIA. Харчова хім. (2020) 310:125941. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.125941

20. Xie Y, Li X, Zhang Y, Zheng Z, Huang L, Liu D та ін. Вплив пропарювання гарячим повітрям високої вологості на Gastrodia elata: ступінь пропарювання, втрата ваги, текстура, кінетика висихання, мікроструктура та активні компоненти. Процес харчової біопродукції. (2021) 127:255–65. doi: 10.1016/j.fbp.2021.03.005

21. Chen W, Gong L, Guo Z, Wang W, Zhang H, Liu X та ін. Новий інтегрований метод широкомасштабного виявлення, ідентифікації та кількісного визначення метаболітів широкого призначення: застосування у вивченні метаболоміки рису. Завод Мол. (2013) 6:1769–80. doi: 10.1093/mp/sst080

22. Arena S, Renzone GD, Ambrosio C, Salzano AM, Scaloni A. Молочні продукти та реакція Майяра: багатообіцяюче майбутнє для широкої характеристики харчових продуктів шляхом комплексних досліджень протеоміки. Харчова хім. (2017) 219:477–89. doi: 10.1016/j.foodchem.2016.09.165

23. Ріцці Г. П. Хімічна структура кольорових продуктів реакції Майяра. Food Rev Int. (1997) 13:1–28. doi: 10.1080/87559129709541096

24. Liu Z, Chao Z, Liu Y, Song Z, Lu A. Реакція Майяра, яка бере участь у процесі пропарювання кореня Polygonum multiflorum. Планта Мед. (2009) 75:84–8. doi: 10,1055/с-0028-1088349

25. Jin J, Lao J, Zhou R, He W, Qin Y, Zhong C та ін. Одночасна ідентифікація та динамічний аналіз сахаридів під час обробки парою кореневищ Polygonatum cystoma методом HPLC–QTOF–MS/MS. Молекули. (2018) 23: 2855. doi: 10.3390/molecules23112855

26. Ван XC. Біохімія чаю (третє видання). Пекін: Китайське сільськогосподарське видавництво (2003). стор. 41–5.

27. Xu Y, Xiao Y, Lagnika C, Li D, Liu C, Jiang N та ін. Порівняльна оцінка поживних властивостей, антиоксидантної здатності та фізичних характеристик капусти (Brassica oleracea var. Capitate var L), підданої різним методам сушіння. Харчова хім. (2020) 309:124935. doi: 10.1016/j.foodchem.2019.06.002

28. Dixon RA, Paiva N L. Метаболізм фенілпропаноїдів, індукований стресом. Рослинна клітина. (1995) 7:1085–97. doi: 10.1105/tpc.7.7.1085

29. Gupta R, Min CW, Kim SW, Wang Y, Agrawal GK, Rakwal R та ін. Порівняльне дослідження насіннєвих оболонок коричневого та жовтого кольору насіння сої з використанням інтегрованого підходу протеоміки та метаболоміки. Протеоміка. (2015) 15:1706–16. doi: 10.1002/pmic.201400453

30. Commisso M, Toffali K, Strasser P, Stocchero M, Ceoldo S, Baldan B та ін. Вплив фенілпропаноїдних сполук на стійкість до теплового стресу в культурах клітин моркви. Front Plant Sci. (2016) 7:1439. doi: 10.3389/fpls.2016.01439

31. Wahid A, Gelani S, Ashraf M, Foolad M. Теплостійкість рослин: огляд. Environ Exp Bot. (2007) 61:199–223. doi: 10.1016/j.envexpbot.2007.05.011

32. Wu X, Yuan J, Luo A, Chen Y, Fan Y. Стрес від посухи та повторне зволоження підвищують вторинні метаболіти та активність ферментів у дендробіумі моніліформному. Ind Crop Prod. (2016) 94:385–93. doi: 10.1016/j.indcrop.2016.08.041

33. Wang Y, Ren W, Li Y, Xu Y, Teng Y, Christie P та ін. Нецільовий метаболомічний аналіз для визначення впливу стресу ди (2-етилгексил) фталату на ексудати коренів люцерни (Medicago sativa). Sci Total Environ. (2019) 646:212– 9. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.07.247

34. Jia X, Sun C, Li G, Li G, Chen G. Вплив прогресуючого стресу від посухи на фізіологію, антиоксидантні ферменти та вторинні метаболіти Radix Astragali. Завод Acta Physiol. (2015), 37:262. doi: 10,1007/с11738-015- 2015-4

35. Поп’єр М.Дж., Мюллер Ф., Лі Х., Ріє І., Тікунов Ю.М., Віссер Р.Г.Ф. та ін. Нецільовий метаболомічний аналіз розвитку пилку томатів і реакції на тепловий стрес. Розмноження рослин. (2017) 30:81–94. doi: 10.1007/с00497-017-0301-6

36. Chen J, Ho C. Порівняння генерації летючих речовин у модельних системах серин/треонін/глутамін-рибоза/глюкоза/фруктоза. J Agr Food Chem. (1999) 47:643–7. doi: 10.1021/jf980771a

Конфлікт інтересів:

Автори заявляють, що дослідження проводилося за відсутності будь-яких комерційних або фінансових відносин, які можна було б витлумачити як потенційний конфлікт інтересів.

Примітка видавця:

Усі претензії, викладені в цій статті, належать виключно авторам і не обов’язково представляють претензії їхніх афілійованих організацій або видавництва, редакторів і рецензентів. Будь-який продукт, який може бути оцінений у цій статті, або претензії, які може зробити його виробник, не гарантуються та не схвалені видавцем.

Авторське право © 2021 Ай, Чжан, Лі, Сунь і Лю. Це стаття відкритого доступу, яка розповсюджується на умовах ліцензії Creative Commons Attribution License (CC BY). Використання, розповсюдження або відтворення на інших форумах дозволено за умови вказівки оригінального автора (авторів) і власника (власників) авторського права та цитування оригінальної публікації в цьому журналі відповідно до прийнятої академічної практики. Забороняється використання, розповсюдження або відтворення, яке не відповідає цим умовам.

For more information:1950477648nn@gamil.com