Анотація:ВикористанняCistanche deserticolaПаразитизуючи два рослини-господарі (галоксилоновий аммодендрон та каносці Atriplex) як тестові матеріали, це дослідження визначило вміст полісахариду в C. deserticola з різних господарів, використовуючи метод фенол-сульфурової кислоти. Транскриптомне секвенування та аналіз галоксилоно-кістанча таАсоціації Atriplex-Cistancheпроводили за допомогою платформи послідовності Illumina Novaseq 6000. Дослідження було зосереджене на дослідженні транскриптомових відмінностей у C. deserticola від різних господарів, скринінгу ключових ферментативних генів, що беруть участь у метаболізмі полісахариду та валідації вибраних генів за допомогою QRT-PCR-перевірки. Це дослідження має на меті забезпечити теоретичну основу для вивчення нових рослин -господарів та генетичного поліпшення C. deserticola. Результат показав, що вміст полісахариду, знайдений у Atriplex quadriptera-c.deserticola, був кращим до цього, присутнього в галоксилоновому аммодендрон-С. Deserticola. За допомогою порівняльного аналізу транскрипту 14089 диференційно експресованих генів (DEG) обстежувались із м'ясистих стебел Atriplex quadriptera-C. Deserticola та Haloxylon Ammodendron-C. Deserticola. Результати аналізу збагачення KEGG показали, що ці DEG найбільш помітно збагачені шляхами, пов'язаними з метаболізмом вуглеводів, метаболізмом галактози, метаболізмом амінокислот та метаболізмом жирних кислот. Крім того, загалом 26 градусів було отримано з чотирьох шляхів, пов’язаних з полісахаридним метаболізмом, серед яких рівні експресії гена фруктозидази та -галактозидази в галоксилоновому аммодендрон -С. Deserticola був значно вищим, ніж у atriplex quadriptera-c. Deserticola. Рівні експресії гена UDP-глюкози дегідрогенази та маннози -1- гена фосфатної гуанілатної трансферази в atriplex quadriptera-c. Deserticola був значно вищим, ніж у галоксилонових аммодендрон-С. Deserticola, який може бути ключовими ферментними генами для регулювання різниці полісахаридного метаболізму в C. deserticola.

Ключові слова Cistanche deserticola; транскриптомний послідовність; господарі; Різниця метаболізму полісахариду

Cistanche deserticola

 

Cistanche deserticola yc ma, в першу чергу розподілене вГансу, Сіньцзян, Нінгсая та Внутрішня Монголія, це традиційна китайська лікарська трава, яка нещодавно включена до"Лікарська та їжа гомологічна"Каталог. Він має різні переваги для здоров'я, такі якТоніфікуючи нирку Ян, живильна суть і кров, а також сприяння кишечником, робить його широко застосованою вМедицина, охорона здоров'я та харчова промисловість[1]. Завдяки йогогетеротрофічна природа, Cistanche deserticolaпаразитизує різні рослини -господаря, зГалоксилоновий аммодендроні нещодавно представленийНапівверезелений чагарникAtriplex canescens(Pursh) Nutt.будучи основними господарями.

Полісахариди є ключовими активними речовинами в оцінціCistanche deserticolaякість. За різних умов господаря,накопичення та метаболічний складнаЦистаншПолісахариди значно відрізняються [2]. Медичні дослідження продемонстрували, щоЦистаншПолісахариди володіютьАнтиоксидант, нейропротекторні, імуно-регулюючі та посилення пам’ятіфармакологічні ефекти, ефективно полегшуючиХвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона та дефіцит селезінки, спричиненої печінкою[3]. З просуванням у сучасномуМетоди вилучення та технології аналізу мульти-спектру,Зміст, склад та структурні характеристикинаЦистаншПолісахариди поступово з'ясовуються, розширюючи свої програми.

З точки зоруДослідження молекулярної біологіїнаЦистаншВиди, дослідження секвенування транскрипту в основному зосереджені наCistanche tubulosaіГалоксилон-ЦистаншСкладні системи.Наприклад,Hou et al.[4] виконаноПовнорозмірне транскриптом секвенування та профілювання експресії генівнаCistanche tubulosaвикористанняPacbio та bgiseq -500 технології RNA-SEQ, ідентифікація237 772 Унікальні стенограмита скринінг ключових генів ферментів, що беруть участь уБіосинтез фенілетаноїдного глікозиду. Так само,Feng та ін.[5] Проведенотранскриптомічні та метаболомічні аналізиХаусторії та сусідніх тканинГалоксилонові корені таЦистаншм'ясисті стебла, виявлення ролі господаря в накопиченніЦистаншметаболіти. Їх дослідження підкреслило, щоРослина господаря не тільки впливає на вихідЦистаншале також його якість. Однак дослідження щодоЦистаншПаразитизування різних рослин -господарів залишається обмеженим.

Atriplex canescens, a глибоко вкорінена і високостійка рослина, відрізняється від традиційногоГалоксилоновий господарі походить віднапівзасушливі плато Центральних Сполучених Штатів. Останніми роками він був введений і просувається якНовий господар дляCistanche deserticolaвирощуванняуПівнічно -Західний Китай. Цін та ін.[6] проаналізували та порівнялиНакопичення полісахаридуЦистаншпаразитизація галоксилону та atriplex canescensв одній області виробництва, пошукЗначні відмінності в вмісті полісахаридуміж двома умовами господаря.

Таким чином, це дослідження має на метіПослідовність м'ясистих стеблаCistanche deserticolaпаразитизація галоксилону та atriplex canescens, аналізуючиДиференціальна експресія ключових ферментів генів, що беруть участь у біосинтезі полісахариду. Отримані результати забезпечатьтеоретична основа для подальших досліджень щодоЦистаншПолісахаридні механізми біосинтезу, збагачення транскриптомічних досліджень на Atriplex-ЦистаншСистеми та сприяють інноваціям у високоякіснійЦистаншРесурси зародкової плазми.

 

Матеріали та методи

1.1 Експериментальні матеріали

Cistanche deserticolaЗразки паразитиГалоксилоновий аммодендроніAtriplex canescensбули зібрані зЦистаншОснова вирощування вМісто Сікан, графство Цзінтай, провінція Гансу(широта36 градусів 5 'н, довгота103 градус 42 'e.). ОбидваГалоксилоніAtriplex canescensкультивували в одному середовищі. Зразки були класифіковані якГалоксилон-Цистанш(Зразок А)іАтриплекс-Цистанш(Зразок h),з трьома повторами для кожної категорії (п’ять рослин на копію). Відбір проб проводився вКвітень 2024, і зразки були ідентифіковані якCistanche deserticolaм'ясисті цибулиниПрофесор Го ЙегонгвідКоледж сільського господарства, сільськогосподарський університет Гансу.

Слідом заКерівні принципи відбору проб Shanghai OE Biotech Co., Ltd.,ЦистаншМ’ясисті стебла промивали ультрабуковою водою, а зайву вологу видаляли за допомогою фільтрувального паперу. Тонкі шматочки взяли ззверху, середину та днокожного стебла, ретельно змішаний і розміщений у кріогенні флакони. Зразки булиШвидко замерзло в рідкому азотідля2 годиниперед тим, як переводити до-80 морозильна камераДля зберігання [7].

1.2 Експериментальні методи

1.2.1 Встановлення стандартної кривої та визначення вмісту полісахариду

A 10 мгзразокСтандарт D-глюкозибуло точно зваженим і розчиненим у100 мл об'ємна колбаз дистильованою водою для приготування100 мкг · мл⁻ розчину запасу. Калібрувальні рішення{{0}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 і 0,9 млрозчину запасу переносили в10 мл пробувних пробірків, розбавлений водою до1. 0 мл, а потім змішаний з1. 0 мл 6% фенольного розчинуі5 мл концентрованої сірчаної кислоти. Після вихору розчини нагрівали на киплячій водяній бані для20 хвилин, потім охолоджується у крижаній ванні для10 хвилин. A порожній контрольготували за допомогою1. 0 мл дистильованої водизамість розчину глюкози. Поглинання вимірювали при482 нмВикористання aУльтрафіолетовий спектрофотометрі aСтандартна кривагенерувався зконцентрація (x) як горизонтальна вісьіПоглинання (y) як вертикальна вісь.

Після модифікованого підходу відЛі Джі та ін. [8], 0. 2 г сушитьсяЦистаншпорошокбув точно зважений і поміщений у20 мл пробірка пробірки. 10 мл 80% етанолудодавали, і суміш піддавалиУльтразвукове вилучення при 80 градусах (100 Вт, 40 кГц) протягом 30 хвилин. Екстракт фільтрували під час гарячої, а процедуру повторювали один раз. Після висихання залишку,10 мл дистильованої водидодавали, і ультразвукову екстракцію повторювали двічі. Фільтрати поєднували та розбавляли до20 млз дистильованою водою.1. 0 мл цього рішенняще більше розбавляли до10 млз дистильованою водою.

A 1. 0 ml AliquotпідготовленогоЦистаншРозчин зразка аналізували за допомогою тієї ж процедури, що і стандарт глюкози. Поглинання при482 нмвимірювали, і вміст полісахариду вЦистаншз різних рослин -господарів розраховували.

1.2.2 Вилучення РНК, побудова бібліотеки кДНК та секвенування

Загальну РНК екстрагували зCistanche deserticolaЗразки паразитиГалоксилоновий аммодендроніAtriplex canescensза допомогоюКомплект РНК Tiangen DP441 (Китай), слідуючи заПротокол реагенту TRIZOL. Чистота РНК оцінювали за допомогоюСпектрофотометр Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, США), в той час як концентрацію та цілісність РНК оцінювали за допомогоюAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США).

Бібліотеки транскриптомів були побудовані за допомогоюVahts Universal V6 RNA-Seq бібліотека підготовка. Після контролю якості зAgilent 2100 Bioanalyzer, бібліотеки були секвенсовані наПлатформа Illumina Novaseq 6000, генерування150 bp знімання парного кінця.

1.3 Аналіз даних

1.3.1 Стенограма складання та функціональна анотація

Сирий читає вФормат FastQобробляли за допомогоюТримматичнийдля видаленняПрочитає Ploy-N та низькоякісні читання, в результатіЧисті читання. Послідовності адаптерів та низькоякісні області були видалені, а чисті зчитування були зібрані вконтиги(виражені теги послідовності) за допомогоюПрограмне забезпечення Trinity. Найдовша стенограма від кожного кластера була обрана якунігендля подальшого аналізу.

Функціональну анотацію унігенів проводили шляхом порівняння їх протиБаза даних білків NCBI (NR), швейцарська протока та еволюційна генеалогія генів: неконтрольовані ортологічні групи (яєчні) база данихвикористанняDiamond Software (e-value <1e -5). Анотація еукаріотичних ортологічних груп (KOG)проводили для ідентифікації гомологічних генів. Крім того, унігени були відображені вКіото Енциклопедія генів та геномів (KEGG)для анотації метаболічного шляху.Класифікація та функціональна анотація генної онтології (GO)проводили за допомогою відображення з бази даних Swiss-Prot.

1.3.2 Аналіз експресії генів та ідентифікація диференційно експресованих унігенів (DEG)

Рівні експресії генів кількісно визначали за допомогоюBowtie2Вирівняти чисті читання до унігенів. Значення експресії обчислювались якФрагменти на кілобазу стенограми на мільйон відображених зчитувань (FPKM)використанняЕкспрес -програмне забезпечення. Диференціальний аналіз експресії проводили за допомогоюПрограмне забезпечення Deseq2, зНегативні тести на розподіл біноміальноговикористовується для тестування значущості. Диференційно експресовані гени (DEG) визначали як ті, що маютьq-value <0. 05іЗміна складки (fc)> 2.

1.3.3 QRT-PCR Валідація диференційно експресованих генів

Ключові ферменти генів, що беруть участь уПолісахаридний біосинтеззЗначний диференціальний виразбули обрані дляКількісна перевірка ПЛР у режимі реального часу. Зразки РНК перевіряли якість, а значення ОД вимірювали перед зворотною транскрипцією. Синтез кДНК проводили за допомогоюТранскрипт All-in-One першої ланцюга синтезу кДНК SuperMix для QPCR Kit. Синтезовану кДНК розбавляли10- складати, і QRT-PCR проводили за допомогою aФлуоресцентна система QPCRв різних умовах велосипедного руху.ACTB (бета-актин) використовувався як внутрішній довідковий ген, а відносні рівні експресії генів розраховували за допомогоюМетод 2⁻ΔΔCT.

 

Таблиця 1 Послідовності праймерів

Ген ідентифікатор	Назва генів	Передній праймер (5 '-3')	Зворотний праймер (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	Gatagtggctacaacatccactt	Cctcctcttcgtcgtaggattc
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	PFP	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	UGDH	AAAGATCTTCAGTTCGTAAGC	Accaattcgttgatgctacc
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	лак	Gtctccttgttattcgtgaggat	Gtcgatggtggtgaagcagat
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	сачка	Ttacgaggatagtgaggtgcta	Aatggaagatgagaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	лак	Ggcacagtcaaggagtacgatg	Cactggcatcgacgaggaaag
-	Акт	Caatggatgatgatatcgccggt	Cactggcatcgacgaggaaag

 

 

1.4 Аналіз даних

Ієрархічний аналіз кластеризаціїДиференційно експресовані гени (DEG)проводили за допомогоюR (v3.2.0)Візуалізувати моделі експресії генів у групах та зразках. Go (ген онтології) аналіз збагачення таАналіз збагачення шляхів KEGG (Кіото Енциклопедія генів та геномів)проводили за допомогоюR, на основіГіпергеометричний розподіл. Значно збагачені функціональні терміни були відображені за допомогоюДіаграми, діаграми міхурів та графіки кола збагачення.

2 результати та аналіз

2.1 Результати визначення вмісту полісахариду

Рівняння лінійної регресії, отримане від вимірювань поглинання, було:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. 9963) y=0. 0154x - 0. 1636 \ Quad (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

з лінійним діапазоном20–90 мкг · мл⁻⁻. Точність, повторюваність, стабільність та швидкість відновлення вибірки були{{0}}. 38%, 0. 86%, 0,53%та 99,67%, відповідно.

ВимірянийПолісахаридне вмістуCistanche deserticolaЗразки з різних рослин -господарів були:

Галоксилон-Цистанш: 6.51%

Атриплекс-Цистанш: 11.83%

2.2 Послідовність транскриптомів та складання даних

Транскриптомний секвенуванняШість зразківгенерував усього41,77 г чистих даних. Дійсні дані на зразок варіювались6,89 г до 7,04 г., зБазові відсотки Q30 від 95,38% до 95,91%, іСередній вміст GC 45,13%.

Загалом61,423 Unigenesбули зібрані, із загальною довжиною65 962 858 bpіСередня довжина 1,073,91 bp.

2.3 Функціональна анотація генів

Загалом61,423 Unigenesбули отримані від послідовностіCistanche deserticolaЗразки паразитують два різних рослини -господаря. Результати анотації такі:

30 689 Unigenes (49,96%)були анотовані вБаза даних білка NR (не надмірна).

18 698 Unigenes (30,44%)були анотовані вБаза даних Swiss-Prot.

3998 Unigenes (6,51%)були анотовані вБаза даних KEGG.

17 188 Unigenes (27,98%)були анотовані вБаза даних KOG (еукаріотичні ортологічні групи).

25,280 Unigenes (41,16%)були анотовані вЯєчна (еволюційна генеалогія генів: неконтрольовані ортологічні групи) База даних.

16,210 Unigenes (26,39%)були анотовані вБаза даних GO (Gene Ontology).

16,153 Unigenes (26,30%)були анотовані вБаза даних PFAM (білки).

Серед них,21 650 Unigenesбули довше, ніж1 кб.

Аналіз гомології на основіБаза даних NRвиявив, що трьома найкращими найбільш близькими видами були:

Paulownia fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium kinoa (7,1%)

 

 

Таблиця 2 Інформація про анотаціюCistanche deserticolaФункція генів

База даних	Номер гена анотації	Частка (%)
Nr	30,689	49.96
Швейцарський	18,698	30.44
Кег	3,998	6.51
Ког	17,188	27.98
яєчний	25,280	41.16
Йти	16,210	26.39

 

 

2.4 GO та KEGG Функціональна анотація та класифікація

ЗБаза даних GO (Gene Ontology)використовувались для подальшого анотації унігенів, ідентифікованих уБаза даних NR, в результаті чого16 210 Unigenes. Ці унігени були класифікованіТри основні функціональні групи:

Біологічний процес (ВР)

Молекулярна функція (MF)

Клітинний компонент (CC)

УКатегорія біологічного процесу (ВР), найпоширенішими кластерами Unigene були:

"Клітинний процес" (11,023 Unigenes)

"Метаболічний процес" (9,117 Unigenes)

ДляКатегорія клітинної компонента (CC), 17 підкатегорійбули ідентифіковані, при цьому кожна підкатегорія містила щонайменше30 Unigenes. Найбільшими кластерами були:

"Клітина" (13 947 Unigenes)

"Частина клітини" (13 918 Unigenes)

УКатегорія молекулярної функції (MF), найбільш збагаченими функціональними групами були:

"Зв'язування" (10,039 Unigenes)

"Каталітична активність" (8,490 Unigenes)

Рис.2 Ідіть функціональну анотацію та класифікацію унігенів

 

Функціональна анотація та класифікація KEGG

Протягомтранскриптомний послідовність, загалом3998 Unigenesбули анотовані вБаза даних KEGG (Kyoto Encyclopedia генів та геномів). Ці унігени були класифікованіШість первинних категорій, з їх відповідними підрахунками та пропорціями наступним чином:

Клітинні процеси: 326 Unigenes (8.15%)

Обробка екологічної інформації: 299 Unigenes (7.47%)

Генетична обробка інформації: 1771 Unigenes (44.30%)

Людські захворювання: 14 Unigenes (0.35%)

Метаболізм: 1465 Unigenes (36.64%)

Організмні системи: 123 Unigenes (3.07%)

Ці шість основних категорій були додатково розділені20 рівнів вторинної класифікації. Серед них,Генетична обробка інформаціїмав найвищу частку, а за нимМетаболізм. ВсерединіМетаболізмКатегорія, найпоширенішими шляхами були:

Вуглеводний метаболізм

Метаболізм жирної кислоти

Флавоноїдний метаболізм

Фіг.3 Анотація метаболічного шляху Кегга

 

2.5 Диференціальна експресія генів та збагаченняCistanche deserticolaвід різних господарів

Дані про секвенування транскриптомів фільтрували за допомогоюКритерії вибору диференціального виразу за замовчуванням, в результаті ідентифікації14,089 диференційно експресованих генів (DEG):

6,576 генів були регульовані

7,513 генів були регульовані

A вулканбуло створено для візуалізації загального розподілу DEG.

УТоп -30 GO збагачувати функціональні класифікаціїЗ градусів було помічено, що:

Порівняно зБіологічний процес (ВР)іКлітинний компонент (CC)категорії,Молекулярна функція (MF)проявляв більш значне збагачення DEG.

Найбільш помітно збагачені DEG були пов'язані зМетаболізм нуклеїнової кислоти, метаболізм білка та ключові ферменти в метаболізмі галактози.

Крім того, DEG були значно збагаченіУмови, що стосуються метаболізму полісахариду, включаючи:

Метаболічний процес крохмалю

Біосинтетичний процес глікогену

Сахароза катаболічний процес

Активність глюкозидази

Активність синтази UDP-l-rhamnose

Полісахаридна гідролаза

Фіг.4 Вулканічна карта диференційно експресованих генів

 

Аналіз збагачення шляху Kegg у DEG вCistanche deserticolaвід різних господарів

Для подальшого дослідженняДиференційно експресовані гени (DEG)уCistanche deserticolaз різних рослин -господарів,Аналіз збагачення шляхів KEGGпроводили. Аналіз показав, що:

DEG були відображені на 117 метаболічних шляхів.

ЗТоп -20 шляхівпоказанийЗначне збагачення DEG, з найбільш збагаченими шляхами, включаючи:

Метаболізм жирної кислоти

-Віноленовий метаболізм

Галактозний метаболізм

Деградація лізину

Подальший аналіз збагаченняТоп-20 метаболічних категорій з найменшими Q-значеннямизазначив, що DEG значно збагачувались:

Організмні системи

Метаболізм

Генетична обробка інформації

Серед цих категорій,"Метаболізм"Мав найбільшу кількість збагачених DEG і показав найбільш значне збагачення. Крім того, на збагачених метаболічних шляхахЧастка регульованих та знижених регульованих унігенів майже була рівною.

Ці висновки говорять про те, щоМетаболічні шляхи відіграють вирішальну рольв диференціальній експресії генівCistanche deserticolaз різних рослин -господарів, особливо вЛіпід, вуглевод та амінокислотний метаболізм.