Загальні глікозиди та полісахариди Cistanche Deserticola запобігають остеопорозу

Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Fujiang Wang 1, Pengfei Tu, Kewu Zeng *, Yong Jiang **

АНОТАЦІЯ

Етнофармакологічна значимість:Традиційна китайська медицина Cistanche deserticola YC Ma має ефект «тонізування нирок і зміцнення кісток». Однак конкретні активні екстракти C. deserticola та механізми лікування остеопорозу не ясні.

Мета дослідження:Ми хотіли визначити ефективні компоненти екстрактів C. deserticola для лікування остеопорозу та потенційні механізми.

Матеріали та методи:Наша група досліджувала екстракти C. deserticola з антиостеопоротичною активністю, включаючи загальні глікозиди (TG), полісахариди (PS) і олігосахариди (OS) у мишей, схильних до прискореного старіння 6 (SAMP6). Для дослідження формування кісткової структури та відкладень кальцію було проведено фарбування за допомогою трихрому Голднера, Ван Гісона (VG), фарбування Safranin O-Fast Green та фарбування фон Косса. Відбирали сироватку для визначення біохімічних маркерів. Мікроархітектуру кістки виявлено за допомогою мікроКТ. Експресія кісткового морфогенетичного білка-2 (BMP-2), остеокальцину (OCN), остеопротегерину (OPG), рецепторного активатора ліганду ядерного фактора κ B (RANKL), кінази p-глікогенсинтетази{{11 }} (p-GSK-3) і p- -катенін аналізували методом вестерн-блоттингу та імуногістохімії.

Результати:ТГ і ФС зменшували гістопатологічні пошкодження кісток, сприяли утворенню нової кістки, колагенових волокон і хондроцитів і прискорювали відкладення кальцію. Крім того, вони значною мірою змінили біомаркери обміну кісток і ефективно покращили мікроархітектуру кісток. Подальші дослідження механізмів показали, що TGs і PSs значно знижують експресію RANKL, p- -catenin, а також посилюють експресію BMP-2, OCN, OPG і p-GSK{{ 4}} (Ser9).

Висновок:Результати цього дослідження свідчать про те, що ТГ і ФС можуть сприяти остеокластогенному формуванню кісток і покращувати пошкодження мікроструктури кісток у мишей SAMP6, а їх терапевтичний ефект при остеопорозі здійснюється через активацію сигнального шляху Wnt/-катенін.

Цистанче можесприяють остеокластогенній кістціформування та вдосконаленняпорушення мікроструктури кісток.

1. Введення

Остеопороз є поширеним захворюванням у людей похилого віку, яке серйозно загрожує здоров’ю людства (Ye et al., 2020). Пацієнти з остеопорозом можуть бути абсолютно безсимптомними до перелому, тому ефективна профілактика та лікування остеопорозу є найважливішими (Tella and Gallagher, 2014).

Дослідження показують, що посилення резорбції кісткової тканини та зменшення формування кісткової тканини призводять до дисбалансу в ремоделюванні кісткової тканини, що призводить до остеопорозу (Sims and Gooi, 2008). Остеобласти та остеокласти є двома типами клітин, які мають вирішальне значення для формування та резорбції кісток. Шлях wnt/-catenin необхідний для росту, розвитку та підтримки кісткової тканини (Cadigan and Nusse, 1997), а також відіграє ключову роль у регуляції диференціації стромальних клітин кісткового мозку собаки породи бігль (Jing et al. , 2018). GSK-3 запобігає деградації -катеніну. -Катенін згодом потрапляє в ядро, а потім може зв’язуватися з Т-клітинним фактором/фактором зв’язування лімфоїдного енхансера та регулює експресію цільових генів Wnt. Тим часом виявлено, що передача сигналів Wnt/-catenin знижує диференціювання остеокластів шляхом стимулювання виробництва та секреції OPG (Glass et al., 2005), який є природним антагоністом RANKL (Lacey et al., 1998). OPG відіграє важливу регуляторну роль у формуванні кісткової тканини та її резорбції. У будь-якому випадку видалення -катеніну в остеокластах збільшує кількість остеокластів і резорбцію кісток і зменшує кісткову масу (Wei et al., 2011). Інгібітори кісткової резорбції та стимулятори формування кісткової тканини в основному використовуються для лікування остеопорозу. Враховуючи, що побічні реакції лікарських засобів, які зараз використовуються в клінічній практиці з точною ефективністю, також очевидні, необхідно терміново шукати препарати з меншою кількістю побічних ефектів.

Cistanche deserticola YC Ma (C. deserticola) є одним із вихідних рослин широко використовуваної тонізуючої традиційної китайської лікарської трави Cistanches Herba, Roucongrong по-китайськи, для лікування кількох захворювань, таких як ниркова недостатність, жіноче безпліддя та старечий запор для більше 1000 років у Китаї (Національний фармакопейний комітет, 2020). Згідно з теоріями традиційної китайської медицини (ТКМ), «кістки, що домінують у нирках» і «кістки, що тонізують нирки, зміцнюють кістки», C. deserticola використовувався для лікування остеопорозу. Дослідження показали, що C. deserticola може підвищувати рівень лужної фосфатази (ALP), остеокальцину та іонів кальцію в сироватці крові, сприяти експресії BMP-2 в остеобластах щурів (Gang et al., 2018). Крім того, дослідження показали, що C. deserticola виявляє захисну дію проти індукованого RANKL остеокластогенезу (Zhang et al., 2019). Хоча C. deserticola має терапевтичний ефект при остеопорозі, його конкретні активні компоненти не дуже зрозумілі. Дуже важливо вивчити типи ефективних компонентів C. deserticola для лікування остеопорозу та пов’язаних з ним механізмів.

Таким чином, ми провели це дослідження, щоб визначити, чи є деякі корисні ефекти екстрактів, що містять різні типи хімічних компонентів з C. deserticola, на мишей SAMP6. Результати відкриття можуть дати точні вказівки для клінічного застосування C. deserticola, а також розкрити матеріальну основу C. deserticola для лікування остеопорозу.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімічні речовини та реактиви

Cistanche deserticola YC Ma було придбано у Mandela Biotechnology Co., Ltd (Алашань, Внутрішня Монголія, Китай), а потім одна особа з авторів ідентифікувала їх (PF Tu). ТГ, ФС та ОС готували за згаданим раніше методом (Gao et al., 2015). Аналіз компонентів кожного екстракту проводили за допомогою ВЕРХ відповідно до звіту. (Лі та ін., 2019; Ван та ін., 2020). Набори H&E, трихромного фарбування за Голднером, фарбування за Ван Гісоном (VG) і Safranin O-Fast Green були придбані у Boster (Хубей, Китай). Кролячі антимишачі BMP-2 (ab14933), OCN (ab93876), OPG (ab183910) і RANKL (ab216484) були придбані у Abcam (Кембридж, Великобританія). Технологія клітинної сигналізації була джерелом кролячих антимишачих p-GSK-3 (Ser9) (#5558), GSK3 (#12456), -катеніну (#13727) і p- -катеніну (# 4176). Вторинні антитіла були придбані у Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Пекін, Китай).

Високоякісний екстракт цистанкивідChengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd

2.2. Тварини

5-місячних самок мишей із прискореним старінням/резистентних 1 (SAMR1) і SAMP6 мишей було отримано від Vital River Laboratory Animal Technology (Пекін, Китай). Усі маніпуляції з тваринами проводилися відповідно до вказівок, виданих Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Наукового центру охорони здоров’я Пекінського університету.

2.3. Введення препарату

Мишей випадковим чином розділили на наступні п'ять груп: група SAMR1 (нормальний фізіологічний розчин, n=10); група SAMP6 (фізіологічний розчин, n =10); група ТГ (400 мг/кг, n=10); Група PS (400 мг/кг, n=10) і група OS (400 мг/кг, n=10) (Gao et al., 2015). Усі препарати вводили ig та щодня протягом 12 тижнів.

2.4. Трихромне фарбування за Голднером, фарбування H&E, фарбування SafraninO-Fast Green та фарбування за Ван Гісоном (VG)

Через 12 тижнів стегнові кістки швидко видаляли та фіксували за допомогою 10% етилендіамінтетраоцтової кислоти (EDTA) протягом 7 днів при 4 ◦C. Потім стегнові кістки розрізали на зрізи (5 мкм) і фарбували Goldner Trichrome, Van Gieson (VG), SafraninO-Fast Green і H&E, дотримуючись інструкцій виробника. Зображення спостерігали за допомогою світлового мікроскопа (Leica, Solms, Німеччина).

2.5. Вимірювання рівнів BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr і Pyr

Концентрації кісткового білка gla (BGP), кісткової специфічної лужної фосфатази (BALP), проколагену типу 1 N-кінцевого пропептиду (P1NP), проколагену типу I C-кінцевого пропептиду (PICP), лужної фосфатази (ALP), S–C -телопептид колагену I типу (S-CTX), стійка до татрату кисла фосфатаза (TRACP), U–C-телопептид колагену I типу (U-CTX), U–N-телопептид типу I- колаген (U-NTX), D-піридинолін (D-Pyr) і піридинолін (Pyr) визначали за допомогою імуноферментного аналізу (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Jiangsu, China).

2.6. Фарбування по фон Косса

Зрізи стегнової кістки занурювали в 1% нітрат срібла на 30 хв під інтенсивним сонячним промінням, а потім тричі промивали деіонізованою водою. Згодом додавали 5% тіосульфату натрію на 5 хвилин для видалення срібла, що не прореагувало. Солі фосфату кальцію візуалізувалися як чорне фарбування. Для кількісного аналізу вмісту кальцію в стегновій кістці використовували програмне забезпечення Image-Pro Plus версії 6.0 та Adobe Photoshop.

2.7. Мікрокомп'ютерна томографія

Усі зразки стегнової кістки сканували з роздільною здатністю 9 мкм за допомогою сканера мікроКТ (PerkinElmer, MA, США). Подальший аналіз проводився за допомогою програмного забезпечення Analyze12.0 для розрахунку мінеральної щільності кісткової тканини (МЩКТ), об’єму кістки/загального об’єму (BV/TV), трабекулярного числа (Tb. N), трабекулярного відділення (Tb. Sp), товщина трабекули (Tb. Th) і мінеральна щільність тканини (TMD). Тривимірні зображення реконструювали за допомогою програмного забезпечення CTVox (PerkinElmer, MA, США).

2.8. Накопичення тетрацикліну і кальцеїну

Кожній тварині внутрішньочеревно вводили 25 мг/кг тетрацикліну та 5 мг/кг кальцеїну на 13-й день і 3-й день перед евтаназією відповідно. Накопичення тетрацикліну та кальцеїну досліджували за допомогою автоматизованої системи кількісної візуалізації Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, Массачусетс, США). Відстань між тетрацикліном і кальцеїном можна спостерігати за допомогою програмного забезпечення Image-Pro Plus версії 6.0.

2.9. Вестерн-блоттинг

Тканини стегнової кістки гомогенізували та лізували в буфері для лізису RIPA. Концентрацію білка визначали за допомогою набору реагентів для аналізу білка біцинхонінової кислоти (BCA) (Beijing TransGen Biotech, Пекін, Китай). Загальні білки завантажували на 10- або 12-відсотковий гелі SDS-PAGE, а потім переносили на нітроцелюлозну мембрану. Мембрану блокували, а потім інкубували протягом ночі з первинними антитілами та GAPDH (Лос-Анджелес, США) при 4 ◦C з подальшою інкубацією з вторинними антитілами. Смуги аналізу білків аналізували за допомогою Tanon 5200 Multi (Шанхай, Китай).

2.10. Імуногістохімічний аналіз

Зрізи тканин стегнової кістки інкубували з первинними антитілами при 4 ◦C. Поліклональні антитіла проти BMP-2, OCN, OPG і RANKL розводили до 1:200 і 1:100 відповідно. Вторинне антитіло миші проти IgG кролика (1:200) при 37 ◦C протягом 1 год. Використання автоматизованої системи кількісної візуалізації Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, Массачусетс, США). Для кількісного аналізу експресії білка застосовували програмне забезпечення Image-Pro Plus версії 6.0 та Adobe Photoshop.

2.11. Статистичний аналіз

Результати виражені як середнє значення ± стандартне відхилення. Односторонній дисперсійний аналіз проводився під час порівняння різних груп. Для статистичного аналізу було використано програмне забезпечення SPSS версії 22.0, і P < 0.05="" вважалося="" статистично="">

cistanche reddit

3. Результати

3.1. ТГ і ФС покращують гістопатологічні пошкодження кісток і сприяють утворенню колагенових волокон і хондроцитів у мишей SAMP6

Патологічне пошкодження стегнової кістки можна спостерігати за допомогою фарбування H&E. Гістоморфологічні структури кістки в групі SAMR1 розташовані регулярно. Однак згадані вище структури кістки були пошкоджені в групі SAMP6. Морфологічні зміни в групах ТГ і ПС були меншими, ніж у групі SAMP6. Однак група лікування ОС не показала значного поліпшення морфологічних змін (рис. 1A). Для виявлення формування кісткової структури було проведено фарбування трихромом за Голднером, Ван Гісоном (VG) і Safranin O Fast Green. Результати показали, що нова кістка, колагенові волокна та хондроцити в групах TGs та PSs були покращені порівняно з групою SAMP6. Однак у групі лікування OSs не було виявлено значного поліпшення змін кісткової структури (рис. 1B–D).

Рис. 1. TGs і PSs полегшують гістопатологічні пошкодження у мишей SAMP6.

3.2. ТГ і ПС змінюють біомаркери обміну кісток у мишей SAMP6

При виникненні остеопорозу рівні біомаркерів формування кісткової тканини, таких як сироватковий BGP і PICP, будуть значно знижені. Навпаки, рівні біомаркерів, пов’язаних з резорбцією кісткової тканини, були значно підвищені, включаючи сироваткові TRACP і S-CTX (рис. 2). Відрадно те, що групи TG і PSs могли змінити рівні BGP, BALP, P1NP, PICP, ALP, S-CTX, TRACP, U-CTX, U-NTX, D-Pyr і Pyr, але ОС не могли.

Рис. 2. Вплив TG та PS на біомаркери обміну кісток у мишей SAMP6.

3.3. ТГ та ФС сприяють формуванню нової кістки та відкладенню кальцію у мишей SAMP6

Щоб перевірити, чи може обробка TG, PS та OSs сприяти утворенню кісткової тканини та відкладенню фосфатних мінералів, було проведено мічення тетрацикліном кальцеїну та фарбування по фон Коссі. Результати показали, що утворення нової кістки у мишей SAMP6 було значно нижчим, ніж у мишей SAMR1, тоді як TG та PS значно сприяли утворенню нової кістки (рис. 3A). Фарбування по фон Коссі показало, що багато кальцію відкладалося в групах лікування ТГ і ПС (рис. 3B).

Рис. 3. TG та PS сприяють утворенню нової кістки та відкладенню мінералів у мишей SAMP6.

3.4. TGs і PSs покращують мікроархітектуру кісток у мишей SAMP6

Мікроархітектуру кістки виявлено за допомогою мікроКТ. Порівняно з мишами SAMR1, миші SAMP6 мали більш погіршену мікроархітектуру, тоді як стан кісток у мишей, які отримували TGs і PSs протягом 12 тижнів, покращився (рис. 4). Ми також виявили, що індекси МЩКТ, BV/TV, Tb.N і Tb. Th були знижені і показники Tb. Sp і TMD були збільшені у мишей SAMP6 порівняно з такими у мишей SAMR1. ТГ і ПС значно підвищували МЩКТ, БВ/ТВ, ТБ. N, Tb. Th і зниження Tb. Sp і TMD порівняно з мишами SAMP6. Однак суттєвих змін у групі ОС не спостерігалося.

3.5. TG та PS змінюють експресію BMP-2, OCN, OPG та RANKL у мишей SAMP6

Ми перевірили експресію білків BMP-2, OCN, OPG і RANKL. TGs і PSs індукували помітну активізацію BMP-2, OCN і OPG, тоді як експресія RANKL була знижена (рис. 5). Однак істотної різниці в групі терапії ОС не було.

Рис. 4. Вплив ТГ і ФС на мінеральну щільність кісток і мікроархітектуру кісток.

3.6. TGs і PSs змінюють експресію p-GSK-3 (Ser9) і p- -catenin у мишей SAMP6

Щоб зрозуміти механізми TG і PS, що сприяють остеобластогенезу, експресію p-GSK-3 (Ser9) і p- -catenin у кісткових тканинах мишей SAMP6 вимірювали за допомогою вестерн-блоттингу (рис. 6). Результати показали, що лікування TGs і PS помітно покращило експресію p-GSK-3 (Ser9) і зменшило експресію p- -catenin у стегновій кістці порівняно з групою SAMP6. Однак у групі лікування ОС не спостерігалося істотних змін.

4. Обговорення

У поточній роботі використовують мишей SAMP6 і SAMR1 для пошуку ефективних компонентів C. deserticola проти остеопорозу. Три екстракти C. deserticola були використані для оцінки терапевтичних ефектів, а також можливих механізмів. Крім того, також аналізували експресію RANKL, OPG, OCN і BMP-2, а також інших регуляторів резорбції кісткової тканини. Порівняно з групою SAMP6, ТГ і ФС можуть покращити гістопатологічне пошкодження кістки, а також сприяти утворенню нової кістки, колагенового волокна, хондроцитів і відкладення кальцію. Тим часом обидва можуть змінювати біомаркери обміну кісткової тканини та ефективно покращувати мікроструктуру кістки. Однак жодних захисних ефектів лікування ОС не спостерігалося.

Рис. 5. TG і PS сприяють експресії BMP-2, OCN і OPG і знижують експресію RANKL.

ТКМ широко використовуються для полегшення симптомів багатьох захворювань, таких як остеопороз. полегшує різні симптоми захворювань, включаючи остеопороз. Численні антиостеопорозні біологічно активні сполуки були виявлені в десятках натуральних китайських лікарських трав, які зазвичай використовуються для тонізування нирок, а також для збереження ниркової есенції (Xu et al., 2017; Liu et al., 2018). C. deserticola володіє відносно високою безпекою і широким спектром терапевтичних функцій для лікування ниркової недостатності. Багато досліджень виявили терапевтичні ефекти екстрактів C. deserticola на остеопороз (Li та ін., 2012; Liang та ін., 2013; Song та ін., 2018).

Остеобласти, що формують кістку, і остеокласти, що резорбують кістку, були отримані з диференціації мультипотенційних мезенхімальних стовбурових клітин (MSC), є кінцево диференційованими клітинами з коротким життям (Teitelbaum and Ross, 2003). Обидва вони потребують постійної заміни новими, отриманими зі стовбурових клітин (Long, 2011). Сигнальний шлях Wnt/-catenin, який відіграє важливу роль у диференціації кісткових тканин, стимулює вироблення остеобластів, сприяючи орієнтації та диференціації мультипотенційних МСК в остеобласти (Rodda and McMahon, 2006). Крім того, Wnts запобігають апоптозу зрілих остеобластів і, таким чином, подовжують їх тривалість життя як залежним, так і незалежним шляхами (Almeida et al., 2005). Таким чином, сигнальний шлях Wnt/-catenin відіграє важливу роль у з’ясуванні патогенезу остеопорозу. У цьому експерименті мишей SAMP6 використовували для вивчення ефективності антиостеопорозних засобів з різних екстрактів C. deserticola. ТГ і ФС значно знижували рівні RANKL і p- -катеніну та посилювали експресію BMP-2, OCN, OPG і p-GSK-3. Підводячи підсумок, терапевтичний ефект TGs і PSs на мишей SAMP6 був в основному через активацію сигнального шляху Wnt/-catenin.

Оскільки надмірне поглинання остеокластів є важливою причиною остеопорозу, фактори, пов’язані з активацією та диференціюванням остеокластів, можна розглядати як важливі цілі для запобігання втраті кісткової маси (Takatsuna та ін., 2005). У нашому дослідженні експресія RANKL була помітно знижена, в той же час рівень OPG міг підвищуватися за допомогою TGs і PS. Було добре задокументовано, що процес формування кістки та ремоделювання диференціації клітин остеобластів характеризується головним чином підвищеною експресією BMP-2 та OPN (Canalis, 2009). У цьому дослідженні ми виявили, що ТГ і ФС C. deserticola підвищують експресію BMP-2 і OPG і покращують мінералізацію кісток. Таким чином, TGs і PSs опосередковують формування кісток шляхом активації BMP-2 і OPN і зниження рівня RANKL.

Маркери кісткоутворення відображають активність кісткоутворюючих клітин, такі ж маркери кісткової резорбції відображають активність остеокластів. Мікроархітектура погіршується внаслідок змінених маркерів обміну кісткової тканини. У нашому дослідженні маркери резорбції кісткової тканини (S-CTX, TRACP, U-CTX, D-Pyr, U-NTX, Pyr) були значно знижені в групах ТГ і ПС, навпаки, маркери формування кісткової тканини (BGP, BALP). , P1NP, PICP, ALP) помітно зростає. Таким чином, можна побачити, що ТГ і ФС C. deserticola сприяють реконструкції остеопоротичної кістки.

Шлях Wnt/-катеніну стимулює експресію маркерів диференціації остеобластів і мінералізацію, водночас він активує експресію основного остеогенного фактора BMP-2 в остеобластах (Zhang et al., 2013). Крім того, -катенін збільшує експресію OPG в остеобластах, які опосередковано пригнічують диференціацію остеокластів шляхом інгібування резорбції кістки (Baron and Kneissel, 2013). Наше нинішнє дослідження показує, що ТГ і ФС значно підвищують рівень p-GSK-3 і знижують рівень p- -катеніну. Ці результати підтверджують висновок про те, що антиостеопорозна функція ТГ і ФС регулюється через активацію сигнального шляху Wnt/-катенін.

Наш попередній аналіз ВЕРХ показав, що п’ять фенілетаноїдних глікозидів, включаючи ехінакозид, цистанозид А, актеозид, ізоактеозид і 2′-ацетилактеозид, були основними компонентами ТГ (Li et al., 2019; Shi et al., 2019). Структури вищезгаданих п’яти фенілетаноїдних глікозидів були багаті фенольними гідроксильними групами, які відповідають за антиоксидантні властивості C. deserticola (Chen та ін., 2016). Повідомлялося, що покращення антиоксидантної системи може запобігти втраті кісткової маси, таким чином ці фенілетаноїдні глікозиди можуть бути потенційними активними компонентами C. deserticola, відповідальними за антиостеопоротичну активність. Є повідомлення про те, що ехінакозид і актеозид можуть полегшити типові патологічні ознаки остеопорозу, такі як покращення якості кісток і загальної МЩКТ стегнової кістки, сприяння формуванню кісток і пригнічення резорбції кісток (Chen et al., 2020). Крім того, ехінакозид має вражаючий антиостеопоротичний ефект (Li et al., 2013). Попередні дослідження показали, що цистанозид А може сприяти формуванню кісток і запобігати резорбції кісток шляхом інгібування NF-κB і активації шляхів PI3K/Akt (Xu et al., 2017). Про антиостеопоротичний ефект полісахаридів C. deserticola не повідомлялося. Однак інші дослідження показали, що полісахариди астрагалу можуть пригнічувати експресію RANKL, підвищувати рівень OPG у сироватці крові та, нарешті, блокувати диференціацію остеокластів (Huo and Sun, 2016; Hwang et al., 2018). ОС C. deserticola в основному складається з маніту, бетаїну, фруктози, глюкози та сахарози (Shi et al., 2019), які не мають звіту про антиостеопоротичну активність, тому ОС не має терапевтичного ефекту при остеопорозі. Таким чином, ТГ і ФС є активними компонентами в C. deserticola для ефекту проти остеопорозу.

Cistanche herba добавки порошокмаєантиостеопорозний ефект.

Для отримання додаткової інформації натисніть тут.

5. Висновки

Підсумовуючи, TGs і PSs з C. deserticola можуть посилювати формування кісток у мишей SAMP6 шляхом регулювання Wnt/-catenin сигнального шляху, але не OSs. У майбутньому ТГ і ФС можуть стати перспективними терапевтичними засобами для захисту кісток від остеопорозу.