Толерантність до NADH/NAD плюс дисбаланс передбачає старіння та втручання проти старіння

Будь ласка зв'яжітьсяoscar.xiao@wecistanche.comдля отримання додаткової інформації

РЕЗЮМЕ

Окисно-відновні пари координують клітинну функцію, але наслідки їх дисбалансу неясні. Це певною мірою пов'язано з обмеженнями їх експериментального кількісного визначення. Тут ми обходимо ці труднощі, представляючи підхід, який характеризує профілі толерантності на основі фітнесу до дисбалансу окисно-відновної пари, використовуючи представлення метаболізму в силіконі. Зосереджуючись на окислювально-відновній парі NADH/NAD1 у дріжджах, ми демонструємо, що відновна дисбаланс створює метаболічні синдроми, які можна порівняти з тими, що спостерігаються в ракових клітинах.переваги екстракту цистанчіСтійкість дріжджових мутантів до окисно-відновної рівноваги також може пояснити 30 відсотків мінливості їх експериментально виміряної хронологічної тривалості життя. Крім того, передбачаючи важливість деяких метаболітів для підтримки дисбалансу, ми правильно визначаємо поживні речовини, що лежать в основі механізмів патології, молекули, що захищають тривалість життя, або імітатори обмеження калорійності. Толерантність до окислювально-відновних дисбалансів стає, таким чином, надійною основою для розпізнавання властивостей фенотипу старіння, яка відповідає біологічному обґрунтуванню для оцінки втручань проти старіння.

ВСТУП

Дослідження окисно-відновного гомеостазу суттєво розширилися за останні два десятиліття, постійно змінюючи класичні уявлення про окисне пошкодження клітин (Halliwell and Gutteridge, 2015). Серед найбільш парадигматичних молекулярних агентів, що лежать в основі цього гомеостазу, виділяються співвідношення окислювально-відновних пар, таких як кон’юговані форми глутатіону, NADPH і NADH. І глутатіон, і НАДФН діють як важливі механізми поглинання активних форм кисню (АФК) у мітохондріях, тоді як НАДФН і НАДН поєднують анаболічні та катаболічні шляхи відповідно з окисно-відновним станом клітини.

Натисніть тут, щоб дізнатися більше

Незважаючи на це, нові механізми, що зв’язують пари NADPH/NADP* і NADH/NAD* з окисно-відновним гомеостазом, продовжують визнаватися. Наприклад, баланс NADPH/NADP плюс частково пояснює наслідки протеїнкінази, активованої AMP, для виживання (She et al., 2014). Крім того, він пов’язує циркадний час з окисно-відновними станами (Rey et al., 2016). Наразі вважається, що співвідношення NADH/NAD плюс бере участь у координації мітохондріальної та ядерної функції, епігенетичній регуляції відновлення ДНК та клітинної ідентичності, а також у налаштуванні енергетичного метаболізму на змінні навколишнього середовища (Canto та ін., 2015; Gomes та ін. 2013). У непатологічних станах співвідношення NADH/NAD* коливається залежно від напруги кисню, з гіпоксичними умовами та більш високою доступністю кисню, відповідно, з відновними та окисними відхиленнями (Clanton, 2007; Graef et al., 1999).

Але зростаючий інтерес до коефіцієнтів окисно-відновних пар головним чином походить від їх впливу на патологію.Cistanche ЧингісханПоява АФК як у відновному (гіпоксичний, схильний до НАДН), так і в окисному (гіпероксичний, схильний до НАД плюс) сенсах пов’язана з відхиленнями від оптимального окисно-відновного потенціалу, який забезпечує найкращу продуктивність мітохондрій (Aon et al., 2010). ; Клентон, 2007). Що стосується раку, то зниження NADH/NAD плюс може лежати в основі летальності гліобластом (Gujar et al., 2016) і сприяти прогресуванню раку товстої кишки (Hong et al., 2019), але воно також може врятувати деякі здорові фенотипи різною мірою в клітинах від інші типи пухлин (Garrido and Djouder, 2017).

Cistanche може омолоджувати старіння

NADH також став об'єктом інтересу в біології Торонто. У цьому контексті збільшення пулу NAD plus призвело до часткового скасування старіння та інших пов’язаних патологічних фенотипів в організмах (Das et al., 2018; Mendelsohn and Larrick, 2014; Wei et al., 2017; Zhu et al. , 2017), а старіючі та неопластичні клітини демонструють дисбаланс співвідношення НАДН/НАД плюс (Braidy та ін., 2011; Шварц та Пассонно, 1974; Уайлі та ін, 2016). Крім того, нещодавно відкрита роль NADPH і нова концепція NADH/NADH як головного регулятора окисно-відновного гомеостазу та старіння відповідають теорії метаболічної стабільності старіння (Demetrius, 2004). Ця теорія припускає, що причиною старіння є вразливість стаціонарних рівнів окислювально-відновних пар до випадкових збурень навколишнього середовища на швидкості реакції ферментів, і робить кілька цікавих прогнозів, які стосуються людей.

Враховуючи всі ці наслідки, багато досліджень досліджували феноменологію співвідношення окисно-відновних пар або шляхом пасивного звітування про їхні рівні, або шляхом їх активної модифікації. Проте експериментальні маніпуляції є складними. Найбільш традиційні звинувачують глибокі експериментальні застереження (Sun et al., 2012), а новіші все ще пропускають певні біологічні обставини через те, що вони обмежені інтервалами температури та pH (Hung et al., 2011; Zhao et al., 2015). Крім того, експериментально дорого відслідковувати широкий спектр фенотипів після зміни пулів коферментів шляхом додавання метаболітів (Hou et al., 2010) і мутацій або надмірної експресії ферментів, що споживають NAD(H) (Bait al., 2011; Феліпе та ін., 1998). Таким чином, існує потреба в альтернативних стратегіях для контролю окисно-відновного гомеостазу шляхом маніпулювання окисно-відновними парами, а також у нашому розумінні біологічних наслідків цього контролю.

Моделі in silico стають практичною дослідницькою стратегією кожного разу, коли експериментальні підходи обмежені, з перевагою уможливлення повного механічного обліку спостережуваних явищ. Метаболічні моделі в масштабі генома, які можна вивчати за допомогою аналізу балансу потоків (FBA) (Orth та інші, 2010), стали стандартом у системній біології для вивчення наслідків метаболічних збурень для клітинної функції (методи S1). Серед інших внесків вони допомогли у відкритті нових антибіотиків і хіміопрепаратів, створенні штамів бактерій, оптимізованих для промислового виробництва речовин, що представляють інтерес, і кращому розумінні метаболічних захворювань людини (Burgard et al., 2003; Pagliarini et al. 2016; Раман та ін., 2009). Використання FBA має додаткову перевагу, оскільки забезпечує розуміння метаболічних явищ без впливу неметаболічних факторів (генетичних, епігенетичних, механічних тощо). Таким чином, метаболічні моделі в масштабі генома особливо добре підходять для вивчення метаболічних наслідків відхилень від окисно-відновного гомеостазу.

Тут ми використовуємо FBA для дослідження балансу окисно-відновних пар на реконструкції масштабу генома одноклітинного еукаріота Saccharomyces cerevisiae, за допомогою чого ми характеризуємо метаболічні та пов’язані з довголіттям наслідки контрольованого збурення доступного NADH/NAD плюс потоку через різні генетичні фони. Більш конкретно, наші результати показують, що толерантність до цього дисбалансу призводить до специфічного метаболічного перенаправлення, що нагадує патологію, а також пояснює більше чверті внутрішньовидової мінливості постмітотичної тривалості життя. Крім того, ця структура допомагає нам окреслити обчислювальний протокол (який ми також застосовуємо до моделей метаболізму тварин і людини) для ідентифікації метаболітів і ферментів, потенційно терапевтичних мішеней у контексті вікових патологій.

РЕЗУЛЬТАТИ

Профіль толерантності на основі фітнесу характеризує збурення редокс пари

Щоб представити дисбаланс між кон’югатними формами окисно-відновної пари, ми включили штучну оборотну реакцію — «реакцію дисбалансу» — у реконструкцію масштабу геному відповідної метаболічної мережі (методи STAR). Реакція окислює або відновлює пару, розглядаючи конкретні клітинні компартменти (наприклад, цитозоль, мітохондрії тощо), і її активність може бути зафіксована на будь-якому бажаному значенні швидкості. Для будь-якого з цих значень можна обчислити швидкість росту ("придатність"), яка діє як проксі для стійкості дріжджової клітини до конкретного стану. Нарешті, профіль толерантності визначається шляхом обчислення швидкості росту для діапазону значень дисбалансу (рис. 1A; зверніть увагу, що відновні/окиснювальні умови представлені синім/червоним кольором, відповідно, у всьому рукописі).

Профілі толерантності зазвичай демонструють максимальне зростання навколо точки нульового дисбалансу, при цьому приблизно будь-яке відхилення (тобто ненульове значення реакції) призводить до зниження придатності. Це підкреслює той факт, що для того, щоб метаболізм працював, активність реакцій, які регулюють співвідношення окислювально-відновних пар, в одному сенсі, повинна бути пропорційна активності тих, що регулюють його в іншому. Точніше, цитозольний дисбаланс NADH/NADt у S.подовження життя cistanchecerevisiae, що ростуть на глюкозі та в аеробних умовах, дають профіль із максимальним зростанням, значно зміщеним у бік окиснення в точці профілю дисбалансу, де ~50 ммоль/ДВ/год NADH перетворюється на NADH (рис. 1B). Розглядаючи натомість дисбаланс у мітохондріях, ми спостерігали максимум у точці нульового дисбалансу (Малюнок 1C), модель, яку ми подібним чином спостерігали в інших профілях (Малюнок S1). Загалом стають редукційні умови

Рисунок 1. Профіль толерантності характеризує реакцію на окисно-відновний дисбаланс

(A) Зверху. Ми запровадили штучну реакцію в модель метаболічної реконструкції організму (у цьому випадку дріжджів) для взаємоперетворення двох кон’югованих форм окисно-відновного коферменту (тут пари NADH/NADH). Для кожної із серії умов дисбалансу, тобто значень швидкості штучної реакції, ми застосовуємо аналіз балансу потоку для обчислення швидкості зростання. Дно. Прогнозовані значення зростання наносяться на графік проти значень швидкості дисбалансу, який окреслює профіль толерантності; проксі для толерантності метаболізму при зіткненні з вибраним порушенням.cistanche нз(B) Профіль толерантності в дріжджах, пов’язаний з дисбалансом, розташованим у цитозолі.

(C) Профіль толерантності в дріжджах, пов’язаний з дисбалансами, розташованими в мітохондріях. Синє/червоне затінення представляє режими зниженого та окисленого дисбалансу відповідно, а сірі крапки вказують на значення, що відповідають відсутності дисбалансу або екстремальному відновному/окислювальному дисбалансу, що не призводить до росту. шкідливий і летальний швидше, ніж окислювальні режими. У двох випадках (кон’юговані пари цитозольного NADH або мітохондріального тіоредоксину) м’яке штучне окислення пари покращує ріст (рис. S1).

Порушення NADH/NAD* викликають метаболічні синдроми, що нагадують патологію

Енергетичний метаболізм дріжджів без дисбалансу відповідає характерному аеробному метаболізму в присутності глюкози (вивчені умови вирощування), в якому гліколіз поєднується з циклом трикарбонових кислот (TCA) і окисним фосфорилюванням. Пентозофосфатний шлях окислює глюкозу та забезпечує рибозу-5P для синтезу нуклеотидів і відновну здатність НАДФН для анаболізму, тоді як анаплеротичні шляхи відходять від циклу ТЦА, подібні до метаболізму глутаміну, помірно використовуються переважно для живлення піримідину та синтез амінокислот. FBA дає нам змогу кількісно визначити зміни в цих шляхах і те, як вони зрештою деталізують метаболічні риси, що лежать в основі будь-якого конкретного режиму дисбалансу.

Зокрема, на малюнку 2A показано, як відновлювальний дисбаланс цитозольного НАДН/НАДН викликає збільшення гліколітичного потоку, зниження активності циклу ТСА та ланцюга транспортування електронів, а також підвищення метаболізму глутаміну. Ця псевдогіпоксична метаболічна ознака — за наявності кисню — нагадує анаеробний метаболізм, де гліколіз поєднується з алкогольним або молочнокислим бродінням на шкоду мітохондріальним шляхам; киснева частина пентозофосфатного шляху припиняється, і метаболізм глутаміну, більш активний, може бути перенаправлений на виробництво пірувату на додаток до сприяння анаболізму. Примітно, що цей фенотип фіксує деякі особливості парадоксального метаболізму виходу, що спостерігається в різних типах ракових клітин (ефект Варбурга) (Potter et al., 2016).

Рисунок 2. Потоки основних шляхів управління енергією, що лежать в основі профілю толерантності в дріжджах (A) Дисбаланс цитозольного NADH/NAD (вгорі) і значення потоку п’яти характерних шляхів (внизу); i/гліколіз (гліколіз, ядро), ii/цикл Кребса (TCA, рожевий), i/пентозофосфат (Penphos, зелений), iv/окисне фосфорилювання (Oxphos, сірий) і метаболізм глутаміну (Glutamine, фіолетовий). Представлені вектори потоку є результатом усереднення потоку всіх реакцій певного шляху.

(B) Те саме, що (A) щодо мітохондріального дисбалансу. Зверніть увагу на наявність негативних потоків у гліколізі (панель А, внизу) означає посилений глюконеогенез. Дивіться основний текст для деталей.

Навпаки, енергетичний метаболізм, що лежить в основі окислювальної толерантності (по відношенню до цитозолю, рис. 2A), демонстрував більш аеробну конфігурацію, але з особливостями, такими як особливо активний метаболізм поліамінів; і надзвичайні властивості, включаючи посилений глюконеогенез, окисне фосфорилювання та активність циклу ТСА, а також дуже високий (до 12-кратного нормального рівня) потік через пентозофосфатний шлях. Останнє все ж може бути артефактом відмінностей у псевдореакції біомаси за дуже високого (понад 55 ммоль/гДВт/год) окисного дисбалансу (Див. методи S1).

Коли реакція дисбалансу локалізується в мітохондріях, зниження NADH знову викликає певну псевдогіпоксичну поведінку, з однією відмінністю (рис. 2B). Потік через гліколіз і метаболізм глутаміну збільшився з супутньою втратою частин циклу ТСА та пентозофосфатного шляху. Однак, на відміну від цитозольного випадку, окисне фосфорилювання значно збільшилося. З іншого боку, окислювальна сторона мітохондріального профілю була більш ідіосинкратичною: гліколітична активність зростала паралельно з активністю циклу ТСА, але окисне фосфорилювання працювало здебільшого на нижчих рівнях, ніж зазвичай, і метаболізм глутаміну не мав великого значення,

Метаболічні синдроми є результатом компромісу між окисно-відновним балансом, виробництвом біомаси та співвідношенням АТФ/НАДН

Ми визначили кілька ключових елементів, які сформували попередні синдроми.розмір пеніса cistancheОкислювальне збурення було зустрінуте загостреною аеробною реакцією як компроміс між підтриманням росту та буферизацією збурення дисбалансу. Це включало перенаправлення потоку через максимально можливу кількість реакцій, які зменшували NAD плюс, зберігаючи при цьому глобальний розподіл потоку, який був здатний генерувати компоненти біомаси. Ці два механізми (буферізація збурень і максимізація біомаси) є найбільш відповідними вимогами оптимізаційної задачі та достатніми для опису окислювального режиму профілю толерантності.

Рисунок 3. Конкуруючі механізми викликають псевдогіпоксичну поведінку дріжджів

(A) Баланс між виробництвом НАДН, АТФ і попередника біомаси сприяє реакційним модулям, які виробляють якомога більше АТФ і якомога менше НАДН, щоб компенсувати наслідки відновних режимів, наприклад, використання гліколізу для ТСА. Зауважте, що фіолетові стрілки представляють виробництво АТФ, жовті стрілки представляють виробництво NAD(H), а білі кола вказують на генерацію попередників біомаси. (B) Збурення NADH/NADt, схильне до NADH (вісь х), накладається на штучний ADP реакція фосфорилювання (вісь y), яка посилено вводить відновну силу у формі АТФ у незбалансований метаболізм. Градієнт зеленого кольору представляє співвідношення між гліколітичним потоком і потоком циклу Кребса, нормалізоване за його нормальним значенням (до 100- разів). Можна оцінити, що фосфорилювання АДФ знижує псевдогіпоксичний фенотип і затримує стан спокою.

Редукційна сторона вимагала, однак, одного додаткового розуміння. Оскільки все більше і більше NADH секвеструється в NADH, реакції, які використовують NADt і прямо чи опосередковано необхідні для виробництва компонентів біомаси, стають все більш і більш обмеженими, тому енергетичний метаболізм повинен бути перенаправлений, щоб забезпечити підвищене перетворення NADH в NAD' і обмежити зниження НАД до НАДН. Цього ще недостатньо, щоб протистояти збуренню, оскільки більша частина відновної сили у формі НАДН по суті марна для багатьох метаболічних цілей, реакцій і росту: енергія, що зберігається в НАДН, повинна бути перерозподілена на АДФ. Таким чином, метаболізм повинен віддавати пріоритет модулям реакції, які виробляють якомога більше АТФ і якомога менше NADH; він повинен покладатися на шунти та шляхи, які мають високий вихід АТФ/НАДН, наприклад, гліколіз та окисне фосфорилювання.

Це, серед іншого, призводить до скорочення циклу TCA та збільшення гліколітичного потоку (рис. 3A). Щоб глибше дослідити вплив цього компромісу АТФ/НАДН, ми поєднали відновлювальне збурення НАДН/НАД зі штучною реакцією, яка дозволяє фосфорилювати АДФ. . Моделювання показало, що підвищене відношення циклічного потоку гліколізу до TCA, яке характеризує відновний метаболізм, залежить від виходу АТФ/НАДН

Рисунок 4. Оцінка толерантності як предиктор хронологічної тривалості життя дріжджів

(A) Профілі толерантності, отримані для дріжджових мутантів; сині/червоні сектори кривої представляють відновний/окислювальний режим порушення рівноваги NADH/NADH.

(B) Зв’язок між нормалізованою оцінкою толерантності (пропорційною широті значень дисбалансу як при окисному, так і відновному режимах, методи STAR) і хронологічною тривалістю життя. Кореляція пояснює ~30 відсотків загальної дисперсії (R'= 0. 29, p-значення=3.2x 10-4, N= 41).

(C) Як альтернативний спосіб перегляду цього зв’язку ми отримали гістограму значень нахилу регресії, отриману з десяти тисяч випадково згенерованих зв’язків між балом толерантності та тривалістю життя. З цієї вибірки ми знаходимо лише 3 випадки, в яких зв’язок між показником толерантності та даними про тривалість життя сильніший, ніж знайдений (позначений червоною вертикальною лінією).

(Малюнок 3B). Примусове фосфорилювання АДФ зменшує цю псевдогіпоксичну сигнатуру навіть в умовах дуже сильного дисбалансу, схильного до NADH.

Толерантність пояснює експериментальні хронологічні відмінності тривалості життя між різними дріжджовими мутантами

Ми запитали, якою мірою профіль толерантності може діяти як предиктор тривалості життя, враховуючи, що редокс-пари обговорювалися як потенційні детермінанти тривалості життя. Один із способів вивчити це — обчислити профіль у різних мутантів (Малюнок 4A), а потім кількісно визначити, як він відповідає точним показникам тривалості життя, нормалізованим хронологічним тривалістю життя (CLSs), доступним з експериментально виміряних кривих виживання мутантів (Garay et al., 2014). CLS обчислюють за цими кривими виживання мутантів як збільшення виживання в стаціонарній фазі відносно дикого типу.

У FBA мутації в конкретних генах моделюються шляхом обмеження потоку реакцій, пов’язаних з ними, за допомогою булевих правил, які пов’язують кожну хімічну реакцію з ORF, які транслюють для ферменту реакції (методи STAR). Для кожного з цих мутантів ми обчислили профіль толерантності мутантів (Малюнок 4A) і використали суму абсолютних значень дисбалансу, при яких швидкість росту зменшується вдвічі (як у відновному, так і в окислювальному режимах), як скалярну оцінку толерантності (STAR методи).

Проте наш набір мутантів був обмежений деякими обмеженнями (методи STAR). Примітно, що ми не змогли розрізнити відмінності в толерантності нижче 10 ppm від значення дикого типу, не досягнувши непомірно високого часу обчислення, і багато мутантів демонстрували як незначні відмінності в тривалості життя, так і незначні відмінності в толерантності. Крім того, зазвичай вважається, що FBA нездатний охарактеризувати делеції посилення функції, і, цілком передбачувано, жодна мутантна толерантність не перевищувала толерантність дикого типу.

Крім цих обмежень, профілі толерантності in silico змогли пояснити -30 відсотків експериментально виміряної варіабельності тривалості життя (Малюнок 4B, R2= 0.29, N=41, значення p{{5 }}.2x 10-) з великою значимістю: 10, 000 рандомізація пар даних призвела лише до 3 випадків із більшим нахилом регресії (Малюнок 4C).

Звичайні поживні речовини забезпечують толерантність до дисбалансу NADH/NADH

Нарешті, ми дослідили, чи є конкретні харчові метаболіти особливо вирішальними у відповіді на окисно-відновний дисбаланс. З цією метою ми використали додаткову функцію моделей FBA, яка полягає в можливості доступу до використання певного метаболіту (визначається як швидкість споживання в стаціонарному стані, методи STAR). Ми перевірили, як ця швидкість змінюється зі збільшенням значень відновного та окисного NADH/NAD плюс дисбаланс.

Використання було досить лінійним з обох сторін профілю та для більшості метаболітів. Таким чином, ми пристосували цю мінливу модель до лінійної моделі та вважали (абсолютний) нахил скалярним репрезентативним значенням відповідного метаболіту для переносимості окисно-відновного дисбалансу (рис. 5A). Серед найбільш сприйнятливих поживних речовин iAZ900 ми помітили харчові метаболіти, які, як відомо, відіграють вирішальну роль у регулюванні тривалості життя дріжджів, такі як ацетат (Burtner та ін., 2009), а також багато інших, які експериментально збільшують тривалість життя дріжджів, черв’яків, або навіть клітини людини (Madeo et al., 2018; Mishur et al., 2016), включаючи малат, гідроксибутират, спермідин або оксалоацетат (рис. 5B-5D, таблиця S1).

Певні поживні речовини були більш релевантними для стійкості до зниження НАД, інші – до окиснення НАД, а деякі – до обох цих режимів. Найважливішими дієтичними метаболітами для зниження толерантності були ацетат, бета-гідроксибутират (BHB), глутамат і глутамін (рис. 5B), тим часом найважливішими для переносимості окислення NADH були ацетат, NADP плюс, путресцин і спермідин. (Малюнок 5D). Серед тих, які брали участь з толерантності з обох сторін профілю, найбільш релевантними були в порядку ацетат, глутамат, оксалоацетат і оксоглутарат (рис. 5C).

Ми розглянули метаболічні моделі в інших організмах, щоб додатково підтвердити, які поживні речовини є визначальними у відповіді на дисбаланс (методи S1, див. також рисунок S2 для того, як змінюються потоки основних шляхів). Усі ці головні учасники змінилися, хоча й незначно, з альфа-кетокислотами, окислювально-відновними парами, певними вітамінами та певними амінокислотами, які є істотно необхідними для контролю порушень NADH/NADt у C.elegans та реконструкції людини. Найбільш поширена реакція на окислювально-відновний дисбаланс у цих організмів стосується метаболітів, які опосередковують гомеостаз рН, таких як ацетат, бікарбонат, біфосфат, натрій, вода та інші подібні. Подібним чином, актуальність глутамату, глутаміну, аспартату, треоніну, серину та гліцину відрізняє їх від інших амінокислот і більшості метаболітів. Окислені кислоти середнього розміру, такі як оксоглутарат, малат і оксалоацетат, також постійно відіграють важливу роль у толерантності, так само, як і біотин і деякі фолати (повний список див. у таблиці S1).

ДИСКУСІЯ

Тут ми пропонуємо альтернативний підхід до розуміння широких біологічних наслідків змін в окисно-відновних парах. Цей підхід базується на метаболічних моделях in silico та вводить поняття профілю толерантності як показника, який кількісно визначає стійкість клітин до цих змін.

Рисунок 5. Гомеостатичні поживні речовини в дріжджах

(A) Приклад профілю використання поживної речовини з відповідними відновними (синім) і окислювальним (червоним) лінійними регресіями, що характеризуються нахилами m і m відповідно (в абсолютних значеннях). Ми включили профіль толерантності до цитозольного фону як еталон.

(B) Нахили лінійної регресії (m,) 4 основних гомеостатичних поживних речовин у відновному сенсі NADH/NAD плюс збурення.

(C) Нахили лінійної регресії top4 поживних речовин, які є гомеостатичними в обох сенсах збурення; Синій: нахил редуктивної лінійної регресії; Червоний: нахил окисної лінійної регресії.

(D) Нахили лінійної регресії (м.) 4 основних гомеостатичних поживних речовин в окислювальному значенні NADH/NAD плюс збурення.

Метаболічні коригування, що лежать в основі профілю, виявляють наявність псевдогіпоксичного фенотипу, пов’язаного з режимами відновлення NADH. Цей фенотип нагадує деякі, очевидно, парадоксальні метаболізми з низьким виходом енергії, що спостерігаються в ракових пухлинах (ефект Варбурга), а також визнається в дріжджових (ефект Кребтрі) і бактеріальних (метаболізм переповнення) клітинах (Basan та ін., 2015; Морі та ін., 2016; Поттер та ін., 2016). Можливість того, що така поведінка може бути спричинена обмеженнями розподілу ресурсів, що виникають при порівняно високому зростанні або швидкості поглинання глюкози, висунуто в останні роки (Basan та ін, 2015; Морі та ін, 2016). Однак псевдогіпоксичний фенотип, який ми спостерігаємо, не залежить від швидкості росту та поглинання глюкози, і насправді він виникає разом із низькими темпами росту (методи STAR). Ми показали, що його причина полягає в фундаментальному компромісі АТФ/НАДН, обґрунтування, яке підтверджується нещодавнім експериментальним дослідженням (Maldo-nado and Lemasters, 2014).

Крім того, наш аналіз потоку свідчить про те, що на підтримку АТФ може негативно вплинути відновлюючий NADH/NAD плюс порушення рівноваги. Вважається, що збільшення NADH є корелятом зі зниженою доступністю АТФ, оскільки порушення окисного фосфорилювання може призвести як до збільшення NADH/NAD плюс, так і до зниження АТФ/АДФ. Ми показуємо, що зовнішній дисбаланс NADH може бути причиною зниження доступності енергії через ортогональні метаболічні механізми, навіть якщо окисне фосфорилювання працює на нормальному рівні. Це дуже важливо в контексті досліджень старіння, оскільки зниження доступності енергії та співвідношення АТФ/АДФ є збереженою ознакою старіння клітин і пов’язаних із віком патологій (Moreira et al., 2003; Pall, 1990; Yaniv et al., 2013). ) і може сприяти накопиченню токсичних відходів і втраті протеостазу (ще одна характерна ознака старіння) за рахунок зменшення обороту білка і, отже, збільшення періоду напіврозпаду білка (Анісімова та ін., 2018).

Далі ми прагнемо визначити валідність нашої системи як предиктора тривалості життя та харчових метаболітів, які буферизують окисно-відновний дисбаланс. Толерантність передбачає тривалість життя клітини з деякими обмеженнями через доступний набір даних. Враховуючи ці обмеження (Garay et al., 2014), ми виявили, що отримані кореляції все ще є достатнім доказом зв’язку між дисперсіями толерантності та CLS.

Всупереч нашим очікуванням, найбільш чіткий урок, витягнутий з нашого аналізу харчових метаболітів, полягає в тому, що основна речовина, що стимулює реакцію на дисбаланс, особливо не залежить від мережі порятунку NADt. Дійсно, головні «гомеостатичні поживні речовини» є проміжними продуктами циклу TCA та інших частин центрального метаболізму, чия дія є набагато більш проникливою, ніж дія попередників NAD. Крім того, актуальність реакцій, які відновлюють або окислюють NAD(H), діючи як містки між окислювально-відновною парою та основними метаболічними шляхами, набагато перевершує реакцію ферментів, що обмежують порятунок NADt (таких як нікотинамідмононуклеотид аденілтрансфераза).

Наприклад, оксалоацетат і оксоглутарат у дріжджовій моделі входять до чотирьох найефективніших метаболітів, що лежать в основі толерантності як у відновних, так і в окислювальних умовах, що є незмінною ознакою, яка підтверджує попередні експериментальні результати (Chin та ін., 2014; Вільямс та ін., 2009). . Інші важливі метаболіти включають гідроксибутират, який постійно показує, що збільшує тривалість життя, регулює NAD і опосередковує реакцію на голодування (Edwards et al., 2014; Newman and Verdin, 2014), і спермідин, який належить до сімейства поліамінів і, як відомо, відіграють важливу роль у процесах, пов’язаних із віком, аутофагії та захисті ДНК (Eisenberg та ін., 2009; Minois та ін., 2011: Pietrocola та ін., 2015).

Ми використовували моделі C.elegans і людини, щоб посилити попередню оцінку, розкриваючи ширшу картину, яка зосереджена навколо гомеостазу рН, окисно-відновних пар і циклу ТСА. Це свідчить про те, що способи, якими рН (Burtner та ін., 2009) і дисбаланс НАДН (Айер та ін., 2014) визначають старіння клітин, глибоко переплетені. Окрім рН, найбільш поширеними та важливими поживними речовинами для регулювання НАДН/НАД плюс дисбалансу є альфа-кетокислоти оксалоацетат і оксоглутарат, їх аміновані форми та інші мітохондріальні метаболіти, такі як малат, піруват і фумарат, тобто головний центр Контроль окислювально-відновного балансу - це цикл ТСА.

До цього дня механізми, за допомогою яких амінокислоти та проміжні продукти циклу TCA впливають на продовження життя дріжджів і C. elegans, залишаються незрозумілими. Такі метаболіти, як малат, оксалоацетат, фумарат, валін, серин або треонін, справді можуть збільшити тривалість життя організмів, але процеси, що призводять до цих ефектів, обговорюються та є складними (Edwards et al., 2013, 2015). Наші результати вказують на те, що загальне пояснення всіх цих явищ продовголіття полягає у впливі поживних речовин на здатність клітин переносити збурення у співвідношенні NADH/NAD плюс.

Проте можна стверджувати, що деякі з розглянутих метаболітів здаються самоочевидними, оскільки вони, зрештою, беруть участь у реакціях, які взаємоперетворюють NADH і NAD плюс. Питання полягає в тому, чому інші метаболіти, які також виглядають апріорі самоочевидними, не з’являються в наших результатах. Відповідь полягає в механізмах, які забезпечують реалістичні прогнози в FBA. Щоб поживна речовина була «гомеостатичною» проти окислювально-відновного дисбалансу, вона повинна не тільки збільшувати виробництво NADH або NADt, але й перебувати в центральному шляху або модулі з високим виходом АТФ/NADH та/або здатністю забезпечувати компоненти біомаси.

Нарешті, заслуговують на увагу ще два висновки з наших результатів. З одного боку, вони припускають, що у відповідь на окисно-відновний дисбаланс метаболічні мережі готові все більше виробляти та/або споживати деякі метаболіти, які інтерпретуються сигнальними мережами як такі, що виключають потребу в аутофагії, антиоксидантних і горметичних відповідях, а також багато інших, які надлишкові або було виявлено, що харчові добавки збільшують тривалість життя та/або іншим чином імітують ефекти обмеження калорійності (CR) у спосіб, який залежить від сигнальних шляхів, які беруть участь у опосередкованому CR подовженні тривалості життя. Це підтверджує попередні докази, що зв’язують CR і NADH/NADH баланс як частину того самого процесу продовження тривалості життя та зміцнення здоров’я (Lin et al., 2004).

З іншого боку, наше дослідження показує, що у відповідь на змінені співвідношення метаболізм також збільшує використання певних речовин, які можуть хімічно пошкодити клітину, таких як ацетат, путресцин або ацетальдегід; а також деякі, які можуть сприяти пухлиногенезу через метаболічні зміни, такі як глутамін, сукцинат і фумарат (Sciacovell et al., 2016). Тоді це могло б частково пояснити патології, пов’язані з окислювально-відновним дисбалансом, і макроскопічні процеси, в які він залучений, такі як дегенеративні та онкологічні захворювання: якщо окисно-відновний дисбаланс необхідно буферизувати токсичними речовинами, то ці речовини, ймовірно, є механізмами патологій, які ко - виникають при окисно-відновному дисбалансі.

Ми усвідомлюємо, що наш підхід до окислювально-відновного дисбалансу можна розуміти як незвичайний варіант дослідження стійкості метаболічної мережі, і що він може звинуватити певні застереження, які залишають багато можливостей для вдосконалення. Що стосується надійності, дослідження з використанням FBA традиційно визначили її як зміну цільового рішення (зазвичай зростання) у відповідь на різні зниження швидкості реакції, наприклад (Edwards and Palsson, 2000), а не на конкретне збурення (окисно-відновний дисбаланс ) у метаболітах, як і ми. Що стосується обмежень нашого аналізу, вони можуть бути пов’язані з внутрішніми обмеженнями самого FBA, наприклад, відсутністю регуляторних генів. Зрештою, надійність наших результатів залежить від передбачуваної сили метаболічних реконструкцій: поточні дріжджові моделі є передбачливими та вдосконаленими, але вони не ідеальні (Heavner and Price, 2015), і все ж вони набагато кращі, ніж навіть більшість доступні точні багатоклітинні реконструкції. Незважаючи на всі ці занепокоєння, є багато доказів, які виправдовують дедалі більшу точність метаболічних моделей до природної поведінки.

В даний час переважаючі дослідження, як правило, ігнорують потенційні негативні наслідки невибіркового зниження співвідношення NADH/NADH. Частково це пов’язано з багатообіцяючими перевагами, отриманими в результаті помірного зниження, досягнутого експериментально, що включає зменшення неопластичних фенотипів, тривалості життя та подовження тривалості здоров’я. Однак з’являються нові докази, які рекомендують бути надзвичайно обережними щодо цих позитивних результатів (Gujarat al., 2016; Hong et al., 2019), а також надійну, експериментально підтверджену теоретичну базу, яка передбачає негативні наслідки від зниження співвідношення NADH/NADH понад поріг (Aon та ін., 2010). Наші профілі толерантності до дисбалансу NADH/NADt відповідають цій картині, що виникає, оскільки легкі окислювальні відхилення можуть бути корисними, але більш високі відхилення настільки ж шкідливі, як і протилежна крайність.

Більш конкретно, наші профілі толерантності свідчать про те, що окрім виникнення хімічних або фізіологічних проблем, як низькі, так і високі співвідношення NADH/NADH також мають супроводжуватися суто метаболічними недоліками, включаючи зниження доступності енергії та/або біосинтетичного виходу. Крім того, як ми зазначали, обмежені експериментальні спостереження, доступні щодо деяких питань, які ми розглядаємо, здаються нагадуючими результати, які ми тут повідомляємо.

Обмеження дослідження

Представлені тут результати покращаться, якщо використані моделі будуть удосконалені. Наша робота також страждає від внутрішніх обмежень FBA як техніки. Наприклад, недоступна динамічна інформація, враховуючи те, що доступні на даний момент версії аналізу динамічного потоку мають надто обмежений обсяг. Подібним чином відсутність неявних енергетичних обмежень у балансі потоку зменшує його передбачуваність для високих темпів зростання. Ця слабкість мотивувала додавання таких методів, як CAFBA, як ми розглянули в рукописі. Нарешті, було б цікаво отримати доступ до нормативної інформації, якою можна легко керувати та вмикати чи вимикати. На сьогодні не існує стандартизованих підходів до реалізації генної регуляції при ФБА. Застосування балів реакційної активності до меж обмежень є перспективним у цьому відношенні.

Ця стаття взята з iScience 24, 102697, 23 липня 2021 р.