Час і вплив ішемії на фіброз нирки після контралатеральної нефректомії

вступ

Захворюваністьгостре ураження нирок(AKI) різко зросла в усьому світі за останні роки [1]. ГПН може бути спричинений трансплантацією органів, післяопераційним періодом під перфузією, кровотечею, дегідратацією, шоком і сепсисом у клінічній практиці [2]. Недавні епідеміологічні та експериментальні дослідження показали, що тяжкість, частота та тривалість ГПН тісно пов’язані з подальшою захворюваністюхронічні захворювання нирок(ХХН). Фіброз нирки після ГПН може призвести до ХХН або навітьтермінальна стадія захворювання нирок(ESKD) [3–5], що означає, що ГПН і ХХН є зв’язаними синдромами [6]. Проте механізми, що лежать в основі переходу від ГПН до ХХН, залишаються невідомими, незважаючи на численні експериментальні та клінічні дослідження. Моделі на тваринах є важливим інструментом для дослідження механізмів, за допомогою яких ГПН призводить до ХХН. Ішемічно-реперфузійне ураження нирки (IRI) є однією з основних причин ГПН, і було розроблено декілька тваринних моделей ГПН, спричинених ІРІ [7], включаючи двосторонню модель ІРІ (bIRI), односторонню модель ІРІ з інтактною контралатеральною ниркою. , модель uIRI з одночасною контралатеральною нефректомією та модель uIRI з відстроченою контралатеральною нефректомією.

Модель bIRI менш узгоджена, оскільки, коли ішемічне ураження обох нирок є надто легким, значних фіброзних змін у довгостроковій перспективі немає. Коли AKI є надто важким, миші можуть загинути у фазі гострого ураження. Крім того, невеликі відмінності в пошкодженні двох нирок можуть призвести до значних відмінностей у їх хронічній нирковій патології через кілька тижнів [8,9]. Модель uIRI з одночасною контралатеральною нефротомією подібна до моделі bIRI, оскільки внаслідок нефректомії з іншого боку залишається лише пошкоджена нирка [10]. У моделі IRI з інтактною контралатеральною ниркою фіброз ішемічної нирки є важким [11,12]. Ця модель є дуже послідовною та надійною для довготривалих спостережень дослідників. Однак через наявність контралатеральної непошкодженої нирки його не можна використовувати для оцінки розрахункової швидкості клубочкової фільтрації (eGFR), креатиніну сироватки (SCr) і азоту сечовини крові (BUN) [11–14]. У порівнянні з двома моделями uIRI, згаданими вище, модель uIRI із відстроченою контралатеральною нефректомією долає ці проблеми та може використовуватися як для тривалого спостереження після ГПН, так і для моніторингу функції нирок. Тому ця модель підходить для вивчення переходу AKI-CKD [15].

НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ ДЛЯГОСТРЕ ПОРАЖЕННЯ НИРОК

Тим не менш, різні ішемічні стани та інтервал між контралатеральною нефректомією та UIRI можуть мати значний вплив на прогресування та тяжкість ХХН після ГПН. Попередні дослідження були зосереджені на впливі тривалості ішемії на фіброз нирок після ГПН і не приділяли особливої ​​уваги внутрішній температурі тіла під час ішемії. Наприклад, Скрипник та ін. [12] контролювали температуру ішемії на рівні 38 °C за допомогою системи водяної бані з тривалістю ішемії 30 хвилин, а контралатеральна інтактна нирка була видалена через 8 днів після UIRI. Результати показали, що ішемізована нирка мала значні фіброзні зміни через 28 днів після UIRI. З такою ж тривалістю ішемії Xiao et al. [8] показали, що значні фіброзні зміни відбулися через 11 днів після проведення УІРІ, коли ішемічну температуру контролювали на рівні 37-38 С, а часовий інтервал між УІРІ та контралатеральною нефректомією становив 10 днів. Деякі дослідники, такі як Коломбаро та ін. [14] і Li et al. [16] не згадували ішемічну температуру у своїх дослідженнях.

Тим часом мало хто досліджував вплив інтервалу часу між контралатеральною нефректомією та uIRI у цій моделі, що призвело до дуже різних результатів у різних лабораторіях, що також різко вплинуло на подальші експерименти. У цьому дослідженні ми досліджували вплив основних факторів, що впливають на фіброз нирок після ГПН, включаючи часовий інтервал між контралатеральною нефректомією та UIRI, температуру тіла під час ішемії та тривалість ішемії. Ми мали на меті надати посилання, щоб створити відповідну тваринну модель для вивчення переходу ГУН ХХН

Матеріали та методи Моделі тварин

Самці мишей C57BL/6J (віком 8–10 тижнів, приблизно 22 г ваги; GemPharmatech Co., Ltd., Нанкін, Китай) мали вільний доступ до їжі та води в Експериментальному центрі на тваринах Медичного університету Шаньсі. Умови розведення були такими: вологість 40–70%, температура 23 С, клас чистоти повітря 7, контрольований 12--годинний цикл світла/темряви в умовах, вільних від патогенів, опромінення корму Co60 та очищена вода. Усі процедури цього дослідження були схвалені Комітетом з етики тварин Другої лікарні Медичного університету Шаньсі (номер етики: DW2022028).

Протоколи

Враховуючи, що тривалість ішемії, температура тіла під час ішемії та час резекції контралатеральної неушкодженої нирки можуть впливати на тяжкість ГПН та наступного фіброзу нирки, ми досліджували вплив трьох вищевказаних факторів окремо, а інші два були фіксованими. Було проведено три експерименти наступним чином.

Протокол 1: щоб спостерігати вплив інтервалу між контралатеральною нефректомією та uIRI на функцію нирок і фіброз після ГПН, час ішемії лівої нирки був зафіксований на 24 хвилинах, а основна температура тіла була зафіксована на рівні 37 C під час дослідження нирок. ішемія тим часом. Резекцію правої нирки проводили на 7, 10 та 14 добу відповідно (n=8 на групу) після ІРІ лівої нирки. Ми визначили тривалість ішемії та резекції нирки на основі результатів попередніх досліджень [8,10,12,15] та наших доекспериментальних результатів. Протокол дослідження див. на рисунку 1(A–C).

Протокол 2: щоб спостерігати за впливом внутрішньої температури тіла під час ішемії на перехід AKI-CKD, час ішемії лівої нирки було зафіксовано на 24 хвилинах, а праву нирку видаляли через 14 днів після IRI лівої нирки. Внутрішню температуру тіла контролювали на рівні 36 °C, 36,5 °C, 37 °C, 37,5 °C і 38 °C відповідно (n=8 на групу). Протокол дослідження див. на малюнку 1(D).

Протокол 3: щоб спостерігати за впливом тривалості ішемії нирки на перехід від ГПН до ХХН, внутрішню температуру тіла фіксували на рівні 37°C під час ішемії, а праву нирку видаляли через 14 днів після IRI лівої нирки. Ми обрали цей момент часу тому, що фіброз нирок, який був типовою зміною після ГПН на ХХН, був дуже очевидним відповідно до звітів [8,10,12,15] і наших попередніх експериментальних результатів. Час ішемії лівої нирки контролювався на 21 хв, 24 хв, 27 хв і 30 хв відповідно (n=8 на групу). Протокол дослідження див. на малюнку 1(E).

Усіх мишей піддавали евтаназії через 8 тижнів після IRI лівої нирки. Частину тканини лівої нирки зберігали при 70°C для подальшого RT-PCR та вестерн-блот аналізу, а іншу частину фіксували в нейтральному формаліні для гістопатологічного аналізу. Зразки крові відбирали через ретроорбітальний синус для біохімічного дослідження.

Рисунок 1. Протоколи одностороннього ішемічно-реперфузійного пошкодження (uIRI) з відстроченою контралатеральною нефректомією. (A–C): Ліва нирка була піддана IRI в день 0, а резекція правої нирки була проведена в різні моменти часу (день 7, день 10 і день 14) з тривалістю ішемії фіксується через 24 хвилини з внутрішньою температурою тіла, фіксованою на 37 C під час ішемії нирки. (D): Ліва нирка була піддана IRI в день 0, а резекція правої нирки була проведена за різних температур тіла (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C і 38 C) з ішемічною час лівої нирки зафіксували на рівні 24 хв, а праву нирку видалили через 14 днів після ІРІ лівої нирки. (E): Ліва нирка була піддана ІРІ на 0-й день, а резекція правої нирки була проведена з різною тривалістю ішемії (21 хв, 24 хв, 27 хв і 30 хв) із фіксованою внутрішньою температурою тіла на рівні 37 C під час нирки. ішемії, а праву нирку видалили через 14 днів після ІРІ лівої нирки. Масу нирки, функцію нирок, гістологічне пошкодження нирки та фіброз нирки оцінювали до 56 дня.

Хірургічна процедура

Перед операцією всі миші голодували протягом 12 годин із вільним доступом до води та внутрішньочеревно вводили 3% пентобарбіталу натрію 50 мг/кг. Під час анестезії ректальна температура підтримувалася на рівні 36 С, 36,5 С, 37 С, 37,5 С і 38 С відповідно в різних дослідних групах. Щоб досягти цього, мишу помістили спиною на грілку (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Чжецзян, Китай) у положенні з витягнутою головою та шиєю, щоб гарантувати, що її дихальні шляхи залишаються без перешкод, а очі накривали теплою сольовою марлею, щоб уникнути висихання під час процедури. Після анестезії волосся на лівій спині миші збривали машинкою для стрижки. Потім шкіру в хірургічній зоні протирали тампоном, змоченим 75% спиртом. Як правило, температура тіла миші падає після гоління волосся. Хірургічну процедуру проводили, коли температура тіла стала постійною, що могло тривати близько 15 хвилин. Ліву нирку можна було побачити, розрізавши ліву дорсальну шкіру на 0,5 см поруч із середньою лінією та на 0,5 см біля нижнього краю грудної клітки миші. Потім ми стиснули ліву частину живота однією рукою, щоб вивести ліву нирку з порожнини тіла, підняли нирку тупими вигнутими щипцями (обережно, щоб не пошкодити нирку), від’єднали ніжку нирки та швидко її затиснули, а потім помістили затиснуту нирки під шкіру, щоб вона була теплою та зволоженою. Успішна ішемія характеризувалася поступовою зміною кольору нирки від червоного до темно-фіолетового, що тривало 21 хв, 24 хв, 27 хв і 30 хв відповідно в різних експериментальних групах. Колір нирки знову змінився на червоний протягом 2–5 хвилин після відпускання затискача. Потім ми закрили черевну порожнину пошаровими швами. Праву дорсальну шкіру та м’яз розрізали на 7-й, 10-й та 14-й дні після UIRI відповідно в різних експериментальних групах, а праву нирку видаляли. Потім закрийте рану стандартними швами. Після кожної операції внутрішньоочеревинно вводили 500 мл фізіологічного розчину для компенсації втрати рідини під час операції. У той же час мишу тримали на грілці приблизно 2–3 години, поки вона не прийшла до повної свідомості, перш ніж її перемістили в клітку. У фіктивній групі ніжку нирки не перетискали, решта хірургічних операцій були такими ж, як і в групі uIRI. Всі хірургічні операції виконувалися однією людиною з досвідом експлуатації даної моделі більше 2 років.

Дослідження функції нирок

Рівні SCr вимірювали за допомогою набору креатиніну (метод Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Рівні BUN вимірювали за допомогою набору Urea Kit (метод уреази-глутаматдегідрогенази, Biosino Biotechnology and Science).

Аналіз ваги нирок

Після сечовипускання вагу тіла мишей вимірювали за допомогою точних електронних ваг. Свіжі бруньки тричі промивали в попередньо охолодженому фізіологічному розчині, потім надлишки води з бруньок видаляли фільтрувальним папером. Капсули нирок знімали на льоду і нирки негайно зважували. Співвідношення маси нирок до маси тіла розраховували для оцінки виправленої маси нирок у мг/г.

Фарбування гематоксилін-еозином (HE) і оцінка пошкодження нирок

Тканини нирки, фіксовані нейтральним формаліном, регулярно зневоднювали, заливали в парафін, розрізали (3 мкм) і фарбували ВІ для спостереження за пошкодженням тканини нирки. Десять випадково вибраних полів кори нирки кожного зрізу були отримані за допомогою світлової мікроскопії при 400 збільшенні. Два патологоанатоми оцінили пошкодження клубочка та ниркових канальців окремо. Пошкодження канальців оцінювали за шкалою {{20}}–4 за такими критеріями [17]: 0, відсутність пошкодження; 1, що вражає 1–25% площі нирок; 2, що вражає 26–50% площі нирок; 3, що вражає 51–75% площі нирки; і 4, що вражає 75–100% площі нирок. Ступінь ушкодження канальців оцінювали напівкількісно шляхом розрахунку площі ушкодження канальців нирки. Пошкодження клубочків оцінювали та оцінювали за шкалою 0–4 відповідно до відсоткової площі мезангіального розширення або склерозу за такими критеріями [17]: 0 — нормальні клубочки; 1, 1–25% площі ураження; 2, 26–50% площі ураження; 3, 51–75% площі ураження; і 4, 76–100% площі пошкодження. Остаточний бал ушкодження клубочків ¼ 0 (% клубочків 0 ступеня) þ 1 (% клубочків 1 ступеня) þ 2 (% клубочків 2 ступеня) þ 3 (% клубочків 3 ступеня) þ 4 (% клубочків 4 ступеня). Більше 50 клубочків оцінювали на мишу.

Трихромне фарбування за Массоном

Тканини нирки, фіксовані нейтральним формаліном, регулярно зневоднювали, заливали в парафін, розрізали (3 мкм) і фарбували трихромом Массона для спостереження за фіброзом нирок. У трихромно-забарвлених зрізах Массона двадцять неперекриваючих полів кори нирки були захоплені під 200-кратним збільшенням. Для автоматичного вимірювання та аналізу використовувалося програмне забезпечення Image-Pro Plus Image Analysis. Для визначення рівня інтерстиціального фіброзу нирок використовували відсоток фіброзної площі [8].

ОТ-ПЛР

Загальну мРНК екстрагували з ниркової тканини кожної групи за допомогою Trizol і вимірювали її концентрацію, потім її перетворювали на кДНК (Taka Reverse Transcription Kit). Метод флуоресценції Taqman (TB Green Premix Ex Taq II Real-time RT-PCR) використовувався для кількісного визначення експресії РНК фібронектину (FN) і колагену I (COL-I) у тканинах нирок. Для FN (прямий: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 і зворотний: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) і COL-I (прямий: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{) використовувалися спеціальні праймери. {9}} і реверс: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (надано Sangon Biotech Co., Ltd., Шанхай, Китай). Умови ампліфікації наступні: 95 С протягом 30 с, 95 С протягом 5 с, 60 С протягом 30 с, 40 циклів; 95 °C протягом 10 с, 65 °C протягом 5 с і 95 °C/5 °C. Після аналізу кривих ампліфікації та кривих розчинності продуктів відносні рівні мРНК визначали методом порівняльної КТ (2-DDCt) з 18SrRNA (прямий: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 і зворотний: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30) як внутрішня посилання.

Вестерн-блот

Буфер для лізису радіоімунопрецитаційного аналізу (RIPA) використовували для лізису тканин нирки, а концентрацію білка визначали методом BCA. Для виділення білків із 50 lg зразків використовували градієнтний гель-електрофорез. Потім білки переносили на нітроцелюлозну мембрану. Після блокування 5% знежиреним молоком протягом 2 год мембрани промокнули протягом ночі при 4°C кролячими антимишачими моноклональними антитілами проти α-актину гладких м’язів (a-SMA) (1:1000, № 19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) або COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology) відповідно. На наступний день мембрани знову нагрівали при кімнатній температурі протягом 0,5 години. Після промивання TBST мембрани інкубували з HRP-кон’югатом AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H þ L) (1:1000, № BA1054, BOSTER Biological Technology) протягом 2 годин. Після повторного промивання TBST їх фарбували надвисокочутливим хемілюмінесцентним реагентом ECL для візуалізації імуноблотів. b-актин вимірювали на тій же мембрані, що й внутрішній стандарт. Експресію білків визначали кількісним визначенням відносної експресії цільових білків порівняно з b-актином.

Дані та статистичний аналіз

Усі перевірені дані виражені як середнє ± стандартне відхилення. Порівняння між двома групами проводилося за допомогою незалежного t-тесту. Порівняння між декількома групами проводили за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу, коли розподіл даних був нормальним і дисперсія однорідна. Дисперсійний аналіз Уелча використовувався для оцінки статистичної значущості, коли дисперсія була неоднорідною, з подальшим тестом Тьюкі для кількох порівнянь. Усі статистичні аналізи проводилися за допомогою програмного забезпечення GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 вважалося статистично значущим.