Терапевтичний ефект цистанозиду А на кістковий метаболізм мишей з оваріектомією

1. Вступ

Остеопороз, системний «тихий вбивця» скелета, останніми роками став серйозною небезпекою для здоров’я понад 2000 мільйонів людей у ​​всьому світі. Він характеризується низькою щільністю кісткової маси (МЩКТ) і погіршенням мікроархітектури, які є результатом надлишку резорбції кістки над формуванням кістки і, зрештою, призводять до остеопоротичних переломів. В даний час ідентифікація агентів для блокування диференціювання та резорбції остеокластів є загальною та успішною стратегією для розробки терапевтичних препаратів для лікування остеопорозу, і справді існує багато синтетичних агентів, включаючи естрадіолу валерат і алендронат натрію, які можутьпрофілактика та лікування остеопорозу. Однак ліки від захворювань далекі від ідеальних; деякі з цих препаратів можуть збільшити ризик раку ендометрія та молочної залози, а також мати певні побічні ефекти, такі як гіперкальціємія, гіперкальціурія тощо, що обмежує їх клінічне застосування. Таким чином, протягом більш ніж тисячоліття традиційні китайські ліки (ТКМ), особливо їстівні ТКМ з ізольованими біологічно активними сполуками та фракціями, широко безпечно та ефективно використовувалися в країнах Азії для профілактики та лікування різних захворювань, включаючи остеопороз.

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ТА ПРОФІЛАКТИКИ ОСТЕОПОРОЗУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Остеопороз характеризується посиленням резорбції кісткової тканини внаслідок посиленого остеокластогенезу, і цей процес включає прихильність гемопоетичних моноцитів до попередників остеокластів, які зливаються з утворенням багатоядерних остеокластів, націлених на ділянки кістки, що піддаються ремоделюванню [4]. Активатор рецептора для ліганду ядерного фактора-κB (RANKL), ключового фактора, який виділяється з остеобластів, стимулює диференціювання моноцитів в остеокласти [8,9]. Взаємодія RANKL з його рецептором RANK призводить до каскаду внутрішньоклітинних подій, включаючи NF-κB, PI3K/Akt і кальцій/кальмодулін-залежну кіназу шляхом залучення фактора, пов’язаного з рецептором рецептора TNF (TRAF6), сигнального білка адаптера. В результаті кілька маркерних генів, пов’язаних з остеокластами, включаючи TRAP, катепсин K і DPD, підвищуються, і процес резорбції кістки прискорюється.

Фенілетаноїдні глікозиди характеризуються коричною кислотою та гідроксифенілетиловими частинами, які приєднані до a-глюкопіранози (апіоза, галактоза, рамноза, ксилоза та ін.) за допомогою глікозидного зв’язку, які широко поширені в лікарських рослинах [10]. Цистанозид А (цис А) є активнимфенілетаноїдний глікозиду Cistanche deserticola YC Ma. Відповідно до записів китайської фармакопеї, C. deserticola традиційно використовувався для лікування ниркової недостатності інь, м’язової слабкості, слабкості поперекового відділу тощо, а фенілетаноїдні глікозиди є основними біоактивними компонентами цієї трави [11]. Згідно з теорією ТКМ про «нирки», нирки можуть керувати кістковою системою, що означає, що розвиток і функції кісток залежать від ниркової сутності, і ця ниркова сутність може перетворюватися на кістковий мозок, щоб живити кістки, сприяють росту та відновленню скелета та зміцнюють скелет [12]. Оскільки C. deserticola може зміцнювати нирки, ми припустили, що Cis A може запобігати та лікувати остеопороз. Таким чином, це дослідження було розроблено для підтвердження потенціалуЦис А для запобігання остеопорозуза допомогою моделі мишей з видаленою яєчником, і було визначено маркери формування та резорбції кісткової тканини, а також відповідні потенційні механізми для оцінки антиостеопоротичної біоактивності цього агента.

2. Результати та їх обговорення

2.1. Результати

2.1.1. Вплив Cis A на триточкове тестування на згинання кістки

Щоб проаналізувати, чи лікування Cis A робить кістку міцнішою, ми піддали стегнові кістки тесту на триточкове згинання. Як показано на малюнку 1, максимальне навантаження, застосоване при переломах кістки, становило 21,5% і 22.0% вище у тварин, які отримували 20 мг/кг і 80 мг/кг. кг Cis A, відповідно, порівняно з тваринами в групі оваріектомії (OVX) (p < 0.05). Між тим, лікування Cis A також посилювало жорсткість кісток; усі миші, які отримували Cis A, показали значно підвищену жорсткість з даними 121.0 ± 12,1 (p <0,05), 124,1 ± 16,2 (p < 0,05) і 127,7 ± 9,6 (p < 0,01), відповідно, у порівнянні зі 102,2 ± 10,7 мишей OVX. Результати показують, що збільшення міцності кісток у мишей OVX, які отримували Cis A, було зумовлено збільшенням кількості кістки та покращенням якості кістки.

2.1.2. Вплив Cis A на мікроархітектуру кістки

Тривимірна мікроархітектура трабекулярної кістки мишей, виміряна за допомогою мікро-КТ (рис. 2 і таблиця 1), інтуїтивно показує, що у мишей у групі OVX спостерігалося помітне зменшення трабекулярної площі та трабекулярної кількості порівняно з удаваною групою, що вказує на те, що оваріектомія може викликати значне зниження щільності кісткової маси (МЩКТ, -46%), мінерального вмісту кісткової тканини (КМК, -66%), мінерального вмісту тканини (ТМК, -85%), об'ємної фракції кісткової тканини (BVF, -82%), трабекулярне число (Tb. N, -76%) і збільшення трабекулярного поділу (Tb. Sp, +80%) без будь-яких змін загальної мінеральної щільності тканини (TMD) і товщини трабекул (Tb. Th) після операція 12 тижнів. Проте миші OVX, які отримували Cis A, призвели до дозозалежного збільшення МЩКТ (+43%~57%), BMC (+65%~73%), TMC (+83%~ 90%), BVF (+80%~88%), більше зниження Tb. Sp (-79%~88%) і подальше посилення Tb. N (+73%~82%) порівняно з групою OVX. Схоже, що оваріоектомія не вплинула на ТМД, але була значно збільшена під час лікування естрадіолу валератом (EV).

2.1.3. Вплив Cis A як на маркери формування кісткової тканини, так і на резорбцію

Вплив Cis A на маркери кісткової резорбції, включаючи TRAP, DPD, індекс формування кісткової тканини катепсину K ALP і кістковий Gla-протеїн (BGP), показано на малюнку 3. Після 12 тижнів операції оваріектомії активність TRAP, DPD і катепсину K у групі OVX значно підвищилися, особливо DPD, який збільшився майже на 55,6%; TRAP і катепсин К були посилені на 43,5% і 38,1%, відповідно, порівняно з групою плацебо. Cis A, який застосовувався перорально протягом 12 тижнів, продемонстрував значний потенціал у запобіганні всім вищезазначеним маркерам резорбції кісткової тканини, особливо високі дози (8 0 мг/кг), демонструючи значний вплив на пригнічення активності DPD на 45.0%, TRAP на 49.0% і катепсин К на 44.0% відповідно (p < 0.01), порівняно з Група OVX (рис. 3). Хоча в групі OVX була продемонстрована тенденція до зростання активності ALP і BGP, статистично значущих змін не спостерігалося. Проте значне покращення активності ЩФ спостерігалося в групах, які отримували низький і високий рівень цис-А, порівняно з групою імітації (p <0,01).

НАТУРАЛЬНА ЦИСТАНКЕ ТУБУЛОЗА ДЛЯ ПРОФІЛАКТИКИ ЗАХВОРЮВАННЯ ОСТЕОПОРОЗОМ75% ECH 30% ДІЯ 12%

2.1.4. Вплив Cis A на рівні експресії білка TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG і RANKL

Вестерн-блот аналіз показав, що порівняно з фіктивною групою рівні білка TRAF6, NF-κB і RANKL у групі OVX були значно підвищені (p < 0.05), тоді як OPG, PI3K і Akt були значно знижені (рис. 4). Цис-А (20 мг/кг або 80 мг/кг) значно знижував експресію TRAF6 (p < 0,05), після чого експресія RANKL була знижена, а OPG збільшувався, що означає підвищення співвідношення OPG/RANKL. Отже, сигнальні каскади NF-κB були знижені, а PI3K/Akt були активовані шляхом лікування Cis A (p <0,05).

2.2. Обговорення

Враховуючи обмеження сучасних терапевтичних можливостей остеопорозу, існує потреба в альтернативах їжі або природних їстівних лікарських рослин. У рамках наших постійних зусиль з виявлення ефективних антиостеопоротичних агентів з ТКМ ми знайшли серію екстрактів, фракцій і сполук, які мають антиостеопоротичні властивості [13,14]. Cistanche deserticola є важливим класичним TCM, який, як було встановлено, має сприятливий профіль безпеки [15] і широкі лікувальні функції для лікування ниркової недостатності тощо [16]. Відповідно до теорії ТКМ, ТКМ, які мають ефект активізації нирок, зазвичай буливикористовується для лікування остеопорозу; фенілетаноїдні глікозиди є основними біологічно активними компонентами цієї трави, що означає, щофенілетаноїдні глікозидиміститься в C. deserticola, може мати антиостеопорозну властивість. Було доведено, що екстракт C. deserticola може суттєво пригнічувати зниження МЩКТ і запобігати погіршенню трабекулярної мікроархітектури, викликаному OVX [17]. В експерименті in vitro він також значно підвищив ЩФ, кістковий морфогенетичний білок -2 і мРНК остеопонтину, а також мінералізацію кісткової тканини культивованих остеобластів [18]. Ехінакозид, основний біологічно активний компонент C. deserticola, офіційно зареєстрований у китайській фармакопеї [11], виявляв антиостеопоротичну активність у високій дозі 30~270 мг/кг маси тіла/день [19], а подальші результати in vitro показали, що він може сприяти регенерації кісткової тканини шляхом збільшення співвідношення OPG/RANKL у клітинах субклону 14 MC3T3-E1 [20]. Цис А був одним із глікозидів фенілетанолу, виділених з C. deserticola, і кілька звітів показали, що ця сполука має антиоксидантну активність [21] і протизапальні властивості [22, 23]. Нещодавно опублікована стаття виявила, що Cis A демонструє захисну дію як на CCl4, так і на гепатотоксичність, спричинену алкоголем, у мишей, а також продемонструвала захисну властивість щодо спричиненого етанолом пошкодження первинно культивованих мишачих гепатоцитів in vitro [24]. У нашому нинішньому дослідженні результати показали, що Cis A володів антиостеопоротичною активністю при низькій дозі (20~80 мг/кг маси тіла/день) за допомогою моделі мишей з видаленою яєчником, і ця біоактивність проявлялася шляхом зниження рівня TRAF6, пригнічення експресія RANKL і NF-κB і стимуляція OPG, PI3K і Akt, що означає, що терапевтичний ефект Cis A у мишей OVX відбувався через механізм TRAF6-опосередкованої інактивації NF-kappaB і активації PI3K/Akt.

Загальновідомо, що оваріоектомія може спричинити остеопороз із очевидним зниженням МЩКТ, біомеханічної міцності, якості кістки та мікроархітектури трабекулярної кістки, а вищезазначені зміни частково пов’язані з дефіцитом естрогену [25]. Тепер, у цьому експерименті in vivo, наше дослідження демонструє, що індукований оваріоектомією остеопороз призвів до значного зниження біомеханічної міцності та трабекулярних структурних параметрів, включаючи МЩКТ, КМК, ТМС і туберкульоз. N, і збільшення Tb. Sp; і лікування Cis A значно покращило механічні властивості кістки, включаючи максимальне навантаження та жорсткість, підвищило МЩКТ та покращило більшість параметрів мікроархітектури трабекулярної кістки порівняно з мишами в групі OVX, що вказує на ефективність Cis A у покращенні якості кісток. і трабекулярна мікроархітектура у мишей OVX.

Окрім загальної МЩКТ, триточковий тест на згинання та вимірювання мікроархітектури трабекулярної кістки могли безпосередньо діагностувати остеопороз, маркери формування кісткової тканини, включаючи ALP і BGP, і індекс резорбції кісткової тканини, включаючи TRAP, DPD і катепсин К, також використовувалися для з’ясувати відповідні антиостеопоротичні механізми Cis A. У нашому дослідженні активність ALP у мишей групи OVX продемонструвала незначну тенденцію до збільшення, що вказує на підвищену швидкість обміну кісткової тканини [26,27] при постменопаузальному остеопорозі; високі (80 мг/кг маси тіла/день) і низькі (20 мг/кг маси тіла/день) дози лікування цис-А продемонстрували значне посилення активності ЩФ порівняно з групою фіктивного лікування, тоді як на активність BGP, здавалося, не впливав оваріектомія у всіх групах, які отримували лікування; TRAP, DPD і катепсин K були значно збільшені в групі OVX, а введення Cis A помітно знизило всі три маркери кісткової резорбції. Наведені вище дані означають, що Cis A володів потенційною антиостеопоротичною активністю, і цей ефект виявлявся завдяки регуляції кісткового метаболізму, включаючи як пригнічення резорбції кістки, так і збільшення формування кістки.

Координація між остеобластом і остеокластом є критичним фактором у підтримці цілісності скелета. Остеокласти, які експресують TRAP, прикріплюються до поверхні кістки шляхом утворення зв’язаних з актином зон ущільнення, всередині яких вивільняються протеолітичні ферменти, такі як катепсин К, що призводить до утворення резорбційних ямок. Модуляція остеокластогенезу незрілими клітинами лінії остеобластів опосередковується RANKL і OPG [28]. OPG є рецептором-приманкою, який пригнічує активацію RANKL остеокластогенезу, тим самим зменшуючи резорбцію кістки. RANKL, який надає важливий сигнал попередникам остеокластів, є зв’язаною з мембраною молекулою сімейства лігандів фактора некрозу пухлини, яка сприяє утворенню остеокластів. Вважається, що співвідношення експресії OPG/RANKL є ключовим параметром остеокластогенної активності, а сигнальні каскади, активовані RANKL, включають шляхи NF-κB і PI3K [29]. Важливість шляху NF-κB для остеокластогенезу демонструє той факт, що делеція NF-κB у мишей призвела до відсутності зрілих остеокластів [30]. TRAF6 було доведено як перспективна мішень для нових антиостеопоротичних препаратів. Таким чином миші з дефіцитом TRAF6-, які демонструють дефектний остеокластогенез і важкий остеопетроз, продемонстрували важливість TRAF6 у метаболізмі кісток. Нові дані вказують на критичну регуляторну функцію для TRAF6 у RANKL/RANK-опосередкованих сигнальних каскадах [4,31]. Дані поточного дослідження показали, що лікування Cis A мишей OVX призвело до зниження рівня експресії білка TRAF6, зниження RANKL і збільшення експресії OPG, таким чином запобігаючи активації RANKL нижнього NF-κB і активації сигнальних шляхів PI3K/Akt, припускаючи, що Cis A інгібує диференціювання остеокластів шляхом TRAF6-опосередкованої інактивації NF-kappaB та активації PI3K/Akt і збільшення співвідношення OPG/RANKL, згодом пригнічуючи остеокластогенез і сприяючи формуванню кісток.

CISTANCHE TUBULOSA НАТУРАЛЬНА ДЛЯАНТИОСТЕОПОРОТИЧНА АКТИВНІСТЬPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. Матеріали та методи

3.1. Рослинні матеріали, підготовка та визначення

Стебла Cistanche deserticolaYC Ma, ідентифікований професором Сюе-Янь Фу з факультету фармації Медичного університету Нінся, були зібрані 20 вересня 2015 року в окрузі Йоннін, провінція Нінся, Китай. Зразок ваучера (№20150901) зберігався в гербарії аптечного відділу. Загалом 30,0 кг висушених на повітрі стебел C. deserticola екстрагували зі зворотним холодильником 70% етанолом (180 л, 3 × 2 години) 3 рази. Фільтрати об’єднували та піддавали колонці з макропористою смолою (AB-8) із ступінчастою градієнтною системою розчинників із збільшенням вмісту етанолу у воді (0%, 20% та 60%, кожна по 60 л), щоб отримати три фракції, потім 60% фракції додатково очищали сефадексом LH-20 (Pharmacia Biotech Co., Упсала, Швеція) та напівпрепаративною високоефективною рідинною хроматографією (Agilent 1100, Agilent Technologies, Waldbronn, Німеччина) для отримання блідо-жовтого кольору. цистанозид А 4,5 г (Цис А; вихід 0,015%). Структуру було з’ясовано в основному за допомогою аналізу даних ЯМР (Bruker Avance, 400 МГц, Німеччина) та спектрів МС (Agilent 6540, Agilent Technologies), які узгоджувалися з наведеними даними [19]. Його чистоту визначали методом нормалізації площі ВЕРХ (рис. 5). В експериментах на тваринах, на основі нашого попереднього експерименту, дозування Cis A становила 20–80 мг/кг/день.

3.2. Хімічні речовини та розчинники

Використовувалися: набір для екстракції загального білка та набори для квантування білка BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Нанкін, Китай), первинні антитіла TRAF6, NF-κB, PI3K, Akt, RANKL, OPG, -актин і тубулін ( Cell Signaling Technology, Беверлі, Массачусетс, США), вторинні антитіла козячого антикролячого IgG, кон’югованого пероксидазою хрону (ZSGB-BIO, Пекін, Китай), естрадіолу валерат (1 мг, Delpharm Lille SAS, Париж, Франція), кістковий Gla -протеїнові та дезоксипіридинолінові крос-зв'язки ELISA набори (Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Шанхай, Китай) і катепсин K ELISA набори (Biovision, Mountain View, CA, США). Усі інші використані хімікати та біохімічні агенти були реагентами AR аналітичного класу.

3.3. Експерименти на тваринах

Шістдесят самок мишей лінії Kunming віком 8 тижнів із масою тіла 260 ± 1,62 г були придбані в Медичному університеті Нінся, і 10 мишей утримували в одній клітці зі стандартною лабораторною дієтою і водопровідну воду в умовах контрольованого повітря (24.0 ± 0,5 ◦C, 45%–50% вологості та 12 годин/12 годин циклів світло-темрява). Після акліматизації протягом 1 тижня операцію проводили в асептичних умовах, і всіх мишей анестезували хлоралгідратом (100 мг/кг, внутрішньовенно); миші, яким проводили хірургічне опромінення без видалення яєчників, становили фіктивну групу (n=10); інші були піддані двосторонній оваріектомії як групи OVX (n=50). Вищевказані експерименти на тваринах проводилися відповідно до інструкції з догляду та використання лабораторних тварин і були схвалені Комітетом з біоетики Медичного університету Нінся.

Після наступного {{0}}тижневого періоду відновлення вищевказані 50 мишей OVX були випадковим чином порівну розділені на 5 груп: перорально отримували естрадіол валерат (1 мг/кг/день) як позитивний контроль (EV); з 20, 40 і 80 мг/кг/день Cis A як групи низьких, середніх і високих доз, відповідно; з носієм (0,5% карбоксиметилцелюлоза()-Na) як модельна група (OVX). Усім мишам перорально вводили рівний об’єм 1 мл/100 г ваги тіла, EV або Cis A, який починався на другому тижні після операції та тривав протягом 12 тижнів. Масу тіла вимірювали кожні два тижні з відповідним коригуванням дози. Після останнього перорального введення зразки крові відбирали зі стегнової артерії анестезованих мишей, давали згортатися і центрифугували при 3000 × g протягом 10 хвилин, щоб отримати сироватку; праві стегнова і гомілкова кістки розсічені. Усі зразки зберігалися при –80 ◦C для подальшої оцінки мікроархітектури кістки та біохімічних параметрів сироватки, пов’язаних з остеопорозом.

3.4. Випробування на триточковий згин

Біомеханічні властивості правої стегнової кістки миші визначали за допомогою триточкового згинання. Пристосування для згинання має V-подібну опору для фіксації дистального та проксимального кінців стегнової кістки під час тестування. Стегнову кістку розташовували горизонтально передньою стороною вгору, а навантаження прикладали донизу в центрі середини стегнової кістки. Відстань між опорами становила 8 мм. Кістки навантажували з постійною швидкістю зміщення 0.02 мм/с до руйнування за допомогою випробувальної машини BOSE (3220) (Bose Corporation, Endura TEC Systems Group, Міннетонка, Міннесота, США). Криві навантаження-переміщення були отримані та використані для розрахунку конструкційних властивостей та властивостей матеріалу, включаючи максимальне навантаження, пікове навантаження, модуль пружності, міцність на вигин тощо.

3.5. Аналіз мікрокомп'ютерної томографії

Праві стегнові кістки всіх мишей очищали від прилиплих м’яких тканин, а мікроархітектуру трабекулярної кістки верхньої правої дистальної стегнової кістки визначали за допомогою мікроКТ-сканера (eXplore Locus SP, GE Healthcare, Лондон, Онтаріо, Канада) з ізотропна роздільна здатність встановлена ​​на 8 мкм у всіх трьох просторових вимірах. Область інтересу (ROI) була обрана за допомогою тих самих координат у пластині росту стегнової кістки. Морфометричні параметри кістки, включаючи МЩКТ, мінеральний вміст кістки (BMC), мінеральний вміст тканини (TMC), мінеральну щільність тканини (TMD), об’ємну частку кістки (BVF), трабекулярне відділення (Tb. Sp), трабекулярне число (Tb. N). ) і товщину трабекули (Tb. Th) оцінювали шляхом аналізу ROI за допомогою програмного забезпечення для аналізу кісток ABA.

3.6. Аналіз біохімічних показників

Активність сироваткової лужної фосфатази (ALP) вимірювали на автоматичному аналізаторі (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)); рівні сироваткових DPD, BGP і катепсину К визначали за допомогою відповідних наборів реагентів, а тартрат-резистентну кислу фосфатазу (TRAP) аналізували відповідно до відповідної літератури [32].

3.7. Вестерн-блот аналіз

Рівні експресії білків TRAF6, NF-κB PI3K, Akt, OPG і RANKL у різних групах були виявлені за допомогою Вестерн-блот аналізу. Коротко кажучи, білок екстрагували з правої великогомілкової кістки миші за допомогою буфера для лізису, що містить 0.5 мМ фенілметилсульфонілфторид, інгібітори протеази та фосфатази. Лізати центрифугували протягом 10 хвилин при 12,000× g, щоб отримати супернатант для подальшого аналізу. Концентрацію білка в лізатах вимірювали за допомогою кількісного аналізу біцинхонінової кислоти. Білки (50–100 мкг) відокремлювали за допомогою 10% SDS-PAGE, переносили на мембрану з полівінілідендифториду та інкубували з моноклональними первинними антитілами, націленими на TRAF6, NF-κB RANKL, PI3K, Akt, OPG і -актин (1:500). Цю саму мембрану зняли та повторно дослідили, при цьому програмне забезпечення Image Lab виявило хемілюмінесцентні сигнали. -актин або тубулін служили внутрішнім контролем.

3.8. Статистичний аналіз

Усі дані, отримані під час експериментів на тваринах, були проаналізовані за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу за допомогою тесту Деннетта SPSS (версія 22.0, IBM SPSS Statistics, IBM Corp., Armonk, New York, NY, USA ) програмне забезпечення; значення p < 0.05 вважалося статистично значущим, і всі результати були представлені як середнє ± стандартне відхилення.

4. Висновки

Таким чином, Cis A,активні фенілетаноїдні глікозидивиділений із C. deserticola, виявляв значну антиостеопоротичну активність на мишах OVX, і молекулярний механізм може бути пов’язаний із TRAF6-опосередкованою інактивацією NF-kappaB та активацією PI3K/Akt, отже, ймовірно, є перспективним засобом для лікування остеопорозу захворювання.

CISTANCHE TUBULOSA НАТУРАЛЬНА ДЛЯАНТИОСТЕОПОРОТИЧНА АКТИВНІСТЬPHGS75% ECH 30% ACT 12%