Роль генетичного тестування в діагностичній роботі дітей із захворюваннями нирок: досвід однієї установи
Oct 18, 2023
АнотаціяпризначенняСпадкові захворювання нирок є однією з основних причин ниркової недостатності у дітей, що призводить до підвищення смертності, високих витрат на охорону здоров’я та необхідності трансплантації органів. Технології секвенування наступного покоління можуть допомогти в діагностиці рідкісних моногенних станів, дозволяючи оптимізувати медичне лікування та терапевтичний вибір.
Методи. Клінічне секвенування екзомів (CES) було виконано на когорті з 191 педіатричного пацієнта з одного закладу з подальшим секвенуванням за Сенгером для підтвердження ідентифікованих варіантів і для вивчення сімейної сегрегації. Результати Усі пацієнти мали клінічний діагноз захворювання нирок: основними категоріями захворювання були захворювання клубочків (32,5%), циліопатії (20,4%), CAKUT (17,8%), нефролітіаз (11,5%) і захворювання канальців (10,5%). 7,3% пацієнтів мали інші захворювання. Переконливий генетичний тест, заснований на валідації CES і Sanger, був отриманий у 37,1% пацієнтів. Найвищий рівень виявлення був отриманий для циліопатій (74,4%), потім нефролітіазу (45,5%) і захворювань канальців (45%), тоді як більшість клубочкових захворювань і CAKUT залишалися недіагностованими. Висновки Результати показують, що генетичне тестування, яке постійно використовується в діагностичному процесі дітей із хронічною хворобою нирок, може (i) підтвердити клінічний діагноз, (ii) забезпечити ранню діагностику у випадку спадкових захворювань, (iii) і генетичну причину раніше нерозпізнаних захворювань. захворювання та (iv) індивідуальні програми трансплантації.
Ключові слова Клінічне секвенування екзомів, Секвенування наступного покоління,Хвороби нирок, Генетичне тестування, Педіатрична когорта
НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ CISTANCHE ЗАТЕРМІНАЛЬНА СТАДІЯ НИРКОВОЇ ХВОРОБИ
вступ
Педіатричні нефропатії включають дуже різні захворювання з точки зору клінічних проявів, еволюції та терапевтичних можливостей [1–4]. Приблизно 30% дітей із хронічною хворобою нирок (ХНН) страждають на моногенний стан, цей відсоток збільшується, якщо розглядати дітей із термінальною стадією захворювання нирок (ХНН) [5, 6]. Багато з цих дітей залишаються недіагностованими на момент трансплантації [4, 6, 7]. Постановка діагнозу для цих пацієнтів не тільки означає кінець діагностичної одіссеї, але й надає кілька переваг для прогнозу, лікування та лікування
Піонерські дослідження послідовно показували, що впровадження методів секвенування наступного покоління (NGS) значно покращило ефективність діагностики у пацієнтів зі спадковими захворюваннями нирок (IKD) [8]. Зовсім недавно широке використання NGS зробило доступною генетичну діагностику в розумний час і за доступною ціною, що поставило питання про те, чи слід і коли її інтегрувати в рутинний діагностичний процес [5].
Генетична діагностика у дітей має величезне значення з різних аспектів. Перший полягає в тому, що це може бути доречним у клінічному підході до захворювання, типовим прикладом є нефротичний синдром, де ідентифікація структурних варіантів у генах, пов’язаних із подоцитами, є аргументом проти імуносупресивної терапії, яка в іншому випадку регулярно використовувалася б протягом кількох періодів. місяців [9]. По-друге, це може бути дуже важливим для сім’ї дитини та для ідентифікації інших членів, які є носіями варіанту, який, можливо, передається майбутнім поколінням. Після ідентифікації патогенного варіанту у пробанда стандартною практикою клінічної генетики є каскадне тестування членів родини та генетичне консультування носіїв варіанту [5]. По-третє, знання патогенного варіанту є важливим у контексті трансплантації, коли донор може бути родичем. Дійсно, критично важливо виключити наявність того самого варіанту(ів) у донора органу, а також критично важливо ідентифікувати всіх членів родини, які потенційно потребують трансплантації. По-четверте, деякі захворювання становлять високий ризик рецидиву після трансплантації органів, такі як фокальний сегментарний гломерулосклероз [10], або їх результат може бути покращений шляхом більш індивідуального вибору трансплантації, яка буде виконана, як у випадку первинної трансплантації. гіпероксалурія, де комбінована трансплантація нирки та печінки може призвести до кращого результату [11]. Нарешті, чіткий діагноз захворювання може бути корисним для пацієнта, щоб взяти участь у клінічних випробуваннях і отримати користь від нових варіантів лікування [12, 13].
Наприкінці 2018 року у співпраці між педіатрами-нефрологами та генетиками ми почали проводити генетичні тести на моногенні стани, які потенційно призводять до ESRD і, отже, трансплантації. Наша лікарня є найбільшою в північно-західній Італії, охоплюючи близько 5 мільйонів людей. Ми вибрали тип аналізу, що підходить для всіх, із секвенуванням клінічного екзому, тобто приблизно 6700 генів, які пов’язані з моногенними станами, зосереджуючись на панелях генів, адаптованих до клінічної підозри, і, отже, обмежуючи випадкові знахідки та скорочення часу на аналіз послідовності.
Загалом, застосовуючи цей конвеєр, ми отримали діагностичну ефективність відповідно до опублікованих даних, з певною неоднорідністю серед різних клінічних підозр, як і очікувалося. Отримані результати підтверджують актуальність включення рутинного генетичного тестування та консультування в діагностичний процес педіатричних пацієнтів з нефропатіями. Дійсно, ідентифікація причинних варіантів має вирішальне значення для клінічного лікування та, можливо, для оптимального відбору живих донорів.
Матеріали та методи
Набір пацієнтів
Дослідження базувалося на діагностичній когорті з 191 послідовних педіатричних пацієнтів (вік на момент залучення < 18 років), набраних у відділеннях дитячої нефрології, діалізу та трансплантації дитячої лікарні імені Регіни Маргарити та направлених до служби імуногенетики та біології трансплантації генетичний аналіз. Усі пацієнти, включені в дослідження, надали письмову інформовану згоду, підписану обома батьками, коли це було можливо.
Пробопідготовка, секвенування та біоінформаційні аналізи
Екстракцію нуклеїнової кислоти з периферичної крові, аналіз якості ДНК, підготовку бібліотеки та секвенування проводили, як повідомлялося раніше [14]. Необроблені дані, отримані в результаті секвенування, були перетворені у файли FASTQ, а потім узгоджені з інструментами Enrichment 3.1.0 або DRAGEN Enrichment (Illumina) і відображені в маніфесті TruSight One Expanded v2.0 із використанням геному Homo Sapiens UCSC GRCh37 як посилання для отримання однонуклеотидних варіантів, варіантів кількості копій (CNV) і структурних варіантів файлів. Для ідентифікації кількості копій використовували базову лінію, складену з даних секвенування від 5 різних пацієнтів, усі з негативними щодо CNV (відповідно до даних порівняльної геномної гібридизації). Цей підхід дозволяє виявити CNV навіть у статевих хромосомах, оскільки контрольну групу складали як особини жіночої, так і чоловічої статі, а стать суб’єкта аналізу завжди вказували під час фази вирівнювання. Виклик варіантів і пріоритезація здійснювалися за визначеними критеріями. Вирівнювання зчитування та покриття екзонів гена, що цікавить, перевірялися та відображалися за допомогою Integrative Genomics Viewer IGV, безкоштовно доступної в Каліфорнійському університеті Сан-Дієго — Університет Каліфорнії та Широкому інституті Массачусетського технологічного інституту та Гарвардського університету — Бостон (https://software.broadinstitute. org/software/igv/). Варіанти, які будуть включені в остаточний генетичний звіт, були класифіковані відповідно до критеріїв Американського коледжу медичної генетики та геноміки (ACMG).
Створення списку генів захворювань in silico
Гени, які слід розглядати для ідентифікації варіантів і визначення пріоритетів, були визначені на основі клінічних підозр. Було створено списки генів in silico, які зіставляли (i) дані з різних баз даних, співвідносячи генотип із фенотипом (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards), і (ii) дані з літератури. Доступні списки генів оновлюються раз на рік на основі нових доказів асоціації генів із захворюваннями.
Секвенування Сангера та ампліфікація зонда, залежна від мультиплексного лігування (MLPA)
Для підтвердження варіантів, визначених NGS, і для досліджень сегрегації сімей проводили аналіз секвенування Сангера та/або MLPA. Коротко кажучи, ДНК екстрагували, починаючи з другої незалежної аліквоти периферичної крові пробанда та від батьків. Ділянки ДНК, що представляють інтерес, були ампліфіковані за допомогою ПЛР з використанням спеціальних експериментальних умов. Чистоту та специфічність ампліфікованих ділянок перевіряли 0.8 або 1,5% агарозним гелем. Ампліфіковані продукти ПЛР потім секвенували за Сенгером з використанням тих самих праймерів. Для варіантів PKD1 валідацію проводили за допомогою ПЛР великої дії з наступною вкладеною ПЛР, щоб уникнути будь-яких висновків з псевдогенів.
Результати
Визначення критеріїв повернення результатів генетичного аналізу
We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 генів, які беруть участь у різних формах захворювань нирок [14]. Для цього дослідження ми реалізували аналіз із субпанелями, зосередженими на конкретній клінічній категорії підозри (наприклад, CAKUT, гломерулопатія, тубулопатія тощо), і попередньо визначили конкретну групу генів для аналізу. Цей підхід обмежив кількість аналізованих генів, спростивши аналізи та зменшивши кількість випадкових знахідок. Лише тоді, коли в кінці аналітичного поля з відповідною панеллю (панелями) генетичний результат був негативним і (i) клінічний фенотип не був чітко визначений або (ii) перекривав різні категорії захворювань, генетичний аналіз був розширений до т.зв. "kidney full-list або kidneyome", супер-панель, що містить усі гени, включені в підпанелі.
Як перший крок, ми визначили набір критеріїв для інтерпретації результатів NGS. Після виконання клінічного секвенування екзомів (CES) і вирівнювання даних було визначено конвеєр аналізу для фільтрації відповідних варіантів. Зокрема, на основі клінічної підозри ідентифіковані варіанти були відфільтровані на основі списків генів in silico, специфічних для різних макрокатегорій захворювань. Синонімічні варіанти, які не впливають на механізм сплайсингу, або інтронічні варіанти, які не відображаються в області сплайсингу, були виключені, зберігаючи до уваги лише варіанти без синонімів, нонсенсу, зміщення кадру та варіанти, що впливають на зрощування. Було включено десять лише рідкісних варіантів (частота менше 1% у популяції) та варіанти з частотою алелів у пацієнта щонайменше 0.2 та охопленням щонайменше 20 читань. Решта варіантів були анотовані та додатково підібрані на основі (i) способу успадкування, (ii) збереження нуклеотидів, (iii) впливу білка, використання різних баз даних для перевірки балів та (iv) літератури, якщо така є. На цьому етапі відфільтровані варіанти були перераховані в так званому «технічному звіті». Технічний звіт був інтерпретований медичним генетиком для отримання остаточного генетичного звіту для пацієнта та його/її родини. Під час генетичної консультації було запропоновано дослідження сімейної сегрегації, щоб (i) підтвердити варіанти в пробанді та (ii) включити/виключити непричинні варіанти на основі їх сегрегації в сім’ї (рис. 1).
Прийнявши ці критерії, ми змогли визначити три різні категорії генетичних звітів. По-перше, «заключний звіт», який включав патогенні (C5) і ймовірно патогенні (C4) варіанти. Повідомлення про варіанти невідомої значущості (C3) вважалися переконливими, лише якщо вони повністю сумісні з клінічною картиною та якщо дослідження сімейної сегрегації підтвердили їх можливу роль. По-друге, «невизначений звіт», який включав варіанти C3, ідентифіковані CES, які ще не підтверджені або не можуть бути перевірені в контексті досліджень сегрегації сімей, або варіанти C4/C5, які не повністю відповідали клінічному фенотипу. По-третє, «непереконливий звіт», який включав (i) негативний аналіз CES, що означає, що NGS не виявила жодних варіантів; (ii) одиничні варіанти рецесивних генів; і (iii) варіанти С3, які не відповідають клінічному фенотипу, виявлені, коли аналіз було поширено на всігени, пов'язані із захворюваннями нирок(Рис. 1).
Основні ознаки набраної когорти
У цьому дослідженні описується когорта з 191 педіатричного пацієнта (0–18 років), які були послідовно направлені дитячим нефрологічним відділенням для генетичного аналізу з листопада 2018 року по травень 2022 року, із зарахуванням у середньому 50 нових пацієнтів щороку. . Критеріями для генетичного тестування були (i) нефропатія, пов’язана з позитивним сімейним анамнезом захворювання нирок або (ii) клінічна підозра на моногенний стан або (iii) необхідність виключити моногенний стан (як у випадку нефротичних синдромів, де розрізняють моногенні проти немоногенних захворювань є клінічно значущим для прогнозу та лікування).
Когорту було розділено на основі клінічної підозри, враховуючи 6 різних макрокатегорій захворювання: вроджені аномалії нирок і сечовивідних шляхів (CAKUT; n=34), циліопатії (n=39), гломерулопатії (n=62), нефролітіаз (n=22), таупатії (n=20) та інші захворювання, які включали також синдромні фенотипи (n=14). За винятком CAKUT і тубулопатій, які продемонстрували рівномірний розподіл між жінками та чоловіками, у всіх інших категоріях спостерігалося переважання чоловіків (рис. 2a). При розгляді віку прийому на роботу не було виявлено значних відмінностей у розподілі між різними групами, із середнім віком від 6,7 до 10 років у «Інших захворюваннях» та гломерулопатіях відповідно. Однак, дивлячись на середній вік, хвороби CAKUT показали найнижче значення (4,6 років), що відповідає вродженому фенотипу. З точки зору етнічної приналежності, незалежно від розглянутої макрокатегорії захворювання, більшість пацієнтів були європейцями, за ними йшли африканці, і лише кілька пацієнтів були азіатами, латиноамериканцями або схрещеними (рис. 2b). Серед когорти лише 8 пацієнтів мали кровноспоріднених батьків.
Рис. 1 Схема аналізу генетичних даних і критерії для включення варіантів. Схематичне представлення аналітичного конвеєра, прийнятого для ідентифікації варіантів і встановлення пріоритетів, включаючи всі критерії фільтрації та фільтрації. Отримані варіанти були включені в остаточний генетичний звіт. Коли це було можливо, проводили валідацію варіантів і дослідження сегрегації сімей. Генетичні звіти були класифіковані як переконливі, невизначені або непереконливі на основі вказаних критеріїв. На основі цієї класифікації було розраховано швидкість діагностики нашого робочого процесу секвенування наступного покоління (NGS). 1 кг: база даних 1000 геномів; Alt fr: змінена частота; C3: варіант невідомого значення; C4: ймовірний патогенний варіант; C5: патогенний варіант; АР: аутосомно-рецесивний
Нарешті, беручи до уваги сімейний анамнез щодо захворювань нирок, розглядаючи окремо чоловіків і жінок, гетерогенність у розподілі між позитивними та негативними випадками була очевидною з огляду на різні категорії захворювань. Загалом, більшість набраної когорти незалежно від статі не характеризувалася позитивним сімейним анамнезом, як показано для CAKUT, гломерулопатій, тауопатій та інших розладів нирок. Однак при циліопатіях і нефролітіазі значна частина випадків мала позитивну сімейну історію з різним розподілом між жінками та чоловіками (13 випадків з 22 для циліопатій і 5 з 12 для нефролітіазу; рис. 2c).
З клінічної точки зору когорта була досить гетерогенною з різними первинними захворюваннями (рис. 2d). Серед них найбільш повторними клінічними підозрами були полікістоз нирок (n=27), CAKUT (n=25), нефротичний синдром (n=19), фокальний сегментарний гломерулосклероз (ФСГС; n). =14) і синдром Альпорта (n=13; рис. 2d).
Служба підтримки Wecistanche - найбільшого експортера cistanche в Китаї:
Електронна адреса:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Тел.:+86 15292862950
Зверніться в магазин, щоб дізнатися більше про технічні характеристики:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
НАТИСНІТЬ ТУТ, ЩОБ ОТРИМАТИ НАТУРАЛЬНИЙ ОРГАНІЧНИЙ ЕКСТРАКТ ЦИСТАНШИ З 25% ЕХІНАКОЗИДУ ТА 9% АКТЕОЗИДУ ПРИ ІНФЕКЦІЇ НИРОК
