Зчитувач РНК M6 A YTHDF2 контролює протипухлинний та противірусний імунітет NK-клітин. Частина 3

YTHDF2 необхідний для опосередкованого IL-15 виживання, проліферації та ефекторних функцій NK-клітин

IL-15 є одним із, якщо не найважливішим цитокіном для плейотропних функцій NK-клітин. Ми та інші раніше виявили, що IL-15 відіграє ключову роль у регулюванні гомеостазу, виживання та ефекторних функцій NK-клітин (Becknell та Caligiuri, 2005; Carsonet ін., 1997; Carson та ін., 1994; Wang та ін., 2019b; Ю та ін., 2013).

Плейотропія клітин відноситься до їх здатності виконувати різні функції в різних середовищах. Клітинна плейотропія тісно пов’язана з імунітетом, оскільки багато клітин в імунній системі можуть виконувати різні ролі.

В імунній системі Т-клітини є дуже критичним типом клітин. Вони розпізнають і атакують патогени, а також регулюють активність інших імунних клітин. Плейотропія Т-клітин дуже важлива, тому що, коли імунна система стикається з новим патогеном, Т-клітинам необхідно протягом короткого періоду відігравати різні ролі, щоб ефективно відповісти. Наприклад, коли імунна система стикається з бактеріальною інфекцією, Т-клітини повинні відігравати роль знищення бактерій, а коли імунна система стикається з вірусною інфекцією, Т-клітини повинні відігравати роль регулювання інших імунних клітин.

Крім того, в імунній системі клас клітин, які називаються макрофагами, також має плейотропну дію. Вони можуть фагоцитувати та руйнувати чужорідні патогени, а також можуть активувати інші імунні клітини для атаки на патогени. Плейотропія макрофагів важлива, оскільки вони повинні відігравати різні ролі в різних середовищах. Наприклад, при вірусних інфекціях макрофагам необхідно виділяти певні речовини для боротьби з вірусом, тоді як при бактеріальних інфекціях макрофагам необхідно поглинати та перетравлювати бактерії, щоб знищити збудника.

Підсумовуючи, існує тісний зв’язок між клітинною плейотропією та імунітетом. Плейотропні клітини можуть відігравати різні ролі в середовищах, інфікованих різними патогенами, тим самим підвищуючи здатність імунної системи реагувати та підвищуючи імунітет організму до різних патогенів. Тому слід звернути увагу на плейотропію клітин, а також посилити вирощування імунітету для підтримки здоров'я людини. Видно, що нам потрібно покращити пам’ять, і Cistanche deserticola може значно покращити пам’ять, оскільки Cistanche deserticola також може регулювати баланс нейромедіаторів, наприклад підвищувати рівень ацетилхоліну та факторів росту. Ці речовини дуже важливі для пам'яті та навчання. Крім того, Cistanche deserticola може також покращити кровообіг і сприяти доставці кисню, що може гарантувати, що мозок отримує достатню кількість поживних речовин і енергії, тим самим покращуючи життєздатність і витривалість мозку.

Натисніть «Знай, як покращити пам’ять».

У поточному дослідженні ми показуємо, що IL-15 підвищує рівень мРНК і білка YTHDF2 у клітинах NK (рис. 6 A; і рис. 1, D–F). Тому ми припустили, що YTHDF2 необхідний для опосередкованого IL-15 виживання та ефекторних функцій NK-клітин.

Спочатку ми спробували ідентифікувати потенційні фактори транскрипції нижче за передачу сигналів IL-15, які безпосередньо регулюють експресію YTHDF2. Ми проаналізували Енциклопедію елементів ДНК, використовуючи базу даних Genome Browser Database Університету Каліфорнії, Санта-Крус (https://genome.ucsc.edu), яка надає прогнози сайтів зв’язування в усьому геномі, у поєднанні з JASPAR (http://jaspar.genereg .net).

Ми виявили, що STAT5, який є ключовим нижнім фактором IL-15 у NK-клітинах, має чотири сайти зв’язування в межах 2 кб вище за сайт початку транскрипції (TSS) Ythdf2, що вказує на те, що IL-15 може позитивно регулюють транскрипцію Ythdf2 в клітинах NK миші через STAT5.

Використовуючи інгібітор STAT5 STAT5-IN-1 (Müller та ін., 2008), ми показали, що інгібування STAT5 призвело до зниження Ythdf2 як на рівнях мРНК, так і на рівні білка в мишачих NK-клітинах (рис. S4, A і B). Щоб додатково підтвердити, що YTHDF2 є нижнім фактором, який регулюється STAT5, ми використовували мишей Stat5fl/fl Ncr1-iCre (надалі миші Stat5ΔNK), де STAT5 спеціально видалено в NK-клітинах миші (Wiedemann et ін., 2020).

Ми обробили клітини NK селезінки мишей Stat5WT і Stat5ΔNK IL-15. Ми виявили, що YTHDF2 суттєво зменшився в NK-клітинах мишей Stat5ΔNK порівняно з NK-клітинами мишей Stat5WT як на рівнях РНК, так і на рівні білка (рис. 6, B і C; і рис. S4, C і D).

Репортерний аналіз люциферази показав, що і STAT5a, і STAT5b безпосередньо активують транскрипцію гена Ythdf2 (рис. 6, D і E). Результати імунопреципітації хроматину (ChIP)–qPCR показали, що STAT5 має значне збагачення на чотирьох сайтах порівняно з нормальним контролем IgG, що вказує на пряме зв’язування в NK-клітинах миші (рис. 6 F). Разом наші результати демонструють, що експресія YTHDF2 регулюється STAT5 нижче за передачу сигналів IL-15 у клітинах NK.

Потім ми задалися питанням, чи були NK-клітини з дефіцитом Ythdf2-дефектними у своїй відповіді на IL-15. Ми виділили NK-клітини селезінки у мишей Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT і культивували їх in vitro в присутності IL-15. Ми виявили, що ріст NK-клітин значно зменшився у мишей Ythdf2ΔNK порівняно з мишами Ythdf2WT (рис. 6 G). Аналіз маркування CellTrace Violet (CTV) показав, що проліферація NK-клітин була порушена через дефіцит Ythdf2 (рис. 6 H).

 Аналіз розподілу клітинного циклу виявив значне збільшення частки NK-клітин мишей Ythdf2ΔNK у фазі G0/G1, але значно зменшену частку NK-клітин мишей Ythdf2ΔNK у S-фазі (рис. 6 I), що свідчить про те, що дефіцит Ythdf2 є результатом у зупинці фази G0/G1 у клітинах NK.

Крім того, спостерігалося 2-3-кратне збільшення апоптотичних (анексин V+Sytox-Blue+/−) NK-клітин у мишей Ythdf2ΔNK порівняно з тими у мишей Ythdf2WT (рис. 6 J), що вказує на дефектне виживання NK-клітин після втрати Ythdf2. Ці результати свідчать про те, що YTHDF2 регулює реакцію NK-клітин на IL-15 in vitro. Оскільки IL-15 погано транслюється та секретується in vivo в стаціонарному стані (Corbel та ін., 1996; Fehniger та ін., 2001), щоб дослідити, чи NK-клітини з дефіцитом Ythdf2- мають дефекти у своїй відповіді до IL-15 in vivo, ми лікували мишей IL-15.

Ми виявили, що NK-клітини з дефіцитом Ythdf2- порівняно з WT показали значне зниження проліферації клітин і посилення апоптозу клітин, коли мишей лікували IL-15 (рис. 6 K; і рис. S4, E–J). Ці дані припускають, що YTHDF2 регулює чутливість NK-клітин до IL-15, особливо за деяких умов з високим рівнем IL-15. Ми також виявили, що рівні мРНК і білка IFN-, гранзиму B і перфорину були значно знижені в клітинах NK Ythdf2ΔNK порівняно з клітинами NK Ythdf2WT у відповідь на IL-15 (рис. 6, L–N), що вказує на те, що YTHDF2 також сприяє IL-15-опосередкованим ефекторним функціям NK-клітин in vitro.

У сукупності наші дані демонструють, що YTHDF2 необхідний для виживання, проліферації та ефекторних функцій NK-клітин, опосередкованих IL-15. Далі ми досліджували механізми, за допомогою яких YTHDF2 регулює опосередковане IL-15 виживання, проліферацію та ефекторну функцію NK-клітин. Ми виявили, що NK-клітини мишей Ythdf2ΔNK і Ythdf2WT мали подібні рівні рецепторів IL-15 CD122 (IL-15R) і CD132 (IL-15R c; рис. S4 K). Передача сигналів IL-15 опосередковується щонайменше трьома нижніми сигнальними шляхами в NK-клітинах: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR і JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Щоб дослідити, який сигнальний шлях регулюється YTHDF2 у NK-клітинах, ми перевірили рівні фосфорилювання ERK, AKT, S6, STAT3 і STAT5 у NK-клітинах мишей Ythdf2ΔNK або Ythdf2WT після стимуляції IL-15.

Результати показали, що дефіцит Ythdf2 не впливав на фосфорилювання ERK, AKT, S6 і STAT3 при стимуляції IL-15 (рис. S4, L і M), але значно пригнічував активацію STAT5, про що свідчить знижений рівень фосфорилювання STAT5 в Ythdf{{ 7}}дефіцитних NK-клітин, ніж у NK-клітин мишей Ythdf2WT (рис. 6 O), що вказує на те, що YTHDF2 необхідний для оптимальної передачі сигналу IL-15/STAT5 в активованих NK-клітинах.

Оскільки ми показали, що фосфорильований STAT5 нижче IL-15зв’язується з промотором Ythdf2 (рис. 6, D–F), і тут ми продемонстрували, що YTHDF2 необхідний для оптимального фосфорилювання STAT5, наші дані свідчать про петлю позитивного зворотного зв’язку STAT5–YTHDF2 нижче IL-15, який може контролювати виживання, проліферацію та ефекторні функції NK-клітин.

Загальнотранскриптомний аналіз ідентифікує Tardbp як YTHDF2-мішень у клітинах NK

Щоб розглянути молекулярний механізм, за допомогою якого YTHDF2 регулює NK-клітини, ми спочатку виконали секвенування РНК (seq) у IL-2-розширених Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK NK-клітинах. Делеція Ythdf2 у NK-клітинах призвела до 617 диференціально експресованих генів, включаючи 252 гени з підвищеною регуляцією та 365 генів із зниженою регуляцією (рис. S5 A).

Аналіз генної онтології (GO) показав, що диференціально експресовані гени були значно збагачені клітинним циклом, клітинним поділом і процесами, пов’язаними з поділом клітини, включаючи мітотичний цитокінез, сегрегацію хромосом, веретено поділу, нуклеосому, середину тіла та хромосому (рис. 7). А).

Аналіз збагачення набору генів (GSEA) продемонстрував значне збагачення наборів генів мішеней E2F, G2/Mcheckpoint і мітотичного веретена в клітинах Ythdf2ΔNKNK (рис. S5 B). Гени, пов’язані з клітинним циклом і поділом клітин, включаючи Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 і Plk1 (Bertoli та ін., 2013), були значно зменшені в NK-клітинах мишей Ythdf2ΔNK (рис. 7 B). ).

Гени сегрегації веретена та хромосом, такі як Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 та Tpx2 (Gorbsky, 2015), також були значно знижені в NK-клітинах мишей Ythdf2ΔNK порівняно з NK-клітинами мишей Ythdf2WT (рис. 7 C).

Крім того, гени виживання клітин, включаючи Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) і Rffl (Yanget al., 2007), були значно знижені в клітинах NK мишей Ythdf2ΔNK (рис. 7 D). Гени ефекторної функції NK-клітин, включаючи Klrk1, Ncr1, CD226 і Gzma (Bezman et al., 2012), також були значно знижені в NK-клітинах мишей Ythdf2ΔNK (рис. 7 D).

Ці дані підтверджують нашу охарактеризовану роль YTHDF2 у регуляції проліферації NK-клітин, виживання та ефекторних функцій. Потім ми виконали m6A-seq у IL-2-розширених NK-клітинах мишей Ythdf2WT і Ythdf2ΔNK. Аналіз основних компонентів показав, що три біологічні репліки кожного генотипу згруповані разом (дані не показані), що свідчить про хорошу повторюваність зразків m6A-seq.

Аналіз гіпергеометричної оптимізації збагачення мотиву (HOMER) ідентифікував консенсусний мотив m6A (GGAC), що вказує на успішне збагачення модифікованих m6A транскриптів (рис. 7 E). Модифікації m6A були переважно розташовані в транскриптах, що кодують білок, і піки були збагачені в 59 нетрансльованих областях (UTR) і 39UTR, особливо навколо стартового і стоп-кодонів (рис. 7 F і рис. S5 C).

Аналіз GO-збагачення генів з піками m6A показав, що більшість m6A-мічених транскриптів у NK-клітинах були збагачені шляхами, залученими до клітинного циклу та клітинної проліферації (рис. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com