Протеїн-незалежна роль фосфату в прогресуванні хронічної хвороби нирок
Mar 20, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
Ірен Фаріа Дуаєр1 та ін
Анотація:Декілька факторів сприяютьниркова функціязниження кількості пацієнтів із ХХН, а роль вмісту фосфатів у дієті все ще є предметом дискусій. Це дослідження спрямоване на аналіз механізму, за допомогою якого фосфат, незалежно від білка, пов’язаний із прогресуванням ХХН. Дорослим щурам Munich-Wistar проводили 5/6 нефректомію (Nx), годували дієтою з низьким вмістом білка та розділили на дві групи. Лише вміст фосфатів (низький вміст фосфату, LoP, 0.2 відсотка; високий вміст фосфату, HiP, 0.95 відсотка) диференціював дієти. Через шістдесят днів біохімічні показники іниркааналізували гістологію. У групі HiP була гірша функція нирок, з вищими рівнями ПТГ, FGF-23 і частковою екскрецією фосфату. У гістологічному аналізі ниркової тканини вони також показали вищий відсоток інтерстиціального фіброзу, експресію -актину, PCNA танирковийінфільтрація макрофагами. Група LoP продемонструвала вищу експресію беклін-1 у клітинах ниркових канальців, маркера аутофагічного витоку, порівняно з групою HiP. Наші висновки підкреслюють дію фосфату на індукціюниркаінтерстиціальне запалення та фіброз, що сприяє прогресуванню захворювання нирок. Можливий вплив фосфату на дисрегуляцію механізму аутофагії ниркових клітин потребує подальшого дослідження за допомогою клінічних досліджень.
Ключові слова:фосфат;дієта; ХХНпрогресування;нирковийфіброз; аутофагія;апоптоз
Ключовий внесок:Механізми захисту нирок шляхом обмеження фосфатної дієти ще належить визначити. У цьому дослідженні перевантаження фосфатами впливало на прогресування ХХН шляхом активації шляхів запалення та індукціїниркаінтерстиціальний фіброз. Вплив гіперфосфатемії на апоптоз ниркових клітин і аутофагію потребує подальшого дослідження.
Cistanche tubulosa запобігає захворюванням нирок, натисніть тут, щоб отримати зразок
1. Введення
Хронічнийнирказахворювання (ХХН) вважається проблемою громадського здоров’я. Його поширеність зростає з віком і коливається від 11 до 13 відсотків у всьому світі [1]. Незважаючи на те, що ХХН, як правило, є необоротним станом, для уповільнення прогресування захворювання можна застосувати кілька підходів, таких як контроль артеріального тиску, дисліпідемії та гіперглікемії, застосування інгібіторів ангіотензинперетворювального ферменту та дієта з низьким вмістом білка [2–7]. . Серед цих стратегій дієта з низьким вмістом білка є найбільш дискусійною пропозицією щодо відстрочкинирказниження функції через сумніви щодо відповідності, безпеки та ефективності. Відсутність консенсусу щодо переваг зменшення білка в раціоні залежить від часткової ролі вмісту білка та фосфату в раціоні. Оскільки джерела білка багаті фосфатами, для досягнення обмеженого споживання фосфатів рекомендується скоротити споживання білка. Можна обмежити білок без обмеження фосфату, хоча навпаки важко.
В експериментальних дослідженнях ефект дієти з низьким вмістом білка захищав моделі ХХН від ушкодження клубочків і протеїнурії [8], сприяючи більшому збереженню швидкості клубочкової фільтрації [9]. Слід зазначити, що дієтичний білок і фосфати сильно корелюють. Таким чином, хоча деякі експериментальні дослідження були зосереджені на оцінці ізольованого ефекту обмеження білків, вони також могли бути необ’єктивними через ненавмисне обмеження фосфатів. З іншого боку, було чітко продемонстровано індивідуальний внесок дієти, багатої на фосфати, у розвиток ХХН [10,11]. Було показано, що дієта з високим вмістом фосфатів викликає більше інтерстиціальностіниркафіброз і тубулярна атрофія з мінімальним гломерулосклерозом у щурів з уремією. Цікаво, що пошкодження було притуплено після обмеження фосфату [12]. Слід зазначити, що вміст білка в раціоні не згадувався в цьому дослідженні.
У клінічному сценарії дієта з низьким вмістом білка знижувала концентрацію уремічних токсинів і зберігала залишкову функцію нирок навіть при переході від консервативного лікування до схем інкрементального діалізу [13].ДієтичнийбілокУ недавньому мета-аналізі обмеження також сповільнило прогресування ХХН [14]. Однак, оскільки обмеження білка корелювало з нижчими рівнями фосфатів у сироватці крові, цей сприятливий ефект дієти міг бути частково пояснений обмеженням фосфатів. Найбільше проспективне дослідження на даний момент, MDRD [15], показало лише невелику користь дієти з низьким вмістом білка у пацієнтів з помірною нирковою недостатністю, тоді як у пацієнтів з тяжкою нирковою недостатністю прогресування захворювання нирок не вплинуло. Тим не менш, вміст фосфату в раціоні не розглядався в цьому дослідженні та вплив його індивідуального внеску в уповільненняХХНпрогресування залишається невідомим.
Відомо, що фосфат може знизити нирковий і циркулюючий Klotho [16], білок проти старіння, який бере участь у цитозахисті та антифіброзі, має антиоксидантну та антиапоптотичну дію [17]. Крім того, вже було продемонстровано дефектну аутофагію в ниркових клітинах через дефіцит Klotho [18]. Аутофагія - це катаболічний процес з критичними функціями підтримки клітинного гомеостазу та збереження життєздатності клітин в умовах стресу. Деякі докази свідчать про зв’язок між аутофагією та прогресуванням ХХН різними шляхами, включаючи передачу сигналів TGF [19], потужний фіброгенний фактор розвитку фіброзу нирок. TGF- впливає на кілька біологічних процесів, регулюючи проліферацію та диференціювання клітин, апоптоз, і діє шляхом зв’язування зі специфічними трансмембранними рецепторами, які індукують внутрішньоклітинну передачу сигналів, опосередковану білками SMAD [20]. Апоптоз — це механізм запрограмованої смерті клітин, який відрізняється від некрозу. Фосфат був описаний як медіатор апоптозу в експериментальних моделях ендотеліальних [21], остеобластних [22] і перитонеальних мезотеліальних клітин [23]. Є дані про участь апоптотичної загибелі клітин у прогресуванніниркапошкодження [24], але вплив фосфату на апоптоз ниркових клітин ще не з’ясовано.
Оскільки механізм, за допомогою якого дієта з високим вмістом фосфатів прискорює прогресування ХХН, ще не повністю з’ясований, ми припустили, що це може бути пов’язано з дисфункціональним аутофагічним побратимом. Таким чином, у поточному дослідженні ми оцінили дві групи щурів Munich-Wistar відповідно до вмісту фосфату в їхньому раціоні (низький 0.2 відсотка проти високого 0.95 відсотка) і перевірили вплив дієта з низьким вмістом фосфатів нанирки' гістологічні та імуногістохімічні зміни, включаючи маркер аутофагії, беклін-1.
2. Результати
Гемодинамічні, морфологічні та біохімічні параметри, отримані від груп дієти з низьким (LoP) і високим вмістом фосфатів (HiP), наведені в таблиці 1. Як і очікувалося, нефректомія 5/6- спричинила зниження кліренсу креатиніну та підвищення сечовини та креатиніну сироватки в обох групах. Тварини з групи HiP показали нижчу функцію нирок, про що свідчить вищий креатинін і нижчий кліренс креатиніну; вони також продемонстрували нижчий гематокрит і меншу кінцеву вагу. У групі HiP спостерігалося збільшення сироваткової та фракційної екскреції фосфату, а також паратиреоїдного гормону (ПТГ) і фактора росту фібробластів-23 (FGF-23). Слід зазначити, що каудальний тиск, початкова вага та екскреція альбуміну з сечею були подібними між групами.
Гістологічні результати показані на малюнках 1–3. Гломерулосклероз (ГС) майже не виявлявся в обох групах. Однак відсоток інтерстиціального фіброзу був значно вищим серед щурів у групі HiP. Відповідно, ці тварини також мали вищий відсоток гладкої мускулатури, пофарбованої актином, і більшу ниркову інфільтрацію макрофагами, оцінювану за експресією ED-1, як показано в таблиці 2. Експресія фосфорильованого SMAD (p-SMAD), маркер активації шляху TGF-бета, не відрізнявся між групами.
Клітини, позитивні на ядерний антиген проліферативних клітин (PCNA), переважали в групі HiP, що свідчить про те, що перевантаження фосфатами сприяє більш інтенсивній проліферації ниркових клітин. І навпаки, кількість апоптотичних клітин, як правило, була вищою в групі LoP. Подібним чином, беклін 1-позитивні клітини були значно вищими в тубулоінтерстиціальних ураженнях у групі LoP, що вказує на можливий вплив вищого вмісту фосфату в інгібуванні регенеративного аутофагічного процесу наниркатканина.
3. Обговорення
У цьому експериментальному дослідженні досліджували, чи є обмеження фосфатів у дієті ефективним заходом для уповільнення прогресування ХХН, незалежно від супутнього обмеження споживання білка в їжі. Ми досліджували вплив дієт з різним вмістом фосфату ({{0}}.2 проти 0,95 відсотка) на моделі тварин після нефректомії 5/6-, при цьому всі тварини отримували дієту з низьким вмістом білка (12 відсотків). Наші результати показали, що дієта з високим вмістом фосфатів була пов’язана з гіперфосфатемією, незважаючи на збільшення ПТГ, FGF-23 і, як наслідок, фракційного виведення фосфату. Крім того, HiP викликав порушення функції нирок і збільшення інтерстиціального фіброзу, що було пов’язано з вищою експресією -актину, інфільтрацією макрофагів і клітинною проліферацією, а також пригніченням аутофагії.
Мета-аналіз 12 когортних досліджень за участю 25 546 пацієнтів із ХХН, які не перебувають на діалізі, продемонстрував незалежний зв’язок між рівнями фосфатів у сироватці крові,нирканевдача та смертність [25]. Крім того, ретроспективне когортне дослідження за участю 13 772 пацієнтів, які перенесли діаліз, виявило зв’язок між гіперфосфатемією та іншими аномаліями ХХН – мінерально-кістковими розладами з більш різким зниженням залишковоїниркафункція [26]. Механізм, за допомогою якого обмеження фосфатів затримує прогресування ХХН, ще не встановлено. В експериментальному дослідженні ми показали, що дієта, збагачена фосфатами, була пов’язана з більшим порушенням функції нирок порівняно з дієтою з низьким вмістом фосфатів у щурів Вістар, яким проводили паратиреоїдектомію та 5/6-нефректомію з використанням фіксованої паращитовидної залози. прийом гормонів (ПТГ) [11]. Кусано та ін. [10] показали, що захист функції нирок був пов’язаний з дієтою з низьким вмістом фосфатів (0.3 відсотка), незалежно від вмісту білка в раціоні щурів з уремією. Проте щури зі звичайним фосфатним (0,5 відсотка) раціоном демонстрували ці переваги, лише якщо їх годували дієтою з дуже низьким вмістом білка (8,4 відсотка). У сукупності ці результати вказують на те, що харчові фосфати можуть бути більш потужними, ніж харчові білки. Однак жодне з вищезазначених досліджень не намагалося дослідити потенційні шляхи, які можуть бути залучені до пов’язаного з фосфатами пошкодження нирок.
Дія фосфатного навантаження на прогресування ХХН була предметом кількох досліджень. Мітки та ін. вперше запропонував таку можливість на тваринній моделі, але харчовий [27] білок не контролювався, що, можливо, маскувало ізольований ефект фосфату. Передбачувана користь незалежного від фосфатів обмеження, а не обмеження білків у сценарії ХХН, становить великий інтерес, оскільки ризик контролю рівня фосфату в сироватці разом із обмеженим споживанням білка може призвести до недоїдання та спричинити вищу смертність.
Вміст фосфатів у дієті не обов’язково визначає концентрацію фосфатів у сироватці крові у пацієнтів із ХХН [28], що підкреслює важливість обмеження дієти незалежно від концентрації цього елемента в сироватці крові. Патологічний вплив фосфатів на кістки та серцево-судинну систему спонукає до втручань для лікування гіперфосфатемії. У клінічній практиці втручання для зниження рівня фосфатів складаються з дієтичних обмежень і фосфатзв’язуючих засобів. Хоча переваги цього підходу щодо клінічних кінцевих точок були сумнівними в дослідженні невеликого розміру вибірки [29], з огляду на те, що надлишок фосфатів є відповідальним за надмірне виробництво ПТГ і FGF-23, доцільно підтримувати рівень фосфатів якомога нижчий у пацієнтів із ХХН [30].
Дієта з низьким вмістом білка викликає низьку біодоступність фосфату та знижує сироватковий FGF-23 [31,32], медіатор натрійзалежної реабсорбції фосфату на клітинах ниркових канальців. Це свідчить про те, що на механізм регуляції фосфатів при пізніх стадіях ХХН може певним чином впливати споживання фосфатів абсолютно незалежно від вмісту білкової дієти. З цієї причини ми оцінили вплив фосфатної дієти на прогресування ХХН у моделі 5/6-нефректомії. Попереднє експериментальне дослідження вже продемонструвало, що фосфат може змінювати антипротеїнуричну реакцію на дієту з дуже низьким вмістом білка (0,3 г/кг), демонструючи кореляцію між рівнями фосфату в сироватці крові та фосфатурією з антипротеїнуричною відповіддю на обмеження білкової дієти, незалежно від функції нирок [33]. У перехресному дослідженні, яке включало 11 пацієнтів із ХХН (рШКФ 30–55 мл/хв/м2), циркадний ритм сироваткових фосфатів був змінений під час дієти з високим вмістом фосфатів, що не пояснювалося екскрецією фосфатів із сечею, ПТГ або ФРГ. -23 [34]. Цей результат підсилює важливість обмеження фосфатної дієти у пацієнтів із ХХН як незалежної терапевтичної мішені.
Схоже, що гемодинамічний статус не впливає на погіршення функції нирок у групі HiP, оскільки артеріальний тиск був подібним в обох групах. Крім того, ми не виявили значних пошкоджень клубочків у нашій моделі, що можна пояснити обмеженням білка. Однак ми помітили більше інтерстиціального фіброзу в групі дієти HiP.
Інтерстиціальний фіброз добре корелює з втратою функції нирок у людей і щурів.
Попереднє дослідження пов’язувало розвиток фіброзу нирок, спричиненого дієтою з високим вмістом фосфатів, через пептидил-пролілізомеразу Pin 1 [35], тоді як інші роботи вказували на шкідливу роль дефіциту aKlotho наниркафіброз тканин [36,37]. Генетична делеція Klotho в експериментальних моделях спричиняє старіння, затримку росту та кальцифікацію [38]. Передача сигналів FGF23-Klotho пригнічує ниркову реабсорбцію фосфату. При ХХН експресія Klotho знижується в ниркових канальцях [39]. Крім того, дієта, багата фосфатами, посилила дефіцит aKlotho в моделі ішемічно-реперфузійного гострого ураження нирок і ще більше сприяла збільшеннюниркафіброз тканин, що прискорює прогресування ХХН [18]. Вплив фосфатної дієти на ниркову експресію Klotho вже було продемонстровано на моделях мишей [40]. Можливо, серед інших шляхів перевантаження фосфатами погіршує функцію нирок шляхом модуляції експресії Klotho на канальцевих клітинах; це має бути додатково досліджено в майбутніх дослідженнях.
Апоптоз і фіброз опосередковуються цитокінами, такими як TGF- [41, 42]. Ми описали зв’язок вторинного гіперпаратиреозу та, як наслідок, більшої експресії TGF з процесом ремоделювання серця [43]. Припускають, що існує зв’язок між активацією ПТГ і передачею сигналу TGF, який стимулює проліферацію фібробластів, синтез колагену та фіброз. Існують навіть експериментальні докази інтегрованої дії TGF- і PTH рецепторів на кісткові клітини, регулюючи передачу сигналів кісткового ремоделювання [44]. Роль сигналізації TGF-/Smad униркахвороба вже описана. TGF- зв'язується з трансмембранним рецептором, запускає фосфорилювання білків Smads і сприяє їх транслокації до ядра для транскрипційних ефектів. Таким чином, вони важливі для передачі сигналу членів сімейства TGF. Дійсно, надекспресія білків Smad2 і Smad3 у фіброзній нирці на моделях тварин із ХХН вже була продемонстрована [45]. Цікаво, що є докази активації Smads іншими медіаторами, незалежними від TGF-, такими як кінцеві продукти глікації [46] та ангіотензин II [47]. Оскільки в експериментальній моделі заміна ПТГ не вплинула на вплив гіперфосфатемії на прогресування ХХН [11], нам цікаво, чи буде фосфат мати безпосередню роль у передачі сигналів Smad нирок. У нашій моделі не було виявлено впливу гіперфосфатемії на експресію p-Smad у клітинах ниркових канальців.
Однак це не виключає можливість активації TGF-шляху незалежно від фосфорилювання Smads. Для дослідження цього альтернативного шляху необхідні подальші дослідження.
При оцінці кісткової тканини перевантаження фосфатами викликало апоптоз остеобластоподібних клітин [22]. Рохас та ін. продемонстрували в біопсії кісток пацієнтів з трансплантацією, що кількість апоптотичних клітин була вищою в пацієнтів з низьким вмістом фосфату, а ПТГ мав би вплив на збільшення остеобластів і запобігання апоптозу [48]. Цей інгібуючий ефект ПТГ на апоптоз кісткових клітин був продемонстрований раніше [49]. Окрім впливу на кісткову тканину, шляхи апоптозу також пов’язані з гострою нирковою недостатністю [48] і можуть бути можливим посередником у прогресуванні ХХН. У нашій моделі ми спостерігали більшу частку клітин, які зазнали апоптозу в групі LoP, без статистичної значущості. Ці міркування свідчать про порушення механізму апоптозу, викликаного гіперфосфатемією. Однак ми повинні мати на увазі, що неможливо було оцінити виключний вплив фосфату наниркатканинний апоптоз після того, як у тварин також розвинулося підвищення ПТГ і FGF-23.
У поточному дослідженні ми розглянули інший можливий механізм порушення функції нирок через дієту з високим вмістом фосфатів, дисфункцію аутофагії, шляхом вимірювання білка беклін-1, регуляторного білка, необхідного для зародження аутофагосомної мембрани [50]. Аутофагія - це катаболічний шлях, який включає деградацію клітинних компонентів через лізосоми [51,52]. Фосфорилювання беклін-1 розглядається як специфічний для аутофагії сигнал для активації комплексу фосфатидилінозитол-3-фосфаткінази та залучення до мембранних сайтів біогенезу аутофагосом [53]. Нокдаун беклін-1 пригнічує аутофагію [54], а ішемія-реперфузія підвищує його рівні [55]. Зменшення беклін- 1 і супутня регуляція mTOR зменшують ріст злоякісних клітин, підкреслюючи ефект аутофагії на виживання [52].
Антифіброзний ефект Klotho також був пов’язаний із посиленим процесом аутофагії, шляхом, через який ішемічне пошкодження послаблювалося в моделі AKI і порушувалося високими рівнями фосфатів [18]. Експериментальні дослідження показали, що аутофагічний потік пом'якшує інфільтрацію макрофагів і індукований фосфатами фіброз нирок. Крім того, середовище, багате фосфатами, індукує мітофагію в трубчастих клітинах in vitro [56]. Наші дані показали, що вміст фосфатів у раціоні також модулював експресію беклін-1 у ниркових канальцях in vivo. Дієта HiP також була пов’язана з більшою клітинною проліферацією та тенденцією до нижчої швидкості апоптозу, як показано аналізом PCNA та TUNEL відповідно. Однак у нашій моделі не вдалося визначити, чи сталося це як прямий вплив перевантаження фосфатами чи через аномалії рівнів ПТГ і FGF-23, спричинені гіперфосфатемією. Цей висновок необхідно підтвердити клінічним сценарієм.
Ключовою перевагою цього дослідження була оцінка впливу обмеження фосфатів у дієті з низьким вмістом білка на прогресування ХХН, яка включала дослідження його впливу на гістологічні картини та молекулярні фенотипиниркатканина. Наскільки нам відомо, це перше дослідження, яке демонструє модуляцію експресії беклін-1, маркера аутофагії на клітинах ниркових канальців, за допомогою фосфатної дієти in vivo. Основним обмеженням була неможливість відокремити ефект гіперфосфатемії від інших аномалій, пов’язаних із ХХН-МБД, таких як підвищення рівня ПТГ і ФФР-23. Ми також не змогли оцінити дієту з проміжним вмістом фосфатів або експресією Klotho в нирках. Однак наша модель відтворює реальний стан, коли дієта HiP зазвичай пов’язана з гіперпаратиреозом і високим рівнем FGF-23.
4. Висновки
Підсумовуючи, це дослідження надало докази того, що фосфатна дієта відіграє певну роль у прогресуванні ХХН, можливо посилюючи інтерстиціальний фіброз. Крім того, дієта, багата фосфатами, може змінитиниркапроцес аутофагії. Виявлення білково-незалежного шляху, через який фосфати погіршують функцію нирок, може відкрити важливий шлях для розробки нових підходів, спрямованих на запобігання або зменшення прогресування ХХН у клінічних умовах.
5. Матеріали та методи
До цього дослідження були включені дорослі самці щурів Munich-Wistar, отримані з місцевого закладу. Щурів утримували при температурі 23 ± 1 ◦C, вологості повітря 60 ± 5 відсотків, протягом 12:{6}}-годинного циклу світло-темрява. Усі тварини мали вільний доступ до водопровідної води та харчувалися дієтою з низьким вмістом білка (12 відсотків білка). Тварин забивали через два місяці, коли аналізували кров, сечу та ниркову тканину. У всіх щурів визначали тиск у манжеті хвоста, кліренс креатиніну та добову екскрецію альбуміну з сечею. Схема експерименту показана в Додатку А (Рисунок А1).
5.1. Аналітичні методи
Через шістдесят днів після Nx тварин анестезували тіопенталом натрію (50 мг/кг маси тіла) і відбирали зразки крові. Концентрацію креатиніну в сироватці крові визначали колориметричним методом. Сироватковий альбумін, фосфат, сечовина, кальцій і гематокрит вимірювали стандартними методами. ПТГ вимірювали методом ELISA (Immutopics, Сан-Клементе, Каліфорнія, США). FGF-23 вимірювали за допомогою набору ELISA (KAINOS, Японія) згідно з протоколом виробника. Ми розраховували клубочкову фільтрацію за кліренсом креатиніну на основі рівнів креатиніну в сироватці крові та сечі та виражали в мл/хв, розраховуючи за формулою: креатинін сечі (мг/дл) × креатинін сечі (мл/хв)/креатинін сироватки (мг/дл). Альбумін сечі визначали методом радіальної імунодифузії.
-третини зліванирказакриттям двох-трьох гілок лівої ниркової артерії. Фальшивооперованим щурам проводили анестезію та маніпуляції з нирковими ніжками без зменшення маси нирок. Після виходу з анестезії тварин повертали у вихідні клітини, які прогрівали протягом наступних 24 годин.
Фракційну екскрецію фосфату (FEP) отримували за допомогою сечі та фосфату сироватки (мг/дл), сечі та креатиніну сироватки (мг/дл) і виражали у відсотках за такою формулою: (сеча/фосфат сироватки)/(сеча/сироватка креатинін) × 100.
5.2. Експериментальні групи
Тварин розділили на дві групи відповідно до вмісту фосфатів у раціоні, як зазначено нижче: дієта з низьким вмістом фосфатів (LoP): n=20; тварини отримували TD-90016, 12-відсоткову білкову дієту, модифіковану для 0.2-відсоткової концентрації фосфату. Дієта з високим вмістом фосфатів (HiP): n=19; тварини отримували TD-90016, 12-відсоткову білкову дієту, модифіковану для 0.95-відсоткової концентрації фосфату.
5.3. Гістологічні методики
Залишокниркаперфузували in situ при спостережуваному MAP фізіологічним розчином, а потім розчином Duboscq-Brasil для фіксації. Після зважування два середні ниркові зрізи постфіксували в забуференому 4-відсотковому формальдегіді. Потім ниркову тканину заливали в парафін і готували для гістоморфометрії та імуногістохімії, як описано раніше [57].
Усі морфометричні оцінки проводилися на зрізах товщиною 4- мкм одним спостерігачем, який не бачив груп. Для кожного щура оцінювали тяжкість гломерулосклерозу (GS) у зрізах, пофарбованих періодичною кислотою Шиффа (PAS), шляхом присвоєння кожному клубочку (щонайменше 120 на щура досліджували) бал для оцінки склерозованої фракції області пучка. , і отримання індексу GS (GSI) для кожного щура, як описано раніше [58]. Щоб оцінити ступінь інтерстиціального розширення, відсоток ниркової кортикальної зони, зайнятої інтерстиціальним фіброзом (відсоток IF), оцінювали в забарвлених за Массоном зрізах методом підрахунку точок [59].
5.4. Імуногістохімія
Залиті парафіном ниркові зрізи товщиною чотири мкм були встановлені на предметне скло, покрите 6-відсотковим силаном. Зрізи депарафінізували, повторно гідратували, а потім нагрівали в цитратному буфері для посилення вилучення антигену. Їх попередньо інкубували з 5-відсотковою нормальною кролячою (для ED-1) або конячою (для -актину) сироваткою в трис-буферному фізіологічному розчині (TBS) або розчині білкового блоку на основі казеїну (Protein Block; DAKO Corporation, Санта-Клара, CA, США (для PCNA, pSmad і Beclin)), щоб запобігти неспецифічному зв’язуванню. Інкубацію з первинним антитілом проводили протягом ночі при 4 ◦C. Негативні контролі проводили без первинного антитіла.
Були використані наступні первинні антитіла: моноклональне антитіло миші проти ED-1 миші (Serotec, Оксфорд, Великобританія) для виявлення макрофагів; мишачий моноклональний анти-альфа гладкий (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA), для виявлення -актину; поліклональне антитіло до Beclin 1 (Boster, Pleasanton, CA, США), для аналізу аутофагії. Після промивання зрізи інкубували з біотинільованим антимишачим IgG (H плюс L) (Vector, Берлінгейм, Каліфорнія, США) протягом 45 хвилин, а потім із набором VECTASTAIN® ABC-AP, Vector® Red (Vector, Берлінгейм, Каліфорнія). , США) протягом 30 хв. Потім зрізи проявляли розчином швидкого червоного барвника.
Для моноклонального мишачого антипроліферуючого клітинного ядерного антигену (Dako, Данія) і фосфорного smad2 (Ser465/467) антитіла (Cell Signaling, Денверс, Массачусетс, США) інгібування ендогенної пероксидази проводили 3% розчином перекису водню та метанолом протягом 30 хв. Потім зрізи інкубували протягом ночі з первинним антитілом у зволоженій камері при 4 ◦C. Наступного дня зрізи інкубували з біотинільованим антимишачим IgG (H плюс L) або біотинільованим антищурячим IgG (H плюс L) (Vector, Берлінгейм, Каліфорнія, США) протягом 45 хвилин, після чого інкубували з VECTASTAIN® ABC- Комплект HRP (Вектор, Берлінгейм, Каліфорнія, США) протягом 30 хв. Потім зрізи були розроблені з використанням 3-аміно-9-етилкарбазолового субстратного хромогену (AEC) (Sigma Chemical, Сент-Луїс, Міссурі, США). Усі зрізи промивали дистильованою водою, контрафарбували розчином гемалу Майєра (Merck, Дармштадт, Німеччина), покритим гліцерин-желатином Кайзера (Merck, Дармштадт, Німеччина).
Для оцінки інтерстиціальної ниркової щільності ED-1, p-Smad, Beclin і PCNA кількість позитивних клітин/мм2 оцінювали сліпим способом при 400-кратному збільшенні. Для оцінки -актину ми використали техніку підрахунку точок за допомогою мікроскопа з 100-точковим окуляром, підключеним до відеомонітора. Ми проаналізували 25 полів під 3200-кратним збільшенням. Результати виражали у відсотках з урахуванням загальної площі.
5.5. Апоптоз
Апоптоз визначали в клітинах ниркових канальців методом TUNEL (TdT-опосередковане X-dUTP Nick end marking) з використанням інструкцій, наданих Apoptag plusPeroxidase in Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore Sigma, MA, USA). Апоптозні клітини аналізували в 25 полях зі збільшенням 1000×, щоб отримати кінцеве значення, виражене в клітинах/мм2.
5.6. Статистичний аналіз
Відмінності між групами LoP і HiP перевіряли за допомогою незалежного тесту Стьюдента або тесту Манна-Уітні відповідно. Зв’язки між змінними перевіряли за допомогою коефіцієнта кореляції Спірмена. Дані представлені як середнє ± SE, якщо не вказано інше. P-значення<0.05 was="" considered="" significant.="" analyses="" were="" performed="" using="" ibm="" spss="" statistics,="" version="" 20.0.1="" (ibm="" corp.,="" armonk,="" ny,="" usa)="" and="" graphpad="" prism9.1.2="" statistical="" software="" (graphpad,="" san="" diego,="" ca,="">
Фінансування:Це дослідження було підтримано Дослідницьким фондом Сан-Паулу (FAPESP—грант №. 2010/05409-6). Moyses, Jorgetti, Zatz та Elias користуються підтримкою CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Sientifico e Tecnol6gico), але ця фінансова підтримка не мала жодної ролі в написанні цієї статті.
Заява інституційної ревізійної ради:Це дослідження було проведено відповідно до рекомендацій місцевої комісії з питань етики. Протокол був схвалений Comite detica em Pesquisa do Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina da USP (CEUA, процес № 090/10 і дата затвердження 10 серпня 2010 р.). Усі експериментальні процедури суворо відповідали міжнародним стандартам маніпуляцій та догляду за лабораторними тваринами.
Заява про доступність даних:Дані, представлені в цьому дослідженні, доступні за запитом у відповідного автора.
Подяки:Автори дякують Вагнеру Домінгезу за його експертну технічну допомогу. Конфлікт інтересів: автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.
Список літератури
1. Хілл, Н.Р.; Фатоба, ST; Оке, JL; Херст, JA; О'Каллаган, Каліфорнія; Ласерсон, Д.С.; Гоббс, Ф. Д. Глобальна поширеність хронічногонирказахворювання — систематичний огляд і мета-аналіз. PLoS ONE 2016, 11, e0158765.
2. Вен, CP; Чанг, CH; Цай, М.К.; Лі, Дж. Х.; Лу, Пі Джей; Цай, С.П.; Wen, C.; Чен, CH; Као, CW; Цао, CK; та ін. Діабет з ранньоюниркаучасть може скоротити очікувану тривалість життя на 16 років. Kidney Int. 2017, 92, 388–396.
3. Какінума, Ю.; Кавамура, Т.; Біллс, Т.; Йошіока, Т.; Ічікава, І.; Fogo, A. Незалежний від артеріального тиску ефект інгібування ангіотензину на судинні ураження хронічної ниркової недостатності.ниркаМіжн. 1992, 42, 46–55.
4. Фрід, Л.Ф.; Орчард, TJ; Kasiske, BL Вплив зниження ліпідів на прогресування захворювання нирок: мета-аналіз.ниркаМіжн. 2001, 59, 260–269.
5. Ісідоя, С.; Моріссі, Дж.; МакКракен, Р.; Рейес, А.; Klahr, S. Антагоніст рецепторів ангіотензину II полегшує тубулоінтерстиціальний фіброз нирок, викликаний односторонньою обструкцією сечоводу.ниркаМіжн. 1995, 47, 1285–1294.
6. Audigier, JC; Канджанбух, Т.; Ма, LJ; Браун, Нью-Джерсі; Fogo, AB Регресія наявного гломерулосклерозу шляхом інгібування альдостерону. J. Am. Соц. Нефрол. 2005, 16, 3306–3314.
7. Нат, К.А.; Крень С.М.; Hostetter, TH Дієтичне обмеження білка при встановленому ураженні нирок у щурів. Вибіркова роль клубочкового капілярного тиску в прогресуючій клубочковій дисфункції. Дж. Клін. Розслідувати. 1986, 78, 1199–1205.
8. Бреннер, Б.М.; Мейєр, TW; Хостеттер, Т. Х. Дієтичне споживання білка та прогресуючий характерниркахвороба: роль гемодинамічно опосередкованого гломерулярного пошкодження в патогенезі прогресуючого гломерулярного склерозу при старінні, абляції нирки та внутрішньому захворюванні нирок. Н. англ. J. Med. 1982, 307, 652–659.
9. Bellizzi, V. Низькобілкова дієта або харчова терапія при хронічномунирказахворювання? Очищення крові. 2013, 36, 41–46.
10. Кусано, К.; Segawa, H.; Оніші, Р.; Фукусіма, Н.; Міямото, К. Роль дієти з низьким вмістом білка та фосфору в прогресуванні хронічної хворобинирказахворювання у уремічних щурів. J. Nutr. наук. Вітам. 2008, 54, 237–243.
11. Невес, КР; Граціоллі, Ф.Г.; душ Рейс, Л.М.; Паскуалуччі, Каліфорнія; Мойсес, Р.М.; Jorgetti, V. Побічні ефекти гіперфосфатемії на гіпертрофію міокарда, функцію нирок і кістку у щурів з нирковою недостатністю.ниркаМіжн. 2004, 66, 2237–2244. [CrossRef] [PubMed]
12. Фінч, JL; Лі, DH; Ляпіс, Х.; Ріттер, К.; Чжан, С.; Суарес, Е.; Фердер, Л.; Slatopolsky, E. Обмеження фосфатів значно знижує смертність у уремічних щурів із встановленою кальцифікацією судин. Kidney Int. 2013, 84, 1145–1153.
13. Купісті, А.; Бласко, П.; Д'Алессандро, К.; Джаннезе, Д.; Сабатіно, А.; Fiaccadori, E. Захист залишкової ниркової функції та лікування харчування: Стратегія першого кроку для зниження уремічних токсинів у пацієнтів із термінальною стадією захворювання нирок. Токсини 2021, 13, 289.
14. Ян, Б.; Су, X.; Сюй, Б.; Цяо, X.; Wang, L. Вплив дієтичного обмеження білка на прогресування хронічногонирказахворювання: систематичний огляд і мета-аналіз. PLoS ONE 2018, 13, e0206134. [CrossRef] [PubMed]
15. Клар, С.; Леві, А.С.; Бек, Дж. Дж.; Caggiula, AW; Хансікер, Л.; Кусек, JW; Страйкер, Г. Вплив обмеження дієтичного білка та контролю артеріального тиску на прогресування хронічного захворювання нирок. Модифікація дієти в групі дослідження захворювань нирок. Н. англ.
J. Med. 1994, 330, 877–884. [CrossRef]
16. Ху, MC; Ши, М.; Чо, HJ; Адамс-Х'ют, Б.; Паек, Дж.; Хілл, К.; Шелтон, Дж.; Амарал, А.П.; Faul, C.; Танігучі, М.; та ін. Клото та фосфат є модуляторами патологічного уремічного ремоделювання серця. J. Am. Соц. Нефрол. 2015, 26, 1290–1302.
17. Ху, MC; Ши, М.; Чо, HJ; Чжан, Дж.; Павленко А.; Лю, С.; Сідху, С.; Хуанг, Л.Ж.; Moe, OW Рецептор еритропоетину є нижчим ефектором індукованої Klotho цитопротекції. Kidney Int. 2013, 84, 468–481.
18. Ши, М.; Флорес, Б.; Гіллінгс, Н.; Біан, А.; Чо, HJ; Ян, С.; Лю, Ю.; Левін, Б.; Мо, О. В.; Hu, MC alphaKlotho пом'якшує прогресування ГПН до ХХН через активацію аутофагії. J. Am. Соц. Нефрол. 2016, 27, 2331–2345.
19. Дінь, Ю.; Кім, С.; Лі, С.Й.; Ку, Дж. К.; Ван, З.; Choi, ME Аутофагія регулює експресію TGF-бета та пригнічуєниркафіброз, викликаний односторонньою обструкцією сечоводу. J. Am. Соц. Нефрол. 2014, 25, 2835–2846.
20. Мустакас, А.; Соучельницький С.; Heldin, CH Регуляція Smad у трансдукції сигналу TGF-бета. J. Cell Sci. 2001, 114, 4359–4369.