Захисна дія кверцетину на ендотеліальні клітини, пошкоджені гіпоксією та реоксигенацією

За додатковою інформацією звертайтесьtina.xiang@wecistanche.com

Фон: Хвороба дрібних судин головного мозку (ХМЗ) — це група клінічних синдромів, що охоплюють усі патологічні процеси дрібних судин головного мозку, які можуть спричинити інсульт та серйозну деменцію. Однак, оскільки патогенез CSVD неясний, лікування обмежене. Дисфункція ендотеліальних клітин виникає раніше, ніж клінічні симптоми, такі як гіпертензія та лейкоз. Тому очікується, що лікування ендотеліальних клітин стане новим проривом.кверцетин, флавоноїд, присутній у різноманітних рослинах, має протизапальну та антиоксидантну функцію. Це дослідження мало на меті вивчити захисну дію кверцетину на пошкодження ендотеліальних клітин і створити базову теорію для подальшого застосування в клініці.

Методи: мікросудинні ендотеліальні клітини головного мозку людини (HBMEC) культивували in vitro, а модель пошкодження ендотеліальних клітин створювали за допомогою гіпоксії та реоксигенації (H/R). Захисну дію кверцетину на HBMEC вивчали з точки зору життєздатності клітин, міграції клітин, ангіогенезу та апоптозу. Для подальшого вивчення механізму кверцетину,окислювальний стресі стрес ендоплазматичного ретикулуму аналізували. Більше того, також досліджували цілісність гематоенцефалічного бар’єру (ГЕБ).

Результати: кверцетинможе сприяти життєздатності, міграції та ангіогенезу HBMEC, а також пригнічувати апоптоз. Крім того, кверцетин також може активувати сигнальний шлях Keap1/Nrf2, зменшити експресію білка ATF6/GRP78. Подальші дослідження показали, що кверцетин може посилити експресію Claudin-5 і Zonula occludens-1.

Висновки: Наші експерименти показують, що кверцетин може захищати HBMEC від H/R, який містить сприяння клітинній проліферації, клітинній міграції та ангіогенезу, зменшуючи потенційне пошкодження мітохондріальної мембрани та пригнічуючи клітинний апоптоз. Це може бути пов’язано з його антиоксидантною дією та інгібуванням стресу ендоплазматичного ретикулуму. У той же час кверцетин може підвищувати рівень коннексину BBB, що свідчить про те, що кверцетин може підтримувати цілісність BBB.

Ключові слова: захворювання дрібних судин головного мозку, ендотеліальні клітини, кверцетин, окислювальний стрес, стрес ендоплазматичного ретикулуму, гематоенцефалічний бар'єр

ВСТУП

Захворювання дрібних судин головного мозку(CSVD) — це загальний термін, який охоплює всі патологічні процеси, пов’язані з дрібними судинами головного мозку, і відноситься до групи клінічних, візуалізаційних і патологічних синдромів різної етіології, що включають внутрішньочерепні артеріоли до венул (діаметр<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

кверцетинє флавоноїдом, присутнім у кількох рослинах, таких як Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc має сильну антиоксидантну та протизапальну дію та може надавати захисну дію при різних патологічних станах, включаючи серцево-судинні захворювання, метаболічні розлади, нейродегенеративні захворювання, діабет, рак та ожиріння (Dok-Go та ін., 2003; Comalada та ін., 2005; Чо та ін., 2006). Попередня обробка кверцетином значно підвищила рівень експресії ендогенних антиоксидантних ферментів у пірамідальних нейронах CA1 гіпокампа тварин, які постраждали від ішемії, демонструючи сильний антиоксидантний і нейропротекторний ефект (Chen et al, 2017). Нещодавні дослідження також виявили, що кверцетин має нейропротекторну дію проти ішемічного пошкодження, зберігаючи цілісність ГЕБ (Jin et al, 2019). Однак його вплив на мікросудинні ендотеліальні клітини головного мозку (BMEC) при гіпоксії та реоксигенації (H/R) погано вивчений, і не повідомлялося про цільовий білок кверцетину, що захищає BMEC.

У нашому дослідженні ми досліджували захисну дію кверцетину на мікросудинні ендотеліальні клітини головного мозку людини (HBMEC), пошкоджені H/R у культурі. У той же час ми додатково вивчили можливий механізм його захисного ефекту, щоб забезпечити більш теоретичну основу для клінічного просування кверцетину та надати нові ідеї щодо лікування CSVD.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Середовища, реагенти та антитіла

кверцетин(purity>98 відсотків) було придбано у Best Biological Technology Co, Ltd. (Ченду, Китай). HBMEC були придбані у Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Шанхай, Китай). Ембріональна сироватка великої рогатої худоби (FBS) була отримана від Biological Industries (Кібуц Бейт Хаемек, Ізраїль). Пеніцилін/стрептоміцин і модифіковане середовище Ігла за Дульбекко (DMEM) були придбані у Hyclone (GA, США). Набір для тестування мітохондріального мембранного потенціалу (JC-1), набір для тестування білка BCA, 2,7-дихлорид-гідрофлуоресцеїн діацетат (DCFH-DA) і лізат NP40 були придбані в Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). Препарат фосфатази та повний інгібітор протеази були придбані у Roche (Шанхай, Китай). Набір для апоптозу було придбано в BD Biosciences (Спаркс, штат Меріленд, США). Малоновий діальдегід (MDA), супероксиддисмутаза (SOD), молекула міжклітинної адгезії-1 (ICAM-1), молекула адгезії судинних клітин-1 (VCAM{{10}} )імуноферментний аналіз (ELISA) був (Кембридж, Abcam придбала компанію dfrom1"一Великобританія). Антитіла проти ядерного фактора E2-пов’язаного фактора 2 (Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Фактор активації транскрипції 6 (ATF6), регульований глюкозою білок 78 (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH було придбано в Cell Signaling Technology (Денверс, США). Анти-кролячі IgG, кон’юговані пероксидазою хрону (HRP), були отримані від компанії Jackson (Пенсильванія, Сполучені Штати). Набір для швидкого дозування SDS-PAGE та хромогенний розчин ECL були придбані в EpiZyme Biotechnology (Шанхай, Китай). Модель клітинної культури та травми HBMECs культивували в DMEM, що містить 10% FBS і 1% пеніцилін-стрептоміцину, в інкубаторі 37 з 5% CO2. пошкодження клітин, HBMEC обробляли 12-годинною гіпоксією з наступною 8-годинною реоксигенацією, і конкретні процедури були такими (Warpsinski та ін., 2020): HBMEC спочатку інкубували з безсироватковим середовищем в інкубаторі для гіпоксії (1 відсоток). 0,5 відсотка CO, 94 відсотка N) протягом 12 годин, а потім середовище було змінено на звичайне середовище, що містить 10 відсотків FBS, у той час як їх інкубували в нормоксиальному інкубаторі (95 відсотків O 2,5 відсотка CO2) протягом 8 годин. Обробка кверцетином 2 мг кверцетину розчиняли в 331 мкл ДМСО для утворення основного розчину з концентрацією 1 ммоль/л і зберігали при -20 градусах. Робочий розчин розбавляли до 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 мкмоль/л за допомогою DMEM, у якому відсоток DMSO був нижче 0,1 відсотка. Коли клітини прилипли, додали кверцетин з безсироватковим середовищем, а потім планшети помістили в інкубатор гіпоксії. Через 12 годин клітини видаляли, замінювали кверцетином із сироватковим середовищем і поміщали в інкубатор нормоксиї на 8 годин.

Аналіз життєздатності клітин

Наслідкикверцетинна життєздатність HBMEC перевіряли за допомогою набору для підрахунку клітин-8 відповідно до посібника оператора. Спочатку оцінювали безпечні дози кверцетину для клітин за відсутності пошкодження ендотеліальних клітин, а потім перевіряли його захисні ефекти в умовах пошкодження клітин. Усі експериментальні результати повторювали принаймні тричі.

Аналіз загоєння подряпин і утворення трубок Експерименти з міграцією проводили з використанням методу подряпин клітин. Перед обробкою кверцетином у нижній частині планшета з культурою було проведено пряму перпендикулярну лінію та сфотографовано для запису протягом 0 год, а потім клітини піддано обробці кверцетином і моделюванню перед фотографуванням для запису. Передню і задню зони контрастували двічі.

Утворення трубки, що імітує ангіогенну здатність клітин, матригель (9-12 мг/мл) поміщали на дно культуральної пластини, потім кверцетин і клітини, оброблені моделюванням, поміщали зверху, через 8 годин робили знімки. Генерацію розгалужень кровоносних судин аналізували та порівнювали за допомогою ImageJ.

Потенціал мітохондріальної мембрани та аналіз апоптозу

Набір для зміни потенціалу мітохондріальної мембрани та апоптозу використовувався для виявлення апоптозу клітин. Зміну потенціалу мітохондріальної мембрани було виявлено шляхом фарбування HBMEC флуоресцентним зондом JC-1. Робочий розчин для фарбування JC-1(1×) додавали та інкубували в інкубаторі при 37 градусах протягом 20 хвилин, а потім двічі промивали буфером для фарбування JC-1(1×) і, нарешті, додавали до кожної лунки для PBS . Потім для аналізу використовувався пристрій для зображення клітин високого вмісту.

HBMEC збирали з 6-лункових планшетів, центрифугували для видалення супернатанту, потім додавали 1 × розчин зв’язування Анексину V для продування та перемішування клітин, потім додавали барвник FITC Анексину V для інкубації в темряві при кімнатній температурі протягом 10 хв, додайте фарбувальний розчин пропідію йодиду (PI) за 5 хв до машини, і для виявлення використовували проточний цитометр Бекмана.

ІФА

Після обробки клітин H/R або кверцетином супернатант збирали. ICAM-1, VCAM-1, SOD і MDA були виявлені за допомогою комплектів ELSA відповідно до посібника оператора.

Аналіз активних форм кисню (АФК) Здатність генерувати АФК було виявлено за допомогою зонда DCFH-DA, який було оцінено за допомогою пристрою для зображення високого вмісту клітин і проаналізовано за допомогою флуоресценції за допомогою ImageJ. Вестерн-блоттинг

HBMEC збирали з культуральних чашок, лізат NP40 з додаванням препарату фосфатази та повний інгібітор протеази використовували для екстракції білків із клітин. Було визначено вміст білка та взято 30 мкг білка для експериментів імуноблотингу. Для електрофорезу використовували гель SDS-PAGE, блокований 5% знежиреним сухим молоком після електроперенесення на мембрану PVDF протягом 1 години при кімнатній температурі. Потім анти-Nrf2(кролик, 1:1,000), анти-Keapl(кролик,1:1,000), анти-ATF6(кролик,1:1,000 ), анти-GRP78(кролик,1:1,000), анти-ZO-1(кролик,1:1,000), анти-Claudin-5( rabbit,1:1,000) антитіла інкубували протягом ночі при 4C. Після промивання наступного дня додавали розведені вторинні антитіла кози проти кролика (IgG HRP, 1:10, 000) та інкубували протягом 1 години. Нарешті, виявлення було виявлено після тричі промивання в TBST.

Протеомний аналіз

HBMEC обробляли H/R у присутності кверцетину (l мкмоль/л). Згодом клітини обережно зіскрібали з планшета для культивування за допомогою клітинного скребка, збирали в кріопробірки, швидко поміщали в рідкий азот і потім зберігали при -80 градусах протягом 5 хв. Для проведення протеомного аналізу використовували технологію iTRAQ, білки з р-значенням<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 або<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Статистичний аналіз

Дані відповідали нормальному розподілу, і для вираження даних використовували середнє ± стандартне відхилення. Для статистичного аналізу використовувався GraphPad Prism 8. Два незалежних зразки аналізували за допомогою t-критерію, а дані вимірювань описували середнім значенням ± стандартне відхилення (SD). Порівняння між групами проводили одностороннім дисперсійним аналізом (ANOVA). p-значення<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

РЕЗУЛЬТАТИ

Результати

Вплив кверцетину на життєздатність клітин

Щоб перевірити вплив кверцетину на життєздатність клітин, ми спочатку перевірили безпечну дозу кверцетину на клітини, як показано на малюнку 1A, яка не мала впливу на життєздатність клітин при 0.1-10 мкмоль/л. . Далі, для пошуку ефективної дози на основі пошкодження ендотеліальних клітин, ми показали, що кверцетин у 0.1-1 мкмоль/л може сприяти життєздатності клітин у H/R-HBMEC, як показано на малюнку 1B. Подальші експерименти проводилися в цьому діапазоні концентрацій. Варто відзначити, що при досягненні концентрації препарату 10 мкмоль/л проявляється цитотоксичність. Ми думали, що коли HBMEC були пошкоджені H/R, їх толерантність знижується. Тому, коли концентрація препарату була трохи вищою, пошкодження клітин посилювалося. Таким чином, цитотоксичність виникла при концентрації препарату 10 мкмоль/л.

Вплив кверцетину на клітинну міграцію та ангіогенез

Щоб дослідити вплив кверцетину на міграційну та ангіогенну здатність ендотеліальних клітин, HBMEC піддавали обробці H/R під час введення кверцетину. Ми провели аналіз на подряпинах, щоб перевірити здатність клітин до міграції, який показав, що лікування H/R послабило здатність до міграції H/R-HBMEC порівняно з контролем, і кверцетин міг значно сприяти міграції клітин у концентрації 0 .1-1 мкмоль/л. Тубулогенез використовувався для імітації ангіогенезу in vitro, і його довжина гілки представляє ангіогенну здатність. Результати показали, що лікування H/R призвело до зниження ангіогенної здатності, але кверцетин 0.1-1 мкмоль/л міг усунути це пошкодження, як показано на малюнку 2.

Вплив кверцетину на апоптоз клітин

Щоб перевірити здатність кверцетину пригнічувати апоптоз ендотеліальних клітин, ми використовували потенціал мітохондріальної мембрани та апоптоз для оцінки. Коли клітини були пошкоджені для апоптозу, потенціал мітохондріальної мембрани був знижений, цитоплазматична червона флуоресценція була значно знижена, зелена флуоресценція збільшилася, і червоний/зелений (R/G) нарешті був прийнятий для представлення зміни потенціалу мітохондріальної мембрани, який буде знижуватися, коли потенціал мітохондріальної мембрани скомпрометований. Наші результати показали, що після обробки H/R потенціал мітохондріальної мембрани клітин зменшився, на що вказує посилена зелена флуоресценція. Зі збільшенням доз кверцетину червона флуоресценція постійно посилювалася, що вказує на те, що кверцетин може залежно від дози підвищувати потенціал мітохондріальної мембрани (рис. 3A, C). Крім того, для безпосереднього дослідження апоптозу клітин використовували проточну цитометрію. Результати показали, що HBMEC продемонстрували підвищену швидкість апоптозу після лікування H/R, тоді як кверцетин при 0.1-1 мкмоль/л продемонстрував явну здатність пригнічувати апоптоз (рис. 3B, D).

Вплив кверцетину на адгезію клітин

Після пошкодження ендотеліальних клітин виробляються деякі молекули адгезії, такі як ICAM{{0}} і VCAM-1, які адсорбують токсичні речовини в ГЕБ і пошкоджують паренхіму мозку (Hauptmann et al, 2020). ). Щоб дослідити вплив кверцетину на здатність H/R-HBMEC продукувати молекули адгезії, ICAM-1 і VCAM-1 вимірювали за допомогою ELISA. У нашому дослідженні H/R призводив до підвищення рівнів ICAM-1 і VCAM-1, але додавання кверцетину в концентрації 0.1-1 мкмоль/л зменшувало цей ефект (рис. 4).

Кверцетин може пригнічувати окислювальний стрес

Кверцетин є флавоноїдом із сильною антиоксидантною здатністю, тому ми використовували зонд DCFH-DA для виявлення АФК. Ми спостерігали

підвищене утворення АФК у HBMEC, які піддавалися H/R, яке було помітно знижено під час лікування кверцетином у концентраціях {{0}}.1-1 мкмоль/л. Тим часом ми виявили зміни рівня окисного стресу продукти SOD і MDA за допомогою ELISA, і результати показали, що кверцетин у концентрації 0.1-1 мкмоль/л здатний знизити SOD і MDA, які були підвищені H/R, таким чином вказуючи на те, що кверцетин може зменшити пошкодження HBMEC від окисного стресу (рис. 5).

Кверцетин може регулювати білки Keap1/Nrf2 і ATF6/GRP78

Для подальшого вивчення захисного механізму кверцетину на HBMEC ми проаналізували рівні експресіїокислювальний стресі пов'язані зі стресом білки ендоплазматичного ретикулуму. Відомо, що Keap1/Nrf2 регулює антиоксидантні реакції in vivo. Пошкодження, викликане окислювальним стресом, змушує ендотеліальні клітини піддаватися реакції на стрес, що призводить до підвищення рівня Keapl/Nrf2 (Warpsinski та ін., 2020). У цьому дослідженні H/R призвело до активації клітинних механізмів антиоксидантної відповіді та підвищення рівнів Keapl і Nrf2, які могли бути додатково посилені кверцетином при 0.5-1 мкмоль/л для підвищення антиоксидантної здатності HBMEC. .ATF6/GRP78 є одним із шляхів регулювання гомеостазу ендоплазматичного ретикулуму (ER). Стрес ER може посилити пошкодження ендотеліальних клітин (Nie et al, 2020). У нашому дослідженні стрес ER активувався H/R, і рівні ATF6 і GRP78 були підвищені. Кверцетин у 1 мкмоль/л зміг значно знизити рівень білка обох, пригнічувати ER стрес і захистити HBMEC від пошкодження H/R (рис. 6).

Кверцетин може підтримувати цілісність BBB

BMEC є основою структури BBB, і їхня смерть або апоптоз після пошкодження H/R впливає на цілісність і функціональність BBB (Ding et al, 2019). У цій статті функцію ендотеліальних клітин було відображено шляхом виявлення змін у експресії BBB-асоційованих білків ZO-1 і Claudin-5. Порівняно з контрольною групою експресія ZO-1 та Claudin-5 була

зменшилася травма H/R, що вказує на те, що BBB було пошкоджено, і це пошкодження може бути скасовано кверцетином у концентраціях 0.5-1 мкмоль/л, що вказує на те, що кверцетин може підтримувати функцію ендотеліальних клітин (Малюнок 7).

Протеомний аналіз

Щоб знайти білки диференціальної експресії (DEP) H/R пошкоджених HBMEC у присутності чи ні кверцетину, ITRAO використовувався для проведення аналізу протеоміки. Білки, що демонструють ап<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 або<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

ДИСКУСІЯ

CSVD, як зростаючий медичний та соціально-економічний тягар, швидко привернув увагу. Але, як не дивно, патогенез CSVD в даний час залишається неясним, що не дає чіткої схеми його лікування. Враховуючи, що пізніші стадії CSVD можуть прогресувати до таких важких наслідків, як інсульт і деменція, орієнтація на ранні ураження для лікування може ефективно затримати прогресування CSVD (Cannistraro et al, 2019). Було показано, що ранні патологічні зміни CSVD полягають у дисфункції ендотеліальних клітин, і препарати, які стабілізують їх дисфункцію, можуть покращити вразливість білої речовини головного мозку при ураженнях CSVD (Rajani et al, 2018). Враховуючи роль, яку відіграють ендотеліальні клітини в CSVD, ми вирішили дослідити захисні ефекти традиційної китайської медицини на ендотеліальні клітини за допомогою HBMEC.

Кверцетин є флавоноїдом, присутнім у різноманітних рослинах (Nawrot-Hadzik та ін., 2019). Має сильну антиоксидантну та протизапальну дію та може надавати захисну дію при різних патологічних станах. У цьому дослідженні ми продемонстрували, що кверцетин може полегшити пошкодження H/R, і кілька експериментальних даних підтверджують наш висновок, що кверцетин може сприяти життєздатності клітин, міграції клітин, ангіогенезу, збільшувати потенціал мітохондріальної мембрани та пригнічувати апоптоз.

Враховуючи, що кверцетин має сильну антиоксидантну активність, ми дослідили механізм, за допомогою якого кверцетин захищає HBMEC з точки зору антиоксиданту. Рівні АФК можуть бути значно збільшені внаслідок окисного стресу (Wu et al., 2018), а накопичення АФК може спричинити багато захворювань, включаючи серцево-судинні захворювання, ендотеліальну дисфункцію та захворювання, пов’язані зі старінням, і нейродегенеративні захворювання (Chen et al, 2015; Джакарія та ін., 2018; Сантос та ін., 2018). Крім того, окислювальний стрес виникає під час перекисного окислення ліпідів, утворюючи MDA, який руйнує окислювальний антиоксидантний баланс організму та збільшує пошкодження ендотеліальних клітин (Yang et al, 2021).

В даний час Keapl/Nrf2 вважається найважливішим шляхом самоантиоксидантного стресу, і активація цього шляху може значно покращити дисфункцію ендотеліальних клітин. Зокрема, ROS сприяють активації сигнального шляху Nrf2 (Selimoglu-Buet et al, 2017). Ми продемонстрували, що кверцетин може зменшувати генерацію ROS і MDA, одночасно збільшуючи експресію білка Keapl і Nrf2, що свідчить про те, що кверцетин може пом’якшувати пошкодження ендотеліальних клітин шляхом зниження реакції на окислювальний стрес через активацію сигнального шляху Keapl/Nrf2.

Мало того, тривалий ER-стрес активує розгорнуту білкову відповідь і змінює експресію генів антиоксидантів, що призводить до апоптозу ендотеліальних клітин (Tang et al, 2019). Крім того, окислювальний стрес також може спричинити порушення згортання білка в ER, спровокувати ER стрес і посилити пошкодження ендотеліальних клітин (Hetz, 2012). ER-стрес може бути активований цими трьома шляхами: PKR-подібна ER-кіназа (PERK), інозит, що потребує ферменту 1 (IRE1), і активація ATF-6, які захищають клітини від ER-стресу в гомеостатичних умовах (Hetz та ін. ,2020). Але під впливом зовнішніх несприятливих подразників ці три шляхи активують реакцію на стрес ER і індукують апоптоз клітин. Крім того, дослідження показали, що пригнічення відповіді на стрес ER може повернути назад індуковану H/R дисфункцію ендотеліальних клітин (Chen та ін., 2020). У нашому дослідженні кверцетин може зменшити підвищений вміст ATF6/GRP78, спричинений H/R, інгібувати відповідь на стрес ендоплазматичного ретикулуму та захист ендотеліальних клітин.

Функції ендотеліальних клітин, як основного компонента ГЕБ, включають підтримку їх цілісності. Дисфункція ГЕБ викликає витік рідин, білків та інших компонентів плазми в периваскулярні тканини, що ще більше погіршує церебральну вазодилатацію та транспорт поживних речовин (Wardlaw et al, 2019). Коли ендотеліальні клітини пошкоджені, цілісність BBB буде зруйнована, тому захист ендотеліальних клітин може додатково підтримувати цілісність BBB. Клаудін-5 сильно експресується в BMEC і бере участь у формуванні кістяка вузьких ланцюгів з’єднання для регулювання Проникність BBB (Yang et al, 2020). Ендотеліальні клітини прикріплюються до актинового цитоскелету білками каркасу, такими як ZO-1, створюючи тісні з’єднання між ендотеліальними клітинами, які підтримують герметичність BBB (Zhang et al, 2020). У нашому дослідженні вираз claudin-5 і ZO-1 використовувався для представлення цілісності BBB. Наші результати показали, що рівні білка клаудин-5 і ZO-1 були знижені в HBMECs, які зазнали пошкодження H/R, що вказує на те, що цілісність BBB була порушена, і кверцетин може зменшити це пошкодження шляхом підвищення клаудину{{ 9}} і рівні білка ZO 1.

Крім того, щоб знайти потенційні мішені кверцетину на HBMEC, i-TRAQ було помічено в клітини. Після протеомного аналізу було досліджено 20 найпоширеніших диференціально експресованих білків. Серед них INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI відносяться до ендотеліальних клітин. INSRR вважається пухлинним ендотеліальним маркером, і його надмірна експресія може сприяти ангіогенезу (Nowak-Sliwinska et al, 2019). Рекомбінантний ANXA2 може зменшити проникність ендотелію в умовах гіпоксії та факторів запалення, що вказує на те, що ANXA2 може брати участь у підтримці щільності ендотеліальних клітин (Li et al, 2019). Під час фарбування зрізів шийки матки людини була виявлена ​​сильна експресія DUSP3 в ендотеліальних клітинах, і експерименти також продемонстрували, що DUSP3 необхідний для основного росту мікросудин, індукованого фактором росту фібробластів (Amand et al. 2014). Було показано, що експресія HBAl в ендотеліальних клітинах контролює тонус і функцію судин (Sangwung et al., 2017). Вважається, що PGK1 також знижує атерогенез (Zhang et al., 2020). Більше того, VTN вважається критичним для утворення тромбу в умовах пошкодження судин (Bowley et al, 2017). GPI збагачений мікросудинними ендотеліальними клітинами синовіальної тканини пацієнтів з ревматоїдним артритом у гіпоксичному середовищі та регулює секрецію фактора росту судинного ендотелію з синовіальних фібробластів ревматоїдного артриту для індукції ангіогенезу (Lu et al, 2017). Крім того, дослідження диференціально Експресовані білки, пов’язані з безпліддям, опосередкованим варикоцеле, показали, що Nrf2 був верхнім регулятором ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021). Інгібування PGK1 може активувати шлях Keapl/Nrf2 і стимулювати клітинну захисну антиоксидантну відповідь (Bollong et al, 2018). Ці два білки можуть бути потенційними мішенями кверцетину через шлях Keapl/Nrf2. Подальші дослідження можуть підтвердити роль цих білків у впливі кверцетину на H/R-HBMEC.

Слід визнати, що кверцетин може надавати захисну дію на ендотеліальні клітини. Але конкретні цілі дії все ще потребують подальшого дослідження, і чи існують додаткові шляхи дії, залишається невідомим.

На завершення це дослідження показало, що кверцетин підтримує цілісність гематоенцефалічного бар’єру, захищаючи ендотеліальні клітини. На молекулярному рівні кверцетин може відігравати певну роль у захисті ендотеліальних клітин, захищаючи від окислювального стресу через шлях Keapl/Nrf2 і пригнічуючи стрес ендоплазматичного ретикулуму через шлях ATF6/GRP78. Це дослідження закладає основу для ТКМ для лікування CSVD шляхом захисту ендотеліальних клітин.