Протеаза Calpain2a обмежує вроджений імунітет, націлюючись на TRAF6 у кісткових риб
Dec 19, 2023
Фактор 6, пов’язаний з рецептором TNF (TRAF6), відіграє ключову роль у передачі сигналу як у антибактеріальних, так і противірусних сигнальних шляхах. Однак про регуляторні механізми TRAF6 у нижчих хребетних повідомляється менше. У цьому дослідженні ми ідентифікуємо кальпаїн2а як члена сімейства кальцій-залежних протеаз з унікальною гідролітичною ферментативною активністю та функціонує як ключовий регулятор антибактеріального та противірусного імунітету у кісткових риб. Після стимуляції ліпополісахаридом (LPS) нокдаун кальпаїну2a сприяє активації запальних цитокінів. Механічно кальпаїн2a взаємодіє з TRAF6 і знижує рівень білка TRAF6 шляхом гідролізу. Після втрати ферментативної активності мутантний кальпаїн2a конкурентно пригнічує утворення димеру та автоубіквітування TRAF6. Нокдаун кальпаїну2а також сприяє клітинній противірусній відповіді. Мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, пригнічує повсюдне поширення регуляторного фактора IFN (IRF) 3/7 із TRAF6. У сукупності ці висновки класифікують кальпаїн2а як негативний регулятор вроджених імунних реакцій шляхом націлювання на TRAF6 у кісткових риб.
cistanche tubulosa - покращує імунну систему
Будучи першою лінією захисту від вторгнення патогенів, вроджений імунітет відіграє важливу роль у захисті організму від бактеріальної інвазії та вірусних інфекцій. Рецептори розпізнавання патернів (PRR) на мембрані негайно розпізнають молекулярні патерни, асоційовані з патогенами (PAMP)1–3. Трьома найбільш вивченими PRR у вродженому імунітеті є Toll-подібні рецептори (TLR), RIG-I-подібні рецептори (RLR) і NOD-подібні рецептори (NLR), які розпізнають різні PAMP і запускають сигнальні каскади для активації прозапальних цитокінів і противірусний фактор4–6. TNF receptor-associated factor (TRAF) 6 є невід’ємною частиною боротьби з бактеріальною інвазією та вірусними інфекціями. Як важливий сигнальний шлях, активований ліпополісахаридом (LPS), шлях ядерного фактора транскрипції κB (NF-κB) був детально розроблений. Більшість функцій білка в сигнальному шляху NF-κB були ретельно вивчені1,7. Фактор мієлоїдної диференціації 88 (MyD88) спочатку активується TLR у відповідь на LPS, а IRAK4 діє як посередник, активуючи IRAK1 і IRAK2, які пов’язують MyD88 з TRAF68–11. Ubc13 і Uev1A каталізують K63-пов’язане убіквітування TRAF6, яке переносить ланцюг убіквітину K63 до TAB2 і TAB3, що призводить до активації TAK112–16. TRAF6-регульований активатор IKK 2 (TRIKA2), який складається з TAK1, TAB1 і TAB2, активує інгібітор кінази IκB (IKK) / фосфорилювання17–19. Транскрипційний фактор NF-κB потрапляє в ядро і сприяє виробленню запальних цитокінів20. Коли TLR7/9 розпізнає вірус, комплекс MyD88- IRAKs-TRAF6 передає сигнали регуляторному фактору IFN (IRF) 7, сприяє повсюдному поширенню IRF7 і активує його фосфорилювання в ядрі21,22. У сигнальному шляху RLR RIG I та ген 5, пов’язаний з диференціацією меланоми (MDA5), активують мітохондріальний противірусний сигнальний білок (MAVS)23,24. Агрегація MAVS є важливою ознакою початку передачі сигналу RLR23,25,26. TRAF2/3/6 є першими факторами, активованими MAVS27,28. TRAF3 активує передачу сигналів TBK1-IRF3, а комплекс MAVS-TRAF6 активує передачу сигналів NF-κB, що сприяє експресії IFN-127,29.
Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему
Молекулярний механізм активації TRAF6 вже продемонстровано. TRAF6 у формі димера зазнає автоубіквітування під дією каталізу Ubc13 і Uev1A, який пов’язаний з доменом безіменного пальця та доменом ZF пальців. Модель TRAF6/Ubc13~UB підтверджує важливу роль димеру TRAF6 в агрегації та передачі ланцюга убіквітину K6330. Крім того, повідомлялося, що домен безіменного пальця та ZF пальця рекрутує кон’югати E2~ub у кристалічній моделі TRAF6 рибки даніо, і було виявлено, що TRAF6 може утворювати гетеродимер із TRAF5 із того самого сімейства TRAF вперше16. Білки сімейства деубіквітування: A20, CYLD, USP2a, USP4 та USP20 націлені на TRAF6, щоб усунути K63-пов’язане убіквітування та зменшити передачу сигналів у нижньому руслі31–35. Двогібридна дріжджова система відсіює взаємодію між UBE2O і TRAF6 і підтверджує, що ця взаємодія безпосередньо впливає на активацію TRAF6 MyD8836. У подальшому процесі трансдукції сигналу TRAF6 ECSIT як проміжний білок взаємодіє з TRAF6 і TAK1 відповідно, і ця взаємодія посилює зв’язування TRAF6 і TAK137. У LPS-індукованій передачі сигналів TLR4 PRDX перешкоджають TRAF6 рекрутувати ECSIT для доставки ланцюга убіквітину K63, а також інгібують BECN1, активований TRAF6 на шляху аутофагії38. MST4 активує фосфорилювання TRAF6 на Thr463 і Thr486 і пригнічує димеризацію та убіквітування TRAF639. У ссавців механізм регуляції білка TRAF6 широко вивчався в антибактеріальному та противірусному імунітеті. Однак дослідження TRAF6 у нижчих хребетних є менш вивченими. Імунна відповідь у кісткових риб в основному покладається на шляхи TLR і RLR для здійснення імунної відповіді після інфікування патогеном. Тому вкрай важливо вивчити регуляторний механізм сигнальних шляхів, опосередкованих TRAF6-. кальпаїн2 (m-кальпаїн) — це сімейство кальційзалежних протеаз, яке складається з понад 16 членів у ссавців та багатьох інших організмів40. Найбільш раннє дослідження сімейства білків кальпаїну пов’язане з рухом клітин41. кальпаїн сприяє міграції клітин і, як було встановлено, пригнічує міграцію нейтрофілів і активацію p38 MAPK і ERK MAPK42. Активність гідролази є однією з важливих функцій кальпаїну. У імунній регуляції кальпаїн-2 сприяє вивільненню NF-κB шляхом гідролізу IkB та активує сигнальний шлях43. У цьому дослідженні ми визначили, що кальпаїн2a взаємодіє з TRAF6 і діє як негативний регулятор антибактеріальних і противірусних реакцій у кісткових риб, горбаля miiuy (Miichthys miiuy). calpain2a сприяє деградації рівня білка TRAF6 через його гідролазну активність. Тим часом мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, пригнічує утворення ланцюга убіквітину K63 шляхом інгібування димеру TRAF6. Відображено, що як кальпаїн2a, так і мутантний кальпаїн2a припиняють убіквітування TRAF6 до ECSIT/BENC1/IRF3/IRF7. calpain2a зупиняє процес сигналізації NF-κB та IFN, націлюючись на TRAF6. Наші результати забезпечують молекулу для вивчення TRAF6-опосередкованої імунної регуляції у нижчих хребетних.
Результати
calpain2a взаємодіє з TRAF6 і негативно регулює передачу сигналів NF-κB.
Щоб отримати уявлення про білки, пов’язані з TRAF6-, у відповіді вродженого імунітету кісткових риб, ми охарактеризували інтерактом TRAF6 мого горбаля за допомогою афінної очистки та мас-спектрометрії. Відсортовані за інтенсивністю кількісного визначення без міток (LFQ), ми перехопили частину даних і відобразили їх (рис. 1а). Серед TRAF6-асоційованих білків кальпаїн2a, можливо, регулював активність TRAF6 і впливав на TRAF6-опосередковані сигнальні шляхи. По-перше, слід дослідити зв’язок між кальпаїном2a та TRAF6 на рівні білка, ми перевірили взаємодію кальпаїну2a з TRAF6 у клітинних лініях нирок горбаля Miiuy (MKC). Експерименти ендогенної коімунопреципітації показали, що кальпаїн2a взаємодіє з TRAF6 (рис. 1b, c). Як показали експерименти з тимчасовою трансфекцією та коімунопреципітацією, надекспресовані кальпаїн2a та TRAF6 взаємодіяли один з одним (рис. 1d, e). Усе це вказує на те, що кальпаїн2a взаємодіє з TRAF6, і необхідні подальші експерименти, щоб дослідити механізм їх дії. Завдяки множинному вирівнюванню послідовностей білків кальпаїну2а людини, миші, рибки даніо і кракаля, кальпаїн2а є еволюційно консервативним між рибами та ссавцями (рис. 1f). Щоб визначити функцію кальпаїну2а у вродженому імунітеті, ми перевірили, чи пов’язаний кальпаїн2а з активацією NF-κB, індукованою стимуляцією ЛПС. Ми трансфікували клітини епітеліоми папулезної карпової (EPC) репортером люциферази NF-κB, репортером люциферази внутрішнього контролю renilla та вектором, що кодує кальпаїн2а або порожній вектор. calpain2a суттєво знижував активність репортера NF-κB при стимуляції LPS залежно від дози (рис. 1g). Крім того, прозапальні цитокіни, такі як промотор IL-1 та IL-8, що реагують на стимуляцію ЛПС, були помітно знижені в клітинах EPC з надлишковою експресією кальпаїну2a (рис. 1h, i), що свідчить про потенційну роль кальпаїну2a у передачі сигналів запалення шляхи, індуковані стимуляцією LPS.
cistanche tubulosa - покращує імунну систему
Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity
【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Негативна регуляція LPS-індукованої передачі сигналів NF-κB кальпаїном2a.
Щоб дослідити потенційну роль кальпаїну2a в сигналізації NF-κB, ми трансфікували кальпаїн2a в MKC з часовим градієнтом LPS і оцінили прозапальні цитокіни, що реагують на LPS. Надмірна експресія кальпаїну2a призвела до зниження регуляції експресії IL-1, IL-8 та IL-6 (рис. 2a). Далі ми розробили дві специфічні для кальпаїну2а малі інтерферуючі РНК (siRNA), які ефективно знижували регуляцію кальпаїну2а (рис. 2b, d). Нокдаун кальпаїну2a значно підсилив ЛПС-індуковані прозапальні цитокіни, включаючи IL-1 та IL-8 у клітинних лініях кишечника горбаля MKC і Miiuy (MIC) (рис. 2c, e). У групі LPS-стимульованих клітин нокдаун кальпаїну2a посилив проліферацію клітин. Подібним чином, за відсутності будь-якої стимуляції, ми виявили, що нокдаун кальпаїну2a також посилює проліферацію клітин (рис. 2f). Щоб визначити, чи кальпаїн2a пригнічує білки в LPS-індукованій передачі сигналів NF-κB, кальпаїн2a помітно пригнічує рівень ендогенного білка TRAF6, але не MyD88, IRAK4 або TAK1 (рис. 2g). Таким чином, кінетика експресії кальпаїну2а та прозапальних цитокінів свідчить про функціональну участь кальпаїну2а в індукованій ЛПС передачі сигналу NF-κB.
Рис. 1 кальпаїн2a взаємодіє з TRAF6 і пригнічує сигнальний шлях NF-κB. Список інтерактомів TRAF6 на основі кількісної інтенсивності без міток (розділ). b, c Клітини MKC, висіяні в чашки 6 см2. Через 24 години клітинні лізати були імунопреципітовані (IP) за допомогою афінних гелів проти TRAF6 або анти-calpain2a. Потім імунопреципітати та клітинні лізати аналізували за допомогою IB з анти-TRAF6 та анти-calpain2a Abs відповідно. d, e Клітини HEK 293, посіяні в чашки площею 6 см2, трансфікували плазмідами calpain2a-Flag і TRAF6-Myc (2 мкг кожна). Через 24 год клітинні лізати були імунопреципітовані (IP) за допомогою афінних гелів проти Myc d або anti-Flag e. Потім імунопреципітати та клітинні лізати аналізували за допомогою IB з анти-Myc та анти-Flag Abs відповідно. f Ті самі амінокислоти серед кальпаїну 2a людини (Hu-calpain2), кальпаїну 2a миші (Mu-calpain2), кальпаїну 2a рибки даніо (ZF-calpain2a) і кальпаїну 2a горбаля (M-calpain2a) виділені чорним фоном. Клітини g–I EPC трансфікували кальпаїном2a-Flag або порожнім вектором разом із репортерами люциферази NF-κB, IL-1 та IL-8. Через 24 години після трансфекції клітини не обробляли (Mock) або обробляли LPS протягом 6 годин. Значення активності люциферази було досягнуто проти активності люциферази Renilla (n=3 на групу). Вестерн-блот аналіз був використаний для вимірювання експресії тимчасово трансфікованого calpain2a Flag. Експресію тубуліну використовували як контроль навантаження. Дані аналізували за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (g, h, i). **p < 0.01. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах.
Взаємодія кальпаїну2а з TRAF6.
Аналіз домену проводився за допомогою бази даних збережених доменів (CDD) NCBI. calpain2a містить три домени: домен цистеїнової протеази сімейства Calpain (CysPc) (aa 46-339), центральний домен III великої субодиниці Calpain (aa 360-499) і C-кінцевий домен Penta-EF ( aa 500-697). Щоб визначити, який(і) домен(и) кальпаїну2a був необхідний для його взаємодії з TRAF6, ми створили три мутанти укорочення: кальпаїн2а (1-339), кальпаїн2а (340-697) і кальпаїн (500-697) (Рис. 3а). Клітини HEK293 трансфікували calpain2a-Flag дикого типу (WT), мутантами з усіченим calpain2a-Flag або вектором TRAF6-HA. Ми виявили, що як повнорозмірний calpain2a, так і три усічені мутанти можуть взаємодіяти з TRAF6 (рис. 3c). TRAF6 складається з C-кінцевого домену TRAF, домену спіралі, домену Zinc fingers і домену Ring finger38. Щоб перевірити, який(і) домен(и) TRAF6 був необхідний для його взаємодії з кальпаїном2a, ми створили серію усічених мутантів TRAF6, включаючи TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36) }}) і TRAF6 (400-574). Тим часом ми створили доменні мутанти: TRAF6ΔRing (у якому видалено домен безіменного пальця), TRAF6ΔZF (у якому видалено домен Zinc fingers), TRAF6ΔCC (у якому видалено спіральний домен) і TRAF6ΔTRAF-C ( в якому С-кінцевий домен TRAF видалений) (рис. 3b). calpain2a взаємодіяв з TRAF6 повної довжини, а також з урізаними фрагментами TRAF6, які містили C-кінцевий домен TRAF, домен згорнутої спіралі, домен Zinc fingers (рис. 3d, f), але не з доменом безіменного пальця (рис. 3e) . Аналізи люциферази показали, що надмірна експресія кальпаїну2a та цих усічених мутантів значно пригнічує репортерну активність NF-κB та IL-1 у клітинах EPC (рис. 3h). Крім того, були досліджені субклітинні колокалізації кальпаїну2a з TRAF6. Ми трансфікували клітини EPC TRAF6-GFP і порожнім вектором або calpain2a-mCherry. Аналіз конфокальної мікроскопії продемонстрував, що зелені сигнали TRAF6 збігаються з червоними сигналами кальпаїну2a, що вказує на те, що кальпаїн2a локалізується спільно з TRAF6 у клітинах EPC (рис. 3i, j). Ці дані вказують на те, що структурна основа багатьох доменів TRAF6 (С-кінцевий домен TRAF, домен згорнутої спіралі, домен Zinc fingers), але не домен безіменного пальця, є визначальною для його асоціації з calpain2a (рис. 3g).
Рис. 2 негативний кальпаїн2а регулює сигнальний шлях NF-κB, індукований LPS. мРНК IL-1, IL-8 та IL-6 у MKC, трансдукованих за допомогою calpain2a-Flag або порожнього вектора та оброблених фізіологічним розчином (0) або заражених LPS для різних разів (2 год, 4 год, 6 год, 8 год, 10 год) (n=3 на групу). b, d Клітини MKC і клітини MIC трансфікували si-calpain2a #1 і si-calpain2a #2 (100 нМ) або si-ctrl (100 нМ). Через 48 годин після трансфекції експресію кальпаїну2a вимірювали за допомогою ПЛР qRT (n=3 на групу). Рівень білка calpain2a визначали за допомогою вестерн-блоттингу. c, e IL-1 , IL-8 мРНК у MKC і MIC, стабільно трансдукованих si-calpain2a #1 або si-ctrl (контрольний вектор) і оброблених фізіологічним розчином (0) або заражених LPS для різних разів (4 год, 8 год) (n=3 на групу). f Клітини MKC трансфікували si-ctrl або si-calpain2a #1. Через 36 годин після трансфекції клітини стимулювали LPS протягом 12 годин, потім вимірювали аналіз проліферації клітин (n=3 на групу). Масштабна шкала, 100 мкм. g calpain2a-Flag трансфікували в клітини MKC, які заражали LPS у різний час (3 години, 6 годин, 9 годин). Імуноблот аналіз клітинних лізатів із зазначеними Abs. Відносний рівень мРНК нормалізували до експресії гена, що кодує -актин, у кожному зразку. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах. Дані аналізували за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу (a, c, e, f) або одностороннього дисперсійного аналізу (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.
Рис. 3 Взаємодія calpain2a з TRAF6. a, b У цьому дослідженні використовувалися схематичні діаграми доменної організації у кальпаїну2а, TRAF6 та мутантів мого горбаля. «+» означає взаємодію з TRAF6 або calpain2a, «-» означає відсутність взаємодії. c Клітини HEK293 були трансфіковані імітацією calpain2a-Flag дикого типу (WT) і усіченими мутантами calpain2a-Flag або TRAF6-HA, як зазначено. Через 24 години після трансфекції трансфіковані клітини екстрагували, а клітинні лізати піддавали імунопреципітації за допомогою анти-HA антитіла з подальшим IB з використанням анти-HA або анти-Flag антитіла. d–f Клітини HEK293 трансфікували імітацією TRAF6-HA дикого типу (WT) і TRAF6-HA усіченими мутантами або calpain2a-Flag, як зазначено. Через 24 години після трансфекції трансфіковані клітини екстрагували, а клітинні лізати піддавали імунопреципітації за допомогою анти-HA антитіл d, f або анти-Flag антитіл e з подальшим IB з використанням анти-HA або анти-Flag антитіл. g Місце взаємодії TRAF6 і кальпаїну2a. h Клітини EPC трансфікували мутантами TRAF6-HA, calpain2a-Flag або усіченими мутантами calpain2a-Flag разом із репортерами люциферази NF-κB та IL-1. Через 36 годин після трансфекції було досягнуто значення активності люциферази порівняно з активністю люциферази renilla (n=3 на групу). Клітини I j EPC трансфікували макетом, кальпаїном2a-mCherry та TRAF6-GFP. Ядра, пофарбовані DAPI, показані синім кольором. calpain2a був виявлений за допомогою червоної флуоресценції, а TRAF6 був виявлений за допомогою зеленої флуоресценції. Масштабна шкала, 10 мкм. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах. Дані аналізували методом одностороннього дисперсійного аналізу (h). **р <0,01.
calpain2a інгібує рівень експресії білка TRAF6 шляхом протеолітичної активності.
Щоб дослідити регуляторний механізм кальпаїну2а на TRAF6, ми спочатку перевірили, чи впливає кальпаїн2а на TRAF6 на рівні білка. calpain2a-Myc і TRAF6-Flag були спільно трансфіковані в клітини EPC, рівень білка TRAF6 частково знижувався через 30 годин (рис. 4a). Як показано на рис. 4b, кальпаїн2a сприяв деградації TRAF6 залежно від дози. У присутності кальпаїну2a він не впливав на рівень мРНК TRAF6, що вказує на те, що кальпаїн2a впливає лише на рівень білка TRAF6. Тим часом аналіз інгібітора циклогексіміду (CHX) продемонстрував, що кальпаїн2a може прискорити період напіврозпаду білка TRAF6 (рис. 4c). Надмірна експресія кальпаїну2а в клітинах MKC призвела до дестабілізації ендогенного TRAF6 (рис. 4d). Щоб дослідити, чи залежала деградація TRAF6, опосередкована кальпаїном2a, від убіквітин-протеасомного, аутофагосомного, лізосомального шляхів або інших, клітини EPC обробляли реагентами, які інгібували ці шляхи: MG132, 3-MA та NH4Cl. Проте дестабілізація TRAF6, опосередкована кальпаїном2a, не була скасована протеасомальним інгібітором MG132, аутофагічним інгібітором 3-MA або лізосомальним інгібітором NH4Cl (рис. 4e). Далі клітини EPC обробляли реагентами: E-64 (інгібітор кальпаїну, який інактивує активність кальпаїнгідролази) та PMSF (неспецифічний інгібітор серинової протеази). Ми виявили, що інгібітор кальпаїну E-64 запобігає деградації на рівні білка TRAF6 (рис. 4f). Як показано на рис. 4g, E-64 також скасував деградацію ендогенних рівнів білка TRAF6 кальпаїном2a.
Рис. 4. Кальпаїн2а інгібує експресію білка TRAF6. a Експеримент із часовим градієнтом порожніх векторів або плазмід calpain2a-Myc разом із TRAF6- Flag проводився в клітинах EPC. Клітинні лізати піддавали IB анти-Myc, anti-Flag і анти-Tubulin Abs. РНК екстрагували з клітин і проводили зворотну транскрипцію, а потім TRAF6 і актин ампліфікували за допомогою ПЛР-праймерів. b Клітини EPC висівали в 12-лункові планшети протягом ночі та котрансфікували TRAF6-Flag і кальпаїном2a-Myc (0.3, 0.6 або {{ 18}},9 мкг) протягом 48 год. Експресію білків TRAF6-Flag і calpain2a-Myc було виявлено за допомогою вестерн-блоттингу. РНК екстрагували з клітин і проводили зворотну транскрипцію, потім TRAF6 і актин ампліфікували праймерами ПЛР. c calpain2a-Myc або порожні вектори були спільно трансфіковані TRAF6-Flag у клітини EPC. Через 36 годин після трансфекції трансфіковані клітини обробляли циклогексимидом (CHX) протягом 2 або 4 годин. d Клітини MKC трансфікували calpain2a-Flag або порожніми векторами. Через 48 годин після трансфекції клітинні лізати піддавали IB з анти-TRAF6, анти-Flag і анти-Tubulin Abs. e, f Клітини EPC трансфікували зазначеними плазмідами в присутності або за відсутності MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 або 75 мкМ) або PMSF протягом 6 за годину до проведення імуноблот-аналізу. g Клітини MKC трансфікували кальпаїном2a-Flag у присутності або відсутності E{{50}} (50 або 75 мкМ) протягом 6 годин перед проведенням імуноблот-аналізу. h calpain2a-Flag і calpain2a-ΔCysPc-Flag були спільно трансфіковані TRAF6-HA у клітини EPC. Через 48 годин після трансфекції клітинні лізати піддавали IB із зазначеними Abs. I calpain2a-Flag і calpain2a-ΔCysPc-Flag були спільно трансфіковані в клітини MKC. Через 48 годин після трансфекції клітинні лізати піддавали IB з анти-TRAF6, анти-Flag і анти-Tubulin Abs. j IL-1 , IL-8 мРНК у MKC, стабільно трансдукованих за допомогою calpain2a-Flag і calpain2a-ΔCysPc-Flag і оброблених фізіологічним розчином (0) або заражених LPS протягом 4 годин (n=3 на групу). Відносний рівень мРНК нормалізували до експресії гена, що кодує -актин, у кожному зразку. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах. Дані аналізували двостороннім дисперсійним аналізом (j). **р <0,01.
Щоб визначити, чи залежала деградація TRAF6 від гідролазної активності кальпаїну2a. Скориставшись попередніми структурними та біохімічними дослідженнями кальпаїну2a у ссавців, ми мутували залишки цистеїну, гістидину та аспарагіну кальпаїну2a на аланін (кальпаїн2a C105A, H262A, N286A та 3A), який втратив координацію каталітичної тріади44–46. Ми спостерігали, що ця мутація не вплинула на деградацію TRAF6 (додатковий рис. 1а). Таким чином, ми мутували домен протеази, який є доменом цистеїнової протеази родини Calpain (CysPc) кальпаїну2a (позначений як calpain2a-ΔCysPc). Кальпаїн2a-ΔCysPc не впливає ні на надекспресований TRAF6, ні на ендогенний TRAF6 (рис. 4h, i). Однак на прозапальні цитокіни IL-1 та IL-8 одночасно впливає кальпаїн2а дикого типу або мутований кальпаїн2а при стимуляції ЛПС (рис. 4j). Мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, не впливає на рівень білка TRAF6, але мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, все ще впливає на експресію наступних прозапальних цитокінів. Це спонукало наше дослідження потенційних механізмів, за допомогою яких кальпаїн2a регулює TRAF6. Взяті разом, ці результати показують, що кальпаїн2а регулює передачу сигналів NF-κB шляхом пригнічення експресії рівнів білка TRAF6 через його активність кальпаїн-гідролази.
calpain2a пригнічує активність убіквітинлігази TRAF6.
Далі ми дослідили молекулярні механізми, за допомогою яких кальпаїн2a негативно регулює TRAF6-активовану передачу сигналів NF-κB, і чи взаємодія кальпаїну2a з TRAF6 після втрати ферментативної активності модулює його активність убіквітинлігази. Ми обробили клітини MKC LPS, а потім імунопреципітували TRAF6. Аналіз убіквітування з очищеними рекомбінантними білками підтвердив, що кальпаїн2a та кальпаїн2a-ΔCysPc зменшують убіквітування TRAF6 (рис. 5а). Як показано на фіг. 5b, c, як кальпаїн2a, так і кальпаїн2a-ΔCysPc значно знижували WT і K63 убіквітовані білки TRAF6. Градієнти концентрації кальпаїну2a та кальпаїну2a-ΔCysPc зменшували убіквітовані білки WT та K63 TRAF6 залежно від дози. calpain2a-ΔCysPc все ще запобігав агрегації ланцюга убіквітину K63 TRAF6, не впливаючи на рівень білка TRAF6 (рис. 5d, e). Потім ми трансфікували клітини MKC для експресії міченого Myc TRAF6 у присутності або відсутності міченого Flag кальпаїну2a-ΔCysPc, потім провели експерименти з імунопреципітації з антитілом проти Myc і проаналізували за допомогою імуноблоту з анти-UB. Таке повсюдне поширення TRAF6 було значно послаблено кальпаїном2a-ΔCysPc (рис. 5f). Стимульований LPS, TRAF6 доставляє K63-зв’язаний убіквітиновий ланцюг до TAK1, який стимулює аутофосфорилювання TAK1 і активує NF-κB18. Убіквітинові білки WT і K63 TAK1 були значно посилені в присутності TRAF6, тоді як пов’язане з TAK1- убіквітування інгібувалося в присутності кальпаїну2a-ΔCysPc (рис. 5g, h). Ці дані підтверджують, що мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, аналогічно пригнічує активність убіквітинлігази TRAF6, не впливаючи на рівні білка TRAF6.
Переваги Cistanche tubulosa- зміцнити імунну систему
calpain2a інгібує гомоолігомеризацію TRAF6.
Ланцюг убіквітину Lys63, синтезований TRAF6, відіграє ключову роль у передачі сигналу. Повідомлялося, що димеризація TRAF6 є важливою для синтезу його убіквітинового ланцюга16. Модель димеризації тісно пов'язана з комбінацією Ubc13 для отримання K63 убіквітування16,30. Щоб перевірити, чи може TRAF6 риби утворювати димери, ми використовували плазміди TRAF6 з різними мітками: TRAF6 з Myc-міткою та TRAF6 з HA-міткою для експериментів спільного IP. Аналіз IP проводили з використанням анти-НА антитіла, HATRAF6 взаємодіяло з Myc-TRAF6 (рис. 6а). Щоб дослідити інгібуючий ефект кальпаїну2a у взаємодії димеру TRAF6-, кальпаїн2a, мічений Flag, TRAF6, мічений HA, і TRAF6, мічений Myc, тимчасово експресували в клітинах HEK293. Як і очікувалося, взаємодія TRAF6-димеру була знижена в присутності кальпаїну2a (рис. 6b). У той же час, щоб уникнути присутності деградації TRAF6 кальпаїном2a. Ми трансфікували кальпаїн2a-ΔCysPc, позначений флагом, і виявили, що взаємодія димеру TRAF6- поступово знижується в присутності кальпаїну2a-ΔCysPc (рис. 6c). Як показано на рис. 6d, e, ми виявили, що HA-TRAF6 посилює WT і K63 убіквітування Myc-TRAF6. У той час як клітини HEK293 були котрансфіковані кальпаїном2a та кальпаїном2a-ΔCysPc, посилене убіквітування буде пригнічено. Ці результати свідчать про те, що як кальпаїн2a дикого типу, так і мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня гідролазна активність, інгібують гомоолігомеризацію та автоубіквітування TRAF6.
calpain2a пригнічує доставку убіквітування TRAF6 до ECSIT і BECN1.
Як показано на рис. 5d, ми виявили, що кальпаїн2a перешкоджає процесу убіквітиляції від TRAF6 до TAK1. Повідомлялося, що ECSIT діяв як адаптерний білок TAK1 і TRAF6 для сприяння передачі сигналу NF-κB шляхом стимуляції LPS37. Щоб перевірити, чи має ECSIT згадані функції у кісткових риб, ми виконали численні вирівнювання послідовностей білків ECSIT у людини, миші та майбутнього горбаля (додаткова рис. 1b). Ми трансфікували клітини EPC репортером люциферази NF-κB, ECSIT значно посилив активність репортера NF-κB після стимуляції LPS (додаткова рис. 1c). Надмірна експресія ECSIT у клітинах MKC призвела до підвищення рівня мРНК TNF- (додатковий рис. 1d). Після трансфекції ECSIT і TRAF6 риби в клітини HEK293 ми виявили, що TRAF6 взаємодіє з ECIST (рис. 7a). Подібним чином, ECSIT і TAK1 були спільно трансфіковані, і два білки також підтримували взаємодію (рис. 7b). Згодом, щоб перевірити, чи calpain2a-ΔCysPc пригнічує утворення комплексу TRAF6-ECSIT, ми трансфікували три плазміди в клітини HEK293 і виявили, що calpain2a-ΔCysPc запобігає комплексу TRAF6-ECSIT (рис. 7c). ). Перевірити процес передачі ланцюга убіквітину в передачі сигналу NF-κB. Як показано на рис. 7d, TRAF6 може сприяти повсюдному поширенню ECSIT; як і очікувалося, кальпаїн2a-ΔCysPc пригнічував процес, за допомогою якого TRAF6 передавав ланцюг убіквітину до ECSIT. BECN1 є важливим білком у LPS-індукованій аутофагії. Було підтверджено, що убіквітування K63 може модифікувати та активувати BECN1. Деубіквітуючий фермент A20 усуває убіквітування BECN1 і пригнічує аутофагію, спричинену LPS, а TRAF6 є лігазою E3, відповідальною за убіквітування BECN1 у цьому сигналі47. Як показано на фіг. 7e, TRAF6 взаємодіяв з BECN1 і сприяв повсюдному поширенню BECN1. Потім ми трансфікували BECN1, TRAF6, calpain2a та calpain2a-ΔCysPc у клітини HEK293, TRAF6 сприяв повсюдному поширенню BECN1. calpain2a-ΔCysPc інгібував процес, за допомогою якого TRAF6 передавав ланцюг убіквітину до BECN1 (рис. 7f). Ці результати свідчать про те, що кальпаїн2a дикого типу та мутантний кальпаїн2a, у якого відсутня активність гідролази, пригнічують здатність TRAF6 до убіквітинування при аутофагії, індукованій LPS, і передачі сигналу NF-κB.
Негативна регуляція противірусної відповіді кальпаїном2а.
На шляху RLR TRAF6 діє як лігаза E3, залучена MAVS для активації NF-κB, виробництва IFN і цитокінів. Далі ми перевірили, чи calpain2a відіграє роль у запобіганні TRAF6 у опосередкованому IFN противірусному процесі. У клітинах EPC експресувалися репортери люциферази, керовані промотором IFN-1, ISRE та IRF3. Ми виявили, що кальпаїн2a суттєво знижує цю керовану промотором активність люциферази залежно від дози при стимуляції Ploy (I: C) та інфікуванні рабдовірусом Siniperca cheats (SCRV) (рис. 8a, b). Нокдаун кальпаїну2a значно посилював експресію генів Ploy(I:C) і SCRV, включаючи Viperin, Mx1 і ISG15 (рис. 8c, d). Нокдаун кальпаїну2a призвів до вищої експресії життєздатності клітин після інфікування SCRV у клітинах MKC (рис. 8e). Як показано на рис. 8f, аналізи клітинної проліферації показали, що нокдаун кальпаїну2a посилює клітинну проліферацію при інфікуванні SCRV. Надмірна експресія кальпаїну2a різко сприяла поширенню вірусу, що відображено в реплікації вірусу після інфікування SCRV (рис. 8g). calpain2a та calpain2a-ΔCysPc суттєво знижували IFN-1, ISRE та IRF3 керовані промотором люциферазні репортери після стимуляції Ploy(I:C) та інфікування SCRV (додаткова рис. 2a, b). Ці результати свідчать про те, що кальпаїн2a може негативно регулювати сигнальний шлях RLR через інгібування TRAF6, тим самим інгібуючи активацію IFN.
Рис. 5. Кальпаїн2а інгібує активність убіквітинлігази TRAF6. a Убіквітування ендогенного TRAF6 у клітинах MKC, трансдукованих за допомогою calpain2a-Flag і calpain2a-ΔCysPc-Flag і незаражених (-) або заражених LPS (+), оцінено за допомогою імуноблот-аналізу з анти-убіквітином після імунопреципітації з анти-TRAF6 та вхідного імуноблот-аналізу із зазначеними абс. b, c Клітини HEK293 були котрансфіковані TRAF6-HA і WT-убіквітином-His або K63O убіквітином-His (у якому зберігається лише лізин 63) разом з calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. d, e Клітини HEK293 були котрансфіковані TRAF{{30}}HA та WT-ubiquitin-His або K63O-ubiquitin-His (у яких зберігається лише лізин 63) разом із calpain2a-Flag ({{45 }}.5 мкг, 1 мкг), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 мкг, 1 мкг) або порожній вектор. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. f Убіквітування надекспресованого TRAF6 у клітинах MKC, трансдукованих за допомогою кальпаїну2a-ΔCysPc-Flag, оцінене за допомогою імуноблот-аналізу з анти-убіквітином після імунопреципітації з анти-Myc та вхідного імуноблот-аналізу з указаними Abs. g, h Клітини HEK293 були котрансфіковані TAK1-Myc, TRAF6-HA та WT-ubiquitin-His або K63O-ubiquitin-His (у яких зберігається лише лізин 63) разом із calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag або порожній вектор. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. Усі імунопреципітати та вхідний імуноблот-аналіз з анти-Myc, anti-Flag, анти-HA та анти-Tubulin Abs. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах.
calpain2a пригнічує убіквітування IRF3 та IRF7 від TRAF6.
Повідомляється, що в противірусному сигналі, викликаному комплексом MAVS-TRAF3/6, активність TRAF6 необхідна для активації IRF3 і NF-κB48. Як показано на фіг. 9a, b, TRAF6 сприяє WT і K63-пов’язаному повсюдному убіквітуванню IRF3, і це посилення інгібується експресією calpain2a-ΔCysPc. Тим часом, коли вірус запускає TLR-залежний сигнал сигналу, TRAF6 тісно пов’язаний з IRF7 і сприяє повсюдному поширенню IRF7 разом із активованими противірусними факторами22,49,50. TRAF6 сприяє WT і K63-пов’язаному повсюдному убіквітуванню IRF7, і це посилення пригнічується експресією кальпаїну2a-ΔCysPc (рис. 9c, d). Ці дані свідчать про те, що кальпаїн2a дикого типу та мутантний кальпаїн2a без активності гідролази інгібують TRAF6-опосередковане убіквітування IRF3 та IRF7.
Обговорення
TRAF6 є одним із семи членів сімейства факторів, пов’язаних з рецептором фактора некрозу пухлин (TNF) (TRAF), який був ідентифікований як адаптер сигналу та здійснює трансдукцію сигналу51,52. Сімейство TRAF містить домен безіменного пальця, який володіє лігазною активністю E3. Лігази E3 з доменом HECT сприяють поліубіквітуванню субстрату, а E3 з доменом Ring потребують E2~ub для передачі поліубіквітування53,54. Було підтверджено, що димерний Ub-зв’язуючий фермент Ubc13/Uev1A бере участь в агрегації поліубіквітування TRAF616. У той час як K124 TRAF6 миші нокаутовано, TRAF6 втратить активність автоубіквітування K63, а мутація в цьому місці усуває повсюдне поширення TRAF6-опосередкованого NEMO та активацію TAK1, IKK і NF-κB55 . Саме тому, що PRDX1 зв’язується з доменом TRAF6 Ring Finger, що міститься в K124, і усуває повсюдне поширення TRAF638. Повідомлялося, що убіквітування TRAF6 тісно пов’язане з димеризацією його N-кінцевого домену (домен безіменного пальця та ZF пальця). Кілька N-кінцевих сайтів взаємодії з Ubc13 були мутовані, і Ubc13 не міг передавати poly~ub до TRAF616. Взаємодія між мутантами calpain2a та TRAF6 показала, що більшість доменів TRAF6 взаємодіяли з calpain2a, за винятком домену безіменного пальця. Завдяки взаємодії між кальпаїном2a та доменом ZF fingers TRAF6 ми припустили, що кальпаїн2a може інгібувати автоубіквітування, блокуючи димеризацію TRAF6. Згодом ми перевірили взаємодію різних тегів TRAF6. У міру збільшення експресії мутантного кальпаїну 2a, у якого не вистачає активності гідролази, взаємодія різних міток TRAF6 послаблюється. HA-мічений TRAF6 сприяє повсюдному розповсюдженню Myc-міченого TRAF6, а мутантний кальпаїн2a інгібує убіквітинування, посилене HA-міченим TRAF6. Будучи проміжною ланкою в процесі передачі сигналу TRAF6-TAK1, ECSIT зв’язується з C-кінцевим доменом TRAF6 (домен CC і домен TRAF-C) і, як підтверджено, бере участь у передачі сигналу NF-κB37. Експресія прозапальних цитокінів знижена в клітинах ECSITKD THP-1. Однак після надмірної експресії ECSIT у клітинах ECSITKD THP-1 кількість таких генів, як IRF7, IL-1 і CD44, значно зросла37. PRDX1 зв’язується з доменом безіменного пальця TRAF6 і пригнічує убіквітування ECSIT і BECN1 у сигналах NF-κB і аутофагії шляхом інгібування утворення поліубіквітування TRAF638. У костистих риб ми підтвердили, що ECSIT активує сигнальний шлях NF-κB, взаємодіє з TRAF6 і TAK1 відповідно та передає поліубіквітиновий ланцюг, вироблений TRAF6. calpain2a зв’язувався з доменом ZF, доменом CC і доменом TRAF-C TRAF6, що пригнічувало взаємодію TRAF6-ECSIT. Ми підтвердили, що мутантний кальпаїн2a, позбавлений активності гідролази, перешкоджав поліубіквітиновому ланцюгу від TRAF6 до ECSIT і BECN1.
Рис. 6 кальпаїн2а послаблює автоубіквітування TRAF6. a HEK293 клітини були трансфіковані TRAF6-Myc, TRAF6-HA або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували за допомогою антитіла до НА. b Клітини HEK293 були трансфіковані TRAF6-Myc, TRAF6-HA, порожнім вектором або calpain2a-Flag. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували за допомогою антитіла до НА. c Клітини HEK293 трансфікували TRAF6-Myc, TRAF6-HA, порожнім вектором або різними концентраціями кальпаїну2a-ΔCysPc-Flag. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували за допомогою антитіла до НА. d, e Клітини HEK293 були котрансфіковані TRAF6-Myc, TRAF6-HA та WT-ubiquitin-His або K63O-ubiquitin-His (у яких зберігається лише лізин 63) разом із calpain2a-Flag , calpain2a-ΔCysPc-Flag або порожній вектор. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. Імунопреципітати та вхідний імуноблот-аналіз з анти-Myc, анти-Flag, анти-HA та анти-Tubulin Abs. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах.
Рис. 7. calpain2a інгібує TRAF6-опосередковане убіквітування ECSIT і BECN1. клітини HEK293 трансфікували ECSIT-Myc, TRAF6-Flag або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували за допомогою антитіла Flag. b Клітини HEK293 були трансфіковані TAK1-Flag, ECSIT-Myc або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували антитілом Myc. c Клітини HEK293 трансфікували TRAF6-Myc, ECSIT-HA, порожнім вектором або різними концентраціями кальпаїну2a-ΔCysPc-Flag. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували антитілом Myc. d Клітини HEK293 були котрансфіковані ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His разом з calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. e Клітини HEK293 трансфікували BECN1-Flag, TRAF6-Myc або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та IP аналізували антитілом Myc. f Клітини HEK293 були котрансфіковані BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His разом з calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag або порожнім вектором. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. Імунопреципітати та введення з анти-Myc, анти-Flag, анти-HA та анти-Tubulin Abs. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах.
Ми помітили, що кальпаїн2a має гідролазну активність як одна з сімейства кальцій-залежних протеаз. м-кальпаїн (кальпаїн-2) відіграє позитивну регуляторну роль у сигнальному шляху NF-κB клітин печінки HepG2. Незалежно від 26-секундного протеасомного підходу, кальпаїн2a гідролізує IkB для вивільнення фактора транскрипції NF-κB. Специфічний інгібітор білка кальпаїну запобігає деградації IkB 56. Однак щодо кальпаїну є кілька досліджень вродженої імунної відповіді риб. У клітинах MKC надмірна експресія кальпаїну2a інгібувала NF-κB нижче за течією прозапальних цитокінів, індукованих LPS. Це явище суперечило результатам у клітинах печінки HepG2. Можливо, видова специфіка сімейства білків кальпаїну викликала різні ефекти. Подібним чином ми використовували специфічний інгібітор білка кальпаїну E-64, щоб запобігти гідролізу кальпаїном2a TRAF6. Мутантний кальпаїн2a, позбавлений активності гідролази, пригнічує активність убіквітинлігази TRAF6, не впливаючи на рівень білка. Ми не знайшли ферментно-активних сайтів для кальпаїну2а. Згідно з попередніми дослідженнями на ссавцях, три ділянки: залишки цистеїну (C105A), гістидину (H262A) і аспарагіну (N286A). Однак наші експерименти підтверджують, що три активні сайти кальпаїну2a горбаля не впливають на експресію рівнів білка TRAF6, але це впливає на мутантний кальпаїн2а, у якого відсутній домен гідролази. Тому ми вирішили мутувати весь фермент-активуючий структурний домен. Хоча білок кальпаїн2а є відносно консервативним у ссавців і нижчих хребетних, специфічні сайти ферментативної активності заслуговують на подальше дослідження.
цистанхе рослина, що підвищує імунну систему
Підводячи підсумок, ми визначили кальпаїн2а як негативний регулятор ЛПС-індукованої передачі сигналів NF-κB та вірус-індукованої активації IFN (рис. 9e). У мас-спектрометрії кальпаїн2a може взаємодіяти з TRAF6, і ми продемонстрували це явище за допомогою експерименту ендогенної коімунопреципітації. Ми виявили, що кальпаїн2a бере участь у регуляції сигнального шляху NF-κB, індукованого LPS. Крім того, TRAF6 також відіграє важливу роль у противірусних сигнальних шляхах. Ми використовували SCRV і Ploy(I: C) для стимуляції сигнального шляху IFN і виявили, що кальпаїн2a також може пригнічувати передачу сигналів IFN шляхом регулювання рівня білка та автоубіквітації TRAF6. Оскільки TLR3 може розпізнавати структуру дволанцюгової РНК (dsRNA), що виробляється вірусними інфекціями. Ми більше зацікавлені в з’ясуванні регуляції кальпаїном2a сигнального шляху IFN, опосередкованого TRAF6-, але не виключаємо потенційного зв’язку між сигнальним шляхом кальпаїну2a та TLR3. calpain2a сприяв деградації TRAF6 гідролітичним способом і взаємодіяв з TRAF6, щоб інгібувати утворення димерів і автоубіквітування. Це інгібування запобігало взаємодії TRAF6 і ECSIT і процесу убіквітування з TRAF6 на ECSIT, BECN1, IRF3 і IRF7. Наші поточні результати сприятимуть розумінню механізмів негативної регуляції шляхом націлювання на TRAF6 у вроджених імунних реакціях. Крім того, це дослідження вказує на ключову роль гомоолігомеризації TRAF6 і автоубіквітування в процесі вродженої імунної відповіді риб. Одночасно пропонується кальпаїн2а як білок регуляторного механізму для пригнічення імунної відповіді TRAF6 і запобігання нормальному та впорядкованому сигнальному шляху. Ці відомості допомагають зрозуміти імунологію хребетних та еволюцію імунної системи хребетних.
Рис. 8 кальпаїн2а інгібує SCRV- або Poly(I:C)-індуковану активацію IFN. Клітини ab EPC трансфікували різними концентраціями calpain2a-Flag або порожнього вектора разом із репортерами пролюциферази IFN-1, ISRE та IRF3-. Через 24 години після трансфекції клітини були імітовано інфіковані або інфіковані SCRV або Poly(I:C) протягом 12 годин (n=3 на групу). Вестерн-блот аналіз використовували для вимірювання експресії тимчасово трансфікованого calpain2a-Flag. Експресію тубуліну використовували як контроль навантаження. c, d Viperin, Mx1, мРНК ISG15 у MKC, стабільно трансдукованих si-calpain2a #1 або si-ctrl (контрольний вектор) і оброблених фізіологічним розчином (0) або заражених SCRV або Poly(I:C) для 24 години Відносний рівень мРНК нормалізували до експресії гена, що кодує -актин, у кожному зразку (n=3 на групу). e, f Клітини MKC трансфікували si-ctrl або si-calpain2a #1. Через 24 години після трансфекції клітини стимулювали SCRV протягом 24 годин, потім вимірювали аналіз життєздатності клітин і аналіз проліферації клітин (n=3 на групу). Масштабна шкала, 100 мкм. g Клітини MKC трансфікували calpain2a-Flag або pcDNA3.1, потім інфікували SCRV протягом 24 годин (n=3 на групу). Аналіз qRT-PCR проводився для внутрішньоклітинної та супернатантної експресії РНК SCRV. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах. Дані аналізували за допомогою одностороннього дисперсійного аналізу (a, b), двостороннього дисперсійного аналізу (c, d, e, f) або двостороннього t-критерію Стьюдента (g). *p < 0,05, **p < 0,01.
методи
Культура клітин.
Лінії клітин ембріональної нирки людини (HEK) 293 і лінії клітин Epithelioma papulosum cyprini (EPC) були придбані в Американській колекції типових культур і зберігалися в нашій лабораторії. Лінії клітин нирки горбаля Miiuy (M. miiuy) (MKC) і клітинні лінії кишечника горбаля Miiuy (MIC) культивували з тканин нирок і кишечника горбаля miiuy57,58. Клітинні лінії нирок горбаля Miiuy та клітини кишечника горбаля Miiuy культивували при 26 градусах у зволоженому інкубаторі, що містить 0.5% CO2 у середовищі L-15 (HyClone, США) з додаванням 15% FBS (Gibco). , США), 100 ОД/мл пеніциліну (Gibco, США), 100 од/мл стрептоміцину (Gibco, США) і 20 ОД/мл гепарину (Solarbio, Китай). Клітини папулезної епітеліоми cyprini вирощували при 26 градусах у зволоженому інкубаторі, що містить 5% CO2 у середовищі 199 (Hyclone), доповненому 10% FBS, 2 мМ L-глутаміну, 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мг/мл стрептоміцину. Клітини людської ембріональної нирки 293 вирощували при 37 градусах у зволоженому інкубаторі, що містив 5% CO2 у модифікованому середовищі Ігла Дульбекко (DMEM) (Invitrogen), доповненому 10% FBS, 2 мМ L-глутаміну, 100 ОД/мл пеніциліну та 100 мг /мл стрептоміцину.
Рис. 9 кальпаїн2a інгібує опосередковане TRAF{2}}убіквітування IRF7 та IRF3. b Клітини HEK293 були котрансфіковані IRF3-Myc, TRAF6-HA та WTubiquitin-His або K63O-ubiquitin-His (у якому зберігається лише лізин 63) разом із calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc -Прапор або порожній вектор. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. c, d Клітини HEK293 були котрансфіковані IRF7-Myc, TRAF6-HA та WT-ubiquitinHis або K63O-ubiquitin-His (у яких зберігається лише лізин 63) разом із calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-Flag або порожній вектор. Через 24 години після трансфекції клітини лізували та очищали Ni-NTA агарозою. Усі імунопреципітати та введення з анти-Myc, анти-Flag, анти-HA та анти-Tubulin Abs. Усі експерименти проводили як мінімум у трьох незалежних експериментах. e Модель, що детально описує роль кальпаїну2а в TRAF6-опосередкованих сигнальних шляхах. Після LPS та вірусу TRAF6 може бути активований, гомоолігомеризація та автоубіквітування. BECN1, ECSIT, IRF7 і IRF3 убіквітуються TRAF6 і викликають активацію сигналів, що передаються вниз. calpain2a як негативний регулятор націлюється на TRAF6, щоб інгібувати TRAF6-опосередковані сигнальні шляхи.
Список літератури
1. Акіра, С., Уемацу, С. і Такеучі, О. Розпізнавання патогенів і вроджений імунітет. Cell 124, 783–801 (2006).
2. Takeuchi, O. & Akira, S. Рецептори розпізнавання образів і запалення. Cell 140, 805–820 (2010).
3. Wu, J. & Chen, ZJ Вроджене імунне відчуття та сигналізація цитозольних нуклеїнових кислот. Annu. Rev. Immunol. 32, 461–488 (2014).
4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).
5. Schlee, M. Головні сенсори патогенної РНК - RIG-I подібні рецептори. Імунобіологія 218, 1322–1335 (2013).
6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR білки: невід'ємні члени вродженого імунітету та медіатори запальних захворювань. Я. Левок. Biol. 83, 13–30 (2008).
7. Акіра, С. і Хеммі, Х. Розпізнавання молекулярних структур, пов’язаних з патогенами, сімейством TLR. Immunol. Lett. 85, 85–95 (2003).
8. Kawai, T. & Akira, S. Роль рецепторів розпізнавання образів у вродженому імунітеті: оновлення Toll-подібних рецепторів. Нац. Immunol. 11, 373–384 (2010).
9. Kawagoe, T. та ін. Послідовний контроль залежних від Toll-подібних рецепторів відповідей за допомогою IRAK1 і IRAK2. Нац. Immunol. 9, 684–691 (2008).
10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4–спільний активатор NF-kappaB у вродженому та набутому імунітеті. Trends Immunol. 27, 566–572 (2006).
11. Кавай, Т. і Акіра, С. Передача сигналів TLR. Клітинна смерть диф. 13, 816–825 (2006).
12. Deng, L. та ін. Активація кіназного комплексу IkappaB за допомогою TRAF6 потребує димерного ферментного комплексу, що кон’югує убіквітин, і унікального поліубіквітинового ланцюга. Cell 103, 351–361 (2000).
13. Ninomiya-Tsuji, J. та ін. Кіназа TAK1 може активувати каскад NIK-I kappaB, а також MAP-кінази в сигнальному шляху IL-1. Nature 398, 252–256 (1999).
14. Такаесу Г. та ін. TAB2, новий адаптерний білок, опосередковує активацію TAK1 MAPKKK шляхом зв’язування TAK1 з TRAF6 на шляху передачі сигналу IL-1. мол. Стільниковий. 5, 649–658 (2000).
15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm-опосередкована транслокація TRAF6 і TAB2 в індукованій інтерлейкіном-1-активації NF-kappa BJ Biol. Chem. 276, 41661–41667 (2001).
16. Yin, Q. та ін. Взаємодія E2 і димеризація в кристалічній структурі TRAF6. Нац. Структура. мол. Biol. 16, 658–666 (2009).
17. Wang, C. та ін. TAK1 є убіквітинзалежною кіназою MKK та IKK. Nature 412, 346–351 (2001).
18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF Типоспецифічна для клітин функція TAK1 у вродженій імунній сигналізації. Trends Immunol. 34, 307–316 (2013).
19. Чжан, Дж., Кларк, К., Лоуренс, Т., Пеггі, МВт і Коен, П. Несподіваний поворот в активації IKKbeta: TAK1 призначає IKKbeta для активації шляхом автофосфорилювання. біохім. J. 461, 531–537 (2014).
20. Emmerich, CH та ін. Активація канонічного комплексу IKK зв’язаними гібридними убіквітиновими ланцюгами K63/M1-. Proc. Нац. акад. Sci.110, 15247–15252 (2013).
21. Kawai, T. та ін. Індукція інтерферону-альфа через Toll-подібні рецептори передбачає пряму взаємодію IRF7 з MyD88 і TRAF6. Нац. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).
22. Kitagawa, Y. та ін. Білок V вірусу парагрипу людини типу 2 інгібує TRAF6-опосередковане убіквітування IRF7, щоб запобігти TLR7- і TLR9- залежній індукції інтерферону. Ж. Вірол. 87, 7966–7976 (2013).
23. Kawai, T. та ін. IPS-1, адаптер, що запускає опосередковану RIG-I та Mda5-індукцію інтерферону I типу. Нац. Immunol. 6, 981–988 (2005).
24. Зуст Р. та ін. 2'-O-метилювання рибози забезпечує молекулярний підпис для розрізнення власної та невласної мРНК залежно від РНК-сенсора Mda5. Нац. Immunol. 12, 137–143 (2011).
25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ. Ідентифікація та характеристика MAVS, мітохондріального противірусного сигнального білка, який активує NF kappaB та IRF 3. Cell 122, 669–682 (2005).
26. Xu, LG та ін. VISA — це білок-адаптер, необхідний для передачі бета-сигналів IFN, викликаної вірусом. мол. Стільниковий. 19, 727–740 (2005).
27. Yoshida, R. та ін. TRAF6 і MEKK1 відіграють ключову роль у RIG-I-подібному геліказному противірусному шляху. J. Biol. Chem. 283, 36211–36220 (2008).
28. Лю С. та ін. MAVS рекрутує кілька лігаз убіквітину E3 для активації противірусних сигнальних каскадів. Elife 2, e00785 (2013).
29. Івашків Л.Б., Донлін Л.Т. Регуляція відповідей на інтерферон І типу. Нац. Rev. Immunol. 14, 36–49 (2014).
30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. Механізм передачі убіквітину, сприяний TRAF6. Proc. Нац. акад. Sci. 115, 1783–1788 (2018).
31. Бун Д. Л. та ін. Убіквітин-модифікуючий фермент A20 необхідний для припинення відповідей Toll-подібних рецепторів. Нац. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).
32. Коваленко А. та ін. Супресор пухлини CYLD негативно регулює передачу сигналу NF kappaB шляхом деубіквітування. Nature 424, 801–805 (2003).
33. He, X. et al. USP2a негативно регулює IL-1бета- та індуковану вірусом NF kappaB активацію шляхом деубіквітинування TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).
34. Сяо Н. та ін. Убіквітин-специфічна протеаза 4 (USP4) націлена на TRAF2 і TRAF6 для деубіквітинації та пригнічує індуковану TNFальфа міграцію ракових клітин. біохім. J. 441, 979–986 (2012).
35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Убіквітин-специфічна пептидаза 20 спрямована на TRAF6 і таксу на вірус Т-клітинної лейкемії людини типу 1, щоб негативно регулювати передачу сигналів NF-kappaB. Ж. Вірол. 85, 6212–6219 (2011).
36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O негативно регулює TRAF6-опосередковану активацію NF-kappaB шляхом інгібування поліубіквітування TRAF6. Cell Res. 23, 366–377 (2013).
37. Wi, SM та ін. Комплекс TAK1-ECSIT-TRAF6 відіграє ключову роль у сигналі TLR4 для активації NF-kappaB. J. Biol. Chem. 289, 35205–35214 (2014).
38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY Інгібування активності убіквітинлігази TRAF6 PRDX1 призводить до інгібування активації NFKB та активації аутофагії. Автофагія 14, 1347–1358 (2018).
39. Jiao, S. et al. Кіназа MST4 обмежує запальні реакції шляхом прямого фосфорилювання адаптера TRAF6. Нац. Immunol. 16, 246–257 (2015).
40. Бодрі, М. і Бі, X. Кальпейн-1 і Кальпейн-2: Інь і Ян синаптичної пластичності та нейродегенерації. Тенденції Neurosci. 39, 235–245 (2016).
41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Регулювання клітинної міграції: кальпаїни роблять надріз. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).
42. Кацубе М. та ін. Кальпаїн-опосередкована регуляція різних сигнальних шляхів і клітинної міграції в нейтрофілах людини. Я. Левок. Biol. 84, 255–263 (2008).
43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Вплив інгібування кальпаїну на деградацію IkB альфа після активації PBMC: ідентифікація сайтів розщеплення кальпаїну. Нейрохім. рез. 29, 1443–1451 (2004).
44. Томпа П. та ін. Про послідовні детермінанти розщеплення кальпаїну. J. Biol. Chem. 279, 20775–20785 (2004).
45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Визначення специфічності пептидного субстрату для мю-кальпаїну за допомогою підходу на основі бібліотеки пептидів: важливість праймованих побічних взаємодій. J. Biol. Chem. 280, 40632–40641 (2005).
46. DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain прогнозування розщеплення за допомогою багатоядерного навчання. PLoS One. 6, e19035 (2011).
47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 і A20 регулюють 63-зв’язане з лізином убіквітування Бекліну-1 для контролю аутофагії, викликаної TLR4-. Sci. Сигнал. 3, ra42 (2010).
48. Loo, YM & Gale, M. Імунна передача сигналів RIG-I-подібними рецепторами. Імунітет 34, 680–692 (2011).
49. Лінг Т. та ін. TARBP2 пригнічує активацію IRF7 шляхом пригнічення TRAF6-опосередкованого K63-пов’язаного убіквітування IRF7. мол. Immunol. 109, 116–125 (2019).
50. Zhou, Z. та ін. Zebrafish otud6b негативно регулює противірусні реакції, пригнічуючи K63-пов’язане повсюдне розповсюдження irf3 та irf7. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).
51. Кобаяші, Т., Волш, МС і Чой, Ю. Роль TRAF6 у передачі сигналу та імунній відповіді. Зараження мікробами. 6, 1333–1338 (2004).
52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, молекулярний міст, що охоплює адаптивний імунітет, вроджений імунітет і остеоімунологію. Біоесе 25, 1096–1105 (2003).
53. Пікарт, К. М. та Еддінс, М. Дж. Убіквітин: структури, функції, механізми. Біохім. біофіз. Acta. 1695, 55–72 (2004).
54. Пікарт, К. М. і Фушман, Д. Поліубіквітинові ланцюги: полімерні білкові сигнали. Curr. Опін. Chem. Biol. 8, 610–616 (2004).
55. Lamothe, B. та ін. Сайт-специфічне аутоубіквітування фактора 6, пов’язаного з рецептором Lys-63-фактора некрозу пухлини, є критичним чинником активації I-каппа-В-кінази. J. Biol. Chem. 282, 4102–4112 (2007).
56 Хан, Ю., Вайнман, С., Болдог, І., Уокер, Р. К. і Брасьєр, А. Р. Протеоліз IkappaBalpha, індукований альфа-фактором некрозу пухлини, опосередкований цитозольним м-кальпаїном. Механізм, паралельний убіквітин-протеасомному шляху для активації ядерного каппа-фактора B. J. Biol. Chem. 274, 787–794 (1999).
57. Chu, Q. та ін. Висококонсервативна кільцева РНК circRasGEF1B посилює противірусний імунітет, регулюючи шлях miR-21-3p/MITA у нижчих хребетних. Ж. Вірол. 95, e02145–20 (2021).
58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a індукує аутофагію, щоб блокувати передачу сигналів NF-kappaB і апоптоз, щоб полегшити інфекцію Vibrio harveyi. iScience 26, 106105 (2023).
59. Sepulcre, MP та ін. Еволюція розпізнавання та сигналізації ліпополісахаридів (LPS): TLR4 риби не розпізнає LPS і негативно регулює активацію NF kappaB. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).
60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Довга некодуюча РНК NARL регулює імунні відповіді за допомогою мікроРНК-опосередкованої регуляції NOD1 у кісткових риб. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).
61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Екзон-інтронна циркулярна РНК circRNF217 сприяє вродженому імунітету та антибактеріальній активності кісткових риб шляхом зменшення miR-130-3p функція. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).
62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Рабдовірус-індукована мікроРНК -210 модулює противірусну вроджену імунну відповідь шляхом націлювання на STING/MITA у риб. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).
63. Bi, D. та ін. Розпізнавання ліпополісахариду та активація NF-kappaB цитозольним датчиком NOD1 у кісткових риб. Фронт. Immunol. 9, 1413 (2018).
64. Ян, X., Чжао, X., Хуо, Р. і Сю, Т. IRF3 і IRF8 регулюють передачу сигналів NF-kappaB шляхом націлювання на MyD88 у кісткових риб. Фронт. Immunol. 11, 606 (2020).
65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k пригнічує передачу сигналів NF-kappaB шляхом націлювання на MyD88 для ATG5-опосередкованої аутофагічної деградації в кісткових рибах. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).