Потенціал вакцин на основі дендритних клітин для модуляції вроджених популяцій лімфоїдних клітин типу 3

Анотація:

Вакцини на основі дендритних клітин (ДК) – це тип імунотерапії, яка базується на зв’язку ДК з іншими аспектами імунної системи. DC є потужними антигенпрезентуючими клітинами, які беруть участь в активації вроджених імунних відповідей і вихованні адаптивного імунітету, що робить їх ідеальними мішенями для імунотерапії. Вроджені лімфоїдні клітини (ILC) відносно недавно ідентифіковані в галузі імунології та відіграють важливу роль у здоров’ї та захворюваннях. Дослідження, описані тут, вивчали зв’язок між ILC типу 3 (ILC3) і DC з використанням мишачої моделі вакцинації на основі DC. Спостерігалися місцеві та системні зміни в популяціях ILC3 після введення вакцини DC, а після зараження клітинами меланоми B16F10 спостерігалися зміни в популяціях ILC3 у легенях. Взаємодії між DC та ILC3 слід додатково досліджувати, щоб визначити потенціал, який їхні комунікації можуть мати у здоров’ї, хворобах та розвитку імунотерапії.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

Ключові слова:

дендритна клітина (ДК); тип 3 вродженої лімфоїдної клітини (ILC3); вроджений; спілкування

1. Введення

Вроджені лімфоїдні клітини (ВЛК) — це гетерогенна група лейкоцитів, що походять із звичайних лімфоїдних клітин-попередників, які виконують ключові функції у розвитку, відновленні та гомеостазі тканин. ILC були пов’язані з різними запальними захворюваннями, включаючи запальні захворювання кишечника, псоріаз, астму та різні аутоімунні захворювання [1]. Зазвичай їх поділяють на три основні групи: тип 1 (ILC1), тип 2 (ILC2) і тип 3 (ILC3) на основі експресії факторів транскрипції, профілів цитокінів і специфічних фенотипових маркерів [2]. Природні клітини-кілери (NK) іноді об’єднують у підмножину ILC1 через їхню подібність; однак було показано, що NK-клітини мають відмінні риси від ILC1, такі як експресія фактора транскрипції та цитолітична активність, що виділяє їх як власний підтип ILC [3]. Однак багато хто все ще розглядає NK-клітини як підмножину ILC1 [4]. Завдяки подібним цитокіновим профілям, факторам транскрипції та імунологічним функціям ILC (NK-клітини, ILC1s, ILC2s та ILC3s) вважаються вродженими аналогами компонентів адаптивної імунної системи, що відображають цитотоксичні Т-лімфоцити, Th1, Th2 та Th17. відповіді відповідно [4]. Однак, на відміну від Т-клітин, у них відсутні антигенспецифічні рецептори [5].

ДК — це вроджені лейкоцити, які мають вирішальне значення для індукції імунної відповіді та толерантності. Вони мають рецептори розпізнавання патернів, які розпізнають молекулярні патерни, пов’язані з патогенами та/або пошкодженнями, і є найефективнішими антигенпрезентуючими клітинами [6]. Через презентацію антигену та секрецію цитокінів DC можуть диктувати долю наївних Т-клітин і індукувати прозапальні реакції або імуносупресію. Т-клітини можна навчити розпізнавати антиген як небезпечний і атакувати його або як ненебезпечний і приймати толерогенний фенотип [6]. ДК також беруть участь в активації вродженого імунітету, а також у вихованні адаптивного імунітету. Завдяки прямому контакту або виробленню різних цитокінів і розчинних факторів ДК можуть активувати інші вроджені лейкоцити та сприяти вродженій імунній відповіді [7].

Потужність DC використовується в імунотерапії, наприклад вакцини DC. Вакцини ДК готують шляхом виділення ДК від пацієнта або виділення попередників ДК і отримання ДК. Цими DC маніпулюють ex vivo, що включає дозрівання DC імуногенним способом. DC також завантажені специфічними антигенами, які будуть спрямовані на розвиток імуногенних відповідей, спрямованих на вакцину [8]. Вакцини DC є імунотерапевтичною платформою, яка використовує переваги здатності DC навчати адаптивну імунну систему індукувати антиген-специфічні відповіді, зокрема антиген-специфічні цитотоксичні Т-клітини. Таким чином, більшість досліджень вакцини DC зосереджено на здатності DC розвивати адаптивну імунну систему. Проте останніми роками було показано, що взаємозв’язок між ДК і NK-клітинами має потужний вплив на протипухлинний імунітет, що є вирішальним для ефективності вакцинації ДК [9–11]. Це демонструє важливу потребу досліджувати інші взаємозв’язки між ДК та різними вродженими лейкоцитами та вплив, який ці комунікації можуть мати на ефективність вакцин ДК. Оскільки NK-клітини є частиною сімейства ILC і через велику схожість ILC з Т-клітинами [5], мета досліджень, представлених тут, полягала в дослідженні потенційного зв’язку між DC та іншим членом сімейства ILC, ILC3s. Ми використовували платформу вакцини DC (moDC), отриману з моноцитів, де DC були створені ex vivo з клітин-попередників кісткового мозку миші. Вакцини MoDC є найпоширенішою формою вакцин DC, оскільки історично їх було найпростіше виготовити [12].

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Натисніть тут, щоб переглянути продукти Cistanche Enhance Imunity

【Запитуйте більше】 Електронна пошта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

ILC3 мають важливі функції в гомеостазі кишечника, імунітеті проти позаклітинних бактерій і розвитку лімфоїдних тканин [5]. ILC3 можна розділити на групи, які відрізняються експресією поверхневих маркерів і продукуванням цитокінів. Проте всі ILC3 експресують ROR t [13]. Однією підгрупою ILC3 є клітини-індуктори лімфоїдної тканини ILC3-, які важливі в органогенезі [14]. ILC3 також можна розділити на основі експресії природного рецептора цитотоксичності (NCR), який у мишей є експресією NKp46 [15,16], а у людей — NKp44 [17,18]. Таким чином, існують NCR+ і NCR-ILC3, які мають відмінності у своїх функціональних можливостях і фенотипових характеристиках. Наприклад, було припущено, що NCR+ ILC3s продукують IL-22, але не IL-17, тоді як NCR− ILC3s можуть продукувати обидва цитокіни [19]. Однак у недавньому дослідженні Фіансетта та ін. було показано, що NCR+ ILC3 здатні виробляти низьку кількість IL-17 [20]. Ранкін та ін. продемонстрували на мишах, що NCR+ ILC3s потребують фактора транскрипції T-bet. Таким чином, NCR+/- ILC3 можна диференціювати на основі експресії NKp46 і T-bet. У дослідженнях, описаних тут, мишачі ILC3 були визначені за лінією-CD45+DX5-ROR t +, при цьому NCR+ ILC3 також були T-bet+NKp46+, а NCR-ILC3 були T-bet-NKp46 − (Таблиця 1 і Додаток A, Рисунки A1–A3).

Таблиця 1. Підмножини ILC3, визначені методом проточної цитометрії.

Мета цього дослідження полягала в тому, щоб допомогти з’ясувати, чи існує зв’язок між DC-вакцинами та ILC3, а також потенціал їхньої взаємодії в імунотерапії DC. Було продемонстровано, що ILC3 відіграють роль у різних захворюваннях і ракових захворюваннях і, отже, мають потенціал у різних контекстах імунотерапії. ILC3 є відносно новими на сцені імунології, і, як наслідок, їхній вплив на захворювання та лікування досліджувався обмежено. ILC3 реагують на зовнішні подразники, які будуть диктувати їхню діяльність і чи сприятимуть вони прогресуванню чи пригніченню пухлин [21,22]. Подібно до клітин Th17, ILC3 мають фактор транскрипції ROR t і виробляють цитокіни відповіді Th17, такі як IL-17 та IL-22. IL-22 важливий для контролю бактеріальних інфекцій у кишечнику [16]. Проте на моделі індукованого бактеріями раку товстої кишки було продемонстровано, що IL-17 та IL-22 з ILC в товстій кишці сприяли розвитку раку товстої кишки [23]. Крім того, ILC3 корелювали з негативними наслідками раку молочної залози [24]. І навпаки, спостерігався зв’язок між NCR+ ILC3s і третинними лімфоїдними структурами (TLS) і кращі клінічні результати при недрібноклітинному раку легенів [18]. Крім того, нещодавнє дослідження вивчало ILC3 при колоректальному раку. Дослідження спостерігало збільшення ILC1s і зниження ILC3s у зразках пацієнтів із резецованими колоректальними пухлинами порівняно з суміжними незлоякісними прилеглими тканинами. Секвенування РНК і транскрипційний профіль показали, що ILC3 мають підвищену пластичність і відрізняються функціональними можливостями в колоректальних пухлинах порівняно з незлоякісними тканинами. Цікаво, що секвенування РНК також показало, що ILC3, що інфільтрують пухлину, мають підвищену пластичність для переходу до фенотипу ILC1. Дослідження показало, що взаємодії ILC3 з Т-клітинами підтримують імунітет I типу, а при колоректальному раку ці взаємодії обмежені, що перешкоджає протипухлинним реакціям. Це підтримує важливу функцію ILC3 у протипухлинному імунітеті. Загалом, стаття продемонструвала значну роль, яку відіграють ILC3 у регуляції імунологічного гомеостазу та колоректального раку [25]. Тому вважається, що ILC3 мають подвійну роль у здоров’ї та хворобі. Вони можуть сприяти прогресуванню раку [23,24,26], але також можуть сприяти протипухлинним реакціям [18,25,27,28]. Їхній фенотип і внесок у розвиток раку виявляються контекстними, що вказує на можливість маніпулювати ILC3 за допомогою імунотерапії для отримання фенотипу, який сприяє протираковим реакціям, а не підтримує прогресування пухлини. Таким чином, вакцини на основі DC представляють собою можливий метод впливу на мікрооточення пухлини шляхом маніпулювання фенотипами ILC та їх продукуванням цитокінів, що дозволить адаптувати імунну відповідь залежно від обставин і може бути корисним у дослідженнях раку.

Оскільки дослідження зв’язку між DC та ILC3 були обмежені, особливо в контексті вакцинації DC, описані тут дослідження вивчали зміни в популяціях ILC3 після введення мишам вакцини на основі DC. У цьому документі спостерігався зв’язок між вакциною на основі DC та ILC3s, що було показано через тривалий вплив вакцини на відповіді ILC3 протягом принаймні 10 днів після імунізації.

cistanche tubulosa - покращує імунну систему

2. Результати

2.1. Кількість як NCR+, так і NCR− ILC3s збільшена в локальному дренуючому лімфатичному вузлі після введення DC вакцин 

Вакцину DC готували диференціюванням DC з клітин кісткового мозку миші ex vivo. Ці DC стимулювали для сприяння їхньому дозріванню, щоб вони набули імуногенного фенотипу. Потім DC були завантажені пептидом. Оскільки це дослідження зосереджено на природі зв’язку між двома вродженими лейкоцитами, DC та ILC3, пептид, вибраний для виробництва вакцини, навмисно не мав відношення до нашої біологічної моделі, щоб уникнути того, щоб антиген-специфічні Т-клітини стали змінною, що змішує. Таким чином, вакцина DC була завантажена пептидом, отриманим з курячого альбуміну.

Щоб почати досліджувати, чи впливає вакцинація DC на популяції ILC3, ми спочатку оцінили, чи існують відмінності в клітинності проксимально до місця вакцинації. Після вакцинації DC відбулися зміни в місцевому дренуючому лімфатичному вузлі, які включали збільшення кількості ILC3 (рис. 1). Кінетика збільшення ILC3s показала, що ILC3s поступово збільшувалися після вакцинації DC (рис. 1b,c). Було оцінено кількість NCR+ і NCR− ILC3 у локальному дренажному лімфатичному вузлі, і обидві субпопуляції зросли після введення вакцини DC. Незважаючи на те, що популяції NCR+ і NCR− ILC3 досягли піку через три дні після вакцинації DC, NCR− ILC3 повернулися до гомеостатичної кількості через сім днів після імунізації, тоді як кількість NCR+ ILC3 залишалася значно вищою порівняно з контрольними мишами, які отримували фіктивне лікування.

Рисунок 1. Кількість природних рецепторів цитотоксичності (NCR)+ і NCR− типу 3 вроджених лімфоїдних клітин (ILC3s) зросла в локальному дренуючому лімфатичному вузлі після імунізації DC. Самкам мишей C57BL/6 вводили DC-вакцини за допомогою ін’єкцій задніх лапок. Підколінні лімфатичні вузли були досліджені для популяції ILC3. (а) Визначено загальну кількість клітин у лімфатичному вузлі. Накопичення (b) NCR− ILC3 та (c) NCR+ ILC3 у лімфатичному вузлі та відсоток клітин CD{{10}} у лімфатичному вузлі, які були (d) NCR− ILC3 та (e) NCR+ ILC3s. Кожен стовпчик представляє дані з чотирьох підколінних лімфатичних вузлів. Т-критерій Стьюдента використовувався в кожній точці часу для визначення суттєвих відмінностей між контрольними мишами, яким було щеплено фосфатно-сольовий буфер (PBS), і мишами, яким вакцинували DC вакцину (p-значення * < 0.{{ 21}}5, ** < 0.005, *** < 0,0005 і **** < 0,0001). Репрезентативні точкові графіки, що показують середню кількість (f) NCR− ILC3s та (g) NCR+ ILC3s у дренажному підколінному лімфатичному вузлі. На графіках показано середнє значення зі стандартним відхиленням.

2.2. Вакцини DC збільшують виробництво цитокінів ILC3 у селезінці без зміни загальної кількості селезінкових ILC3

Далі системні зміни в популяціях ILC3 досліджували шляхом оцінки селезінки, яка є найбільшим вторинним лімфоїдним органом [29], через тиждень після вакцинації DC, що є стандартним часом нашої лабораторії для системної оцінки змін у лейкоцитах. Не спостерігалося істотної різниці в загальній кількості NCR+ або NCR- ILC3 в селезінці (рис. 2).

Малюнок 2. Не було змін у кількості ILC3 селезінки після імунізації DC. Самкам мишей C57BL/6 (n=8 [PBS] або 10 [DC]) вводили вакцини DC за допомогою ін’єкцій у задню лапку. Селезінки збирали через тиждень після інокуляції та досліджували на популяції ILC3. Загальна кількість (a) NCR− ILC3s та (b) NCR+ ILC3s (і середньогеометрична інтенсивність флуоресценції T-bet для NCR+ ILC3s) і відсоток селезінкових CD45+ клітин, які були (c) NCR− ILC3 та (d) NCR+ ILC3 контролювали та кількісно оцінювали за допомогою проточної цитометрії. Т-критерій Стьюдента використовувався для визначення значущості між популяціями контрольних мишей, інокульованих фосфатно-сольовим буфером (PBS), і мишей, інокульованих DC. Засоби істотно не відрізнялися. Репрезентативні точкові графіки, що показують середню кількість селезінкових (e) NCR− ILC3 та NCR+ ILC3. Стандартне відхилення та середнє значення представлені стовпчиками графіка та стовпчиками помилок.

Оскільки на профілі цитокінів ILC3 можуть впливати фактори навколишнього середовища, виробництво ILC3 IL-22 та IL-17 у селезінці вимірювали через тиждень після вакцинації DC. Спостерігалося збільшення ILC3s, що продукує IL-17 або IL-22 або обидва цитокіни у мишей, які отримували вакцини DC, порівняно з контрольними мишами (рис. 3).

Рисунок 3. Спостерігалося збільшення селезінкових ILC3, що продукують IL-17 та IL-22 після імунізації DC. Самки мишей C57BL/6 (n=12–18) були щеплені DC-вакцинами шляхом ін’єкції задньої лапки. Контрольних мишей лікували забуференим фосфатом фізіологічним розчином (PBS). Через тиждень після імунізації селезінки збирали та досліджували на IL-17- та IL{{10}}, що продукують ILC. Кількість клітин лінії-CD127+DX5−, що продукують (а) IL-17, (б) IL-22 та (в) як IL-17, так і IL{{ 16}} та їхні відповідні середні геометричні інтенсивності флуоресценції визначали за допомогою фарбування внутрішньоклітинних цитокінів і проточної цитометрії. Дані аналізували за допомогою двостороннього тесту ANOVA (p-значення * < 0.05, ** < 0.005). (d) Репрезентативні точкові графіки показують середню кількість селезінкових CD45+ лінії CD127+DX5- клітин, що продукують IL-17 та/або IL-22. На графіках показано середнє значення зі стандартним відхиленням.

2.3. Субпопуляції ILC3 після імунізації DC та зараження клітинами меланоми B16F10

ILC3 можуть відігравати подвійну роль у прогресуванні раку, сприяючи як про-, так і протипухлинним відповідям [22]. Таким чином, було досліджено вплив вакцинації DC на відповіді ILC3 у контексті раку. Мишей лікували DC-вакцинами, а через тиждень їм внутрішньовенно вводили клітини меланоми B16F10, що призвело до засівання легенів. Як уже згадувалося, оскільки оцінювалися лише компоненти вродженого імунітету, антигенспецифічне утворення вакциною не оцінювалося в наших експериментах, і, отже, використана модель меланоми не експресувала овальбумін, через що пептид завантажувався на DC. не має значення. Кінетичний експеримент (рис. 1) продемонстрував, що локальні реакції ILC3 можна спостерігати протягом трьох днів. Таким чином, через три дні після зараження кількість субпопуляцій ILC3 та їхню здатність продукувати цитокіни досліджували в селезінці та легенях. Подібно до того, що спостерігалося в селезінках наївних мишей, не було значної різниці в загальній кількості NCR+ і NCR- ILC3 селезінки між контрольною групою та групою, імунізованою DC (рис. 4). Однак, на відміну від наївної моделі, у селезінці більше не було змін у виробленні IL-17 та/або IL-22 (рис. 5).

Рисунок 4. Не було жодних змін у загальній кількості селезінкових ILC3 після вакцинації DC та зараження клітинами меланоми B16F10. Самкам мишей C57BL/6 (n=10) вводили DC-вакцини за допомогою ін’єкції задньої лапки, а через тиждень мишам вводили 3 × 105 клітин B16F10 шляхом ін’єкції в хвостову вену. Селезінки збирали та досліджували на накопичення популяцій ILC3 через три дні після введення B16F10. Кількість селезінкових (a) NCR− ILC3s та (b) NCR+ ILC3s (та середня геометрична інтенсивність флуоресценції T-bet для NCR+ ILC3s) і відсоток селезінкових CD45+ клітин, які були (c) NCR− ILC3 та (d) NCR+ ILC3 контролювали та кількісно визначали за допомогою проточної цитометрії. Т-критерій Стьюдента використовувався для визначення значущості між популяціями контрольних мишей, які отримували фізіологічний розчин із фосфатним буфером (PBS), і мишей, інокулованих DC. Засоби істотно не відрізнялися. Репрезентативні точкові графіки показують середню кількість селезінкових (e) NCR− ILC3 та NCR+ ILC3. Середнє значення та стандартне відхилення представлені гістограмами та стовпчиками помилок.

Малюнок 5. Не було змін у кількості селезінкових IL-17 та/або IL-22-, що продукують ILC після вакцинації DC та зараження клітинами меланоми B16F10. Самкам мишей C57BL/6 (n=10) вводили DC-вакцини за допомогою ін’єкції задньої лапки, а через тиждень внутрішньовенно вводили 3 × 105 клітин B16F10. Через три дні селезінки збирали та досліджували на продукцію цитокінів ILC3. Кількість лінійних клітин CD127+DX5-, що продукують (a) IL-17, (b) IL-22 і (c) як IL-17, так і IL-22 та їх відповідні середні геометричні інтенсивності флуоресценції визначали за допомогою фарбування внутрішньоклітинних цитокінів і проточної цитометрії. Дані аналізували за допомогою двостороннього тесту ANOVA, і не було виявлено істотної різниці між мишами, вакцинованими DC, і контрольними мишами, обробленими фосфатним буферним розчином (PBS). (d) Репрезентативні точкові графіки показують середню кількість клітин CD45+лінії CD127+DX5- селезінки, що продукують IL-17 та/або IL-22.

Внутрішньовенне введення клітин B16F10 через хвостову вену є звичайною мишачою моделлю синтетичних метастазів меланоми в легені [30]. Тому легені також досліджували, щоб визначити кількість субпопуляцій ILC3 і оцінити продукцію ними цитокінів.

Спостерігалося зменшення кількості NCR− ILC3 із супутнім збільшенням кількості NCR+ ILC3 (рис. 6). Однак не спостерігалося жодного ефекту вакцинації DC на опосередковане ILC{4}}утворення цитокінів у легенях (рис. 7).

Рисунок 6. Після імунізації DC та зараження клітинами B16F10 спостерігалися чисельні зміни субпопуляцій ILC3 у легенях. Самки мишей C57BL/6 (n=10) отримали вакцини DC шляхом ін’єкції задньої лапки, а через тиждень 3 × 105 клітин B16F10 вводили внутрішньовенно. Через три дні після зараження легені досліджували за допомогою проточної цитометрії для визначення кількості (a) NCR− ILC3 та (b) NCR+ ILC3 (а також середньогеометричної інтенсивності флуоресценції T-bet для NCR+ ILC3) і відсотка CD{ {18}} клітини, які були (c) NCR− ILC3s та (d) NCR+ ILC3s. Т-критерій Стьюдента використовувався для визначення значущості між субпопуляціями контрольних мишей, які отримували фізіологічний розчин із фосфатним буфером (PBS), і мишей, інокулованих DC (p-значення *<0.05, *** <0.0005, and **** < 0.0001). Representative dot plots showing the average number of pulmonary (e) NCR− ILC3s and NCR+ ILC3s. The graphs display the mean with the standard deviation.

Малюнок 7.Не було змін у кількості ILC3s, що продукують IL-17 та/або IL-22 у легенях після вакцинації DC та зараження клітинами меланоми B16F10. Самкам мишей C57BL/6 (n=10) були щеплені вакцини DC за допомогою ін’єкції задньої лапки, а через тиждень їм внутрішньовенно ввели 3 × 105 клітин B16F10. Через три дні легені були зібрані та досліджені на ILC3-опосередковане виробництво цитокінів. Кількість лінійних клітин CD127+DX5−, що продукують (a) IL-17, (b) IL-22 і (c) як IL{{0}}, так і IL-22 та їх відповідні середні геометричні інтенсивності флуоресценції визначали за допомогою фарбування внутрішньоклітинних цитокінів і проточної цитометрії. Дані аналізували за допомогою двостороннього тесту ANOVA (p-значення *** <0,0005). Не було значної різниці в загальній кількості IL-22-продукуючих, IL-17-продукуючих, IL-22 та IL-17 ліній, що продукують мультицитокіни-CD{{ 12}}DX5− комірок. (d) Репрезентативні точкові графіки, що показують середню кількість легеневих клітин CD45+ лінії CD127+DX5−, що продукують IL-17 та/або IL-22. Стандартне відхилення та середнє значення представлені стовпчиками графіка та стовпчиками помилок.

3. Обговорення

Дослідження, описані тут, мали на меті дослідити потенційний зв’язок між ILC3 та DC у контексті вакцини DC. Спостерігалося збільшення кількості як NCR+, так і NCR− субпопуляцій ILC3 у дренуючих лімфатичних вузлах (рис. 1) після вакцинації DC, що вказувало на наявність локального зв’язку між субпопуляціями вакцини DC та ILC3. Однак зв’язок між DC та NCR+ ILC3 мав більш тривалий вплив на загальну кількість NCR+ ILC3, ніж той, що спостерігався між DC та NCR− ILC3. Це вказує на те, що DC можуть мати унікальні взаємодії з ILC3 залежно від їх експресії NCR. Не спостерігалося жодних змін у кількості субпопуляцій ILC3 у селезінках через сім днів після вакцинації DC (Малюнок 2) або через десять днів після вакцинації DC та через три дні після зараження клітинами меланоми B16F10 (Малюнок 4). Наші методи аналізу виробництва IL-17 та IL-22 ILC3 мають обмеження, оскільки вони показують як трансляційну, так і транскрипційну відповіді внаслідок рестимуляції клітин in vitro. Однак ми додали експериментальний контроль у всіх експериментах, який буде лікуванням без стимуляції in vitro, щоб виявити, що виробляють ILC3 у відповідь на сигнал, отриманий in vivo. Як показано на малюнках 3d, 5d і 7d, клітини, які не отримували стимуляції in vitro, виробляли IL-17 та IL-22. Крім того, хоча кількість клітин ILC3 селезінки не змінилася (Малюнок 2), продукція цитокінів субпопуляціями ILC3 була іншою через сім днів після вакцинації DC (Малюнок 3). Це свідчить про те, що вакцинація DC може вплинути на функціональність відповідей ILC3, не впливаючи на них чисельно. Будучи компонентами вродженої імунної системи, торгівля ILC3s у тканини та з них могла відбутися протягом кількох днів, таким чином запобігаючи виявленню модульованих лікуванням чисельних відмінностей через сім-десять днів після вакцинації DC. Докази цього спостерігалися в лімфатичному вузлі, що дренує DC-вакцину, де кількість ILC3 збільшувалася протягом трьох днів, а потім почала зменшуватися (рис. 1). Таким чином, могли відбутися чисельні зміни субпопуляцій ILC3 в селезінці, які були пропущені, оскільки вони повернулися до гомеостатичних чисел на сьомий день після імунізації DC. Тим не менш, дослідження були зосереджені на довготривалих реакціях на відміну від короткочасних тимчасових реакцій і, отже, не досліджували цей шлях далі. Цікаво, що хоча кількість субпопуляцій ILC3 селезінки не відрізнялася від контрольних груп, їхні цитокінові профілі були змінені (рис. 3). Виробництво IL-22 та IL-17 було збільшено в ILC3 селезінки, таким чином демонструючи, що вакцинація DC мала системний вплив на ILC3s. Таким чином, вакцинація DC не вплинула на кількість ILC3 селезінки, але вплинула на їхню функціональність.

Незважаючи на те, що через сім днів після імунізації DC у селезінках мишей без пухлин спостерігався тривалий вплив на виробництво цитокінів, отриманих із ILC3-, цей вплив на ILC3 у селезінці не було виявлено через три дні після внутрішньовенного введення клітин меланоми B16F10 ( малюнок 5). Вакцина DC, як виявилося, ініціювала популяції ILC3 у моделі без пухлини, яка була придушена після зараження пухлиною. Оскільки на ILC сильно впливає навколишнє середовище, це може свідчити про те, що зв’язок між DC у вакцині та ILC3 був обмежений моделлю без пухлини. І навпаки, це також може бути пов’язано з мобілізацією праймованих ILC3 в інших місцях тіла, де B16F10 могли накопичуватися та створювати мікрооточення, яке індукує рекрутинг лейкоцитів.

Спостерігався зсув у субпопуляціях ILC3, що спостерігався в легенях через десять днів після вакцинації DC і через три дні після зараження клітинами B16F10 порівняно з невакцинованими контрольними мишами, яким вводили лише клітини B16F10. Зокрема, спостерігалося збільшення кількості NCR+ ILC3s і зменшення NCR− ILC3s у легенях (рис. 6). T-bet є фактором транскрипції, який асоціюється з відповідями Th1 [31]. Таким чином, збільшення NCR+ ILC3s, які експресують T-bet, вказує на потенційне сприяння розвитку імунітету 1 типу. Це може бути корисною відповіддю ILC3 у контексті раку, де зазвичай бажані імунні відповіді типу 1.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Було показано, що NCR+ ILC3 можуть походити від підмножини NCR− ILC3 [16]. Таким чином, збільшення NCR+ ILC3s і зниження NCR-ILC3s можна віднести до стимуляції, яка викликала перемикання NCR-ILC3s на NCR+ ILC3s. Якщо ILC3 проходили перемикання фенотипу з NCR− на NCR+, вони, можливо, не змогли виробляти цитокіни під час або незабаром після перемикання та під час пристосування до оточення та свого нового фенотипу. Таким чином, їхнє вироблення цитокінів могло бути припинено або затримано під час перемикання фенотипу, що могло пояснити, чому не було змін у ILC3-опосередкованому продукуванні IL-17 та/або IL-22 у легені (рис. 7). Однак також можливо, що вакцинація DC просто не вплинула на продукцію цитокінів ILC3s у легенях у цей момент часу.

4. Матеріали та методи

Етичне схвалення

Усі дослідження на мишах проводилися відповідно до протоколу використання тварин №3807 під наглядом персоналу з догляду за тваринами в Університеті Гвельфа.

миші

Самки мишей C57BL6 були отримані від Charles River Laboratories у віці від п'яти до восьми тижнів. Мишей містили в контрольованому середовищі в відділенні ізоляції тварин Університету Гвельфа і дали один тиждень для акліматизації перед початком експериментів. Мишей годували і давали воду ad libitum.

Культури дендритних клітин

Стегнові та гомілкові кістки самок мишей C57BL6 збирали, а кінці кісток відрізали. Використовуючи шприц, кістковий мозок гомілок і стегнових кісток вимивали PBS у чашку Петрі. Кістковий мозок ресуспендували в одноклітинну суспензію та підраховували за допомогою гемоцитометра. Потім клітини ресуспендували в середовищі (RPMI [HyClone Cat# SH30027.01] з 2-меркаптоетанолом [Gibco Ref# 21985-023], 1% пеніциліну/стрептоміцину [HyClone Cat# SV30010] та 10% фетальну бичачу сироватку [VWR Cat#97068-085]) до концентрації 1,25 × 106 клітин на мл, доповнену 20 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора (GM-CSF) (Biolegend Cat#576308) і аликвотують у культуральні колби об’ємом 25 см2 по 5 мл на колбу. Культури поміщали у зволожені інкубатори при 37 ◦C з 5% CO2 і залишали рости протягом 7 днів. На другий день культивування додавали 5 мл свіжого середовища з 20 нг/мл GM-CSF. На п'ятий день 5 мл кожної культури центрифугували, а супернатант видаляли. Клітини ресуспендували в 5 мл свіжого середовища з 20 нг/мл GM-CSF і повторно додавали до культуральних колб. Культури збирали на 7 день і готували для вакцинації.

Приготування вакцини дендритних клітин

Культури дендритних клітин (ДК) переносили в конічну пробірку на 50 мл і підраховували за допомогою гемоцитометра. Клітини стимулювали 100 нг/мл ліпополісахариду (LPS) з Escherichia coli O55:B5 (Sigma Cat#L2880) і 1 мкг/мл курячого овальбуміну (OVA) 257–264 (SIIN) (PepScan Systems, Lelystad, Нідерланди) протягом 1 год в інкубаторі при 37 ◦C з 5% CO2. Потім клітини тричі промивали PBS і ресуспендували до концентрації 5 × 105 клітин на 30 мкл. Вакцини вводили в дозах 5 × 105 клітин на 30 мкл PBS.

Обробка тканин

Лімфатичні вузли та селезінки збирали та поміщали в чашки Петрі з 2 мл забуференого сольового розчину Хенкса (HBSS). Їх пресували в одноклітинні суспензії за допомогою задньої сторони пробки шприца на 3 мл. Одноклітинні суспензії фільтрували в конічну пробірку на 50 мл за допомогою клітинного фільтра з порами 70 мкм. Лімфовузли підраховували за допомогою гемоцитометра. Селезінки центрифугували, супернатант видаляли, а клітини ресуспендували в буфері для лізису ACK (8,29 г NH4Cl [0,15 М], 1 г KHCO3 [10,0 мМ], 37,2 мг Na2EDTA [0,1 мМ] у 1 мл води Milli Q) і залишити на п’ять хвилин для лізису еритроцитів. Клітини двічі промивали HBSS перед ресуспендуванням у середовищі та підраховували за допомогою гемоцитометра.

Легені збирали та зважували перед тим, як помістити в пробірку gentleMACSTM, що містить 1 мг/мл колагенази IV (Gibco Ref#17104-019) і 5 мкг/мл ДНКази I (Roche Ref#11284932001) у HBSS. Використовуючи дисоціатор gentleMACSTM, зразки пропускали через легеневий протокол А, а потім інкубували протягом 20 хвилин в інкубаторі при 37 ◦C з 5% CO2. Потім зразки пройшли через легеневий протокол B на дисоціаторі gentleMACSTM. Для нейтралізації реакції ферменту до зразків додавали подвійний об’єм HBSS. Зразки фільтрували в конічну пробірку на 50 мл через фільтр для клітин з порами 70 мкм. Потім клітини двічі промивали HBSS і ресуспендували в буфері для лізису ACK. Через п'ять хвилин у буфері для лізису ACK клітини двічі промивали HBSS і ресуспендували в середовищі.

Аналіз цитокінової реакції

Одноклітинні суспензії із зразків тканини висівали в 96-планшети з лунками в двох примірниках, де одну лунку обробляли як контроль без стимуляції, а іншу лунку обробляли стимулятором. У нестимульовані лунки вводили лише середовище, а в лунки, оброблені стимулятором, вводили 10 нг/мл форболміристат ацетату (PMA) і 1500 нг/мл іономіцину в середовищі. Клітини поміщали в інкубатор при 37 ◦C з 5% CO2 на одну годину. Потім Brefeldin A (GolgiPlug, Biolegend Cat#420601) (×100 розведення) додавали до всіх лунок зразків, і планшет знову поміщали в інкубатор ще на чотири години. Потім клітини двічі промивали PBS і фарбували для аналізу за допомогою проточної цитометрії.

Клітини меланоми B16F10

Клітини B16F10 відтавали від рідкого азоту та підраховували за допомогою гемоцитометра. Потім клітини ресуспендували в середовищі (середовище Ігла, модифіковане Dulbecco з високим вмістом глюкози [HyClone Cat#SH3002201] з 1% пеніциліну/стрептоміцину [HyClone Cat# SV30010] і 10% бичачої сироватки [VWR Cat#10158-358]), щоб концентрація 1 × 105 клітин на мл. Потім клітини B16F10 розподіляли в культуральні колби і поміщали в інкубатор при 37 ◦C з 5% CO2. Щоб підготувати клітини B16F10 до введення, клітини переносили з культуральних колб у конічну пробірку на 50 мл, промивали PBS, а потім ресуспендували в PBS. Клітини підраховували за допомогою гемоцитометра та ресуспендували в PBS, щоб отримати дози 3 × 105 клітин на 200 мкл.

Фарбування внутрішньоклітинних цитокінових антитіл

Клітини висівали в {{0}}лункові планшети та ресуспендували в Fc-блоці (анти-CD16/CD32, BioLegend Cat #101320) та інкубували при 4 ◦C протягом 15 хвилин. Клітини двічі промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином, що містить 0,5% бичачого сироваткового альбуміну (буфер FACS), потім повторно суспендували в основній суміші антитіл, що фарбують клітинну поверхню (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46, BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat #108919; CD127, BioLegend Cat #135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat #133311) та інкубували при 4 градусах протягом 20 хвилин. Клітини двічі промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином і ресуспендували в барвнику Zombie Aqua Fixable viability dye (FVD) (BioLegend Cat#423101) та інкубували при 4 ◦C протягом 30 хвилин. Забуферений фосфатом фізіологічний розчин використовували для двічі промивання клітин перед ресуспендуванням у буфері для фіксації (BioLegend Cat#420801). Клітини інкубували при 4 ◦C протягом 20 хв. Після фіксації клітини двічі промивали буфером для пермеабілізації (BioLegend Cat#421002). Клітини ресуспендували в основній суміші антитіл із внутрішньоклітинним фарбуванням (IL-22, BioLegend Cat#516404; IL-17A, eBioscience Cat# 17-7177-81) та інкубували при 4 ◦C протягом 20 хв. Клітини двічі промивали буфером для пермеабілізації, потім ресуспендували в буфері FACs, а потім обробляли за допомогою проточного цитометра BD FACSCantoTM II і аналізували за допомогою програмного забезпечення BD FACSDivaTM.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

Фарбування антитіл до факторів транскрипції

Клітини висівали в {{0}}лункові планшети та ресуспендували в блоку FC (анти-CD16/CD32 BioLegend Cat# 101320) та інкубували при 4 ◦C протягом 15 хвилин. Клітини двічі промивали буфером FACs (0,5% у бичачому сироватковому альбуміні [HyClone Cat# SH30574.02] у PBS), потім ресуспендували в основній суміші антитіл, що фарбують клітинну поверхню (CD45, BioLegend Cat#103132; NKp46). , BioLegend Cat#137617; DX5, BioLegend Cat#108919; CD127, BioLegend Cat#135007; Lineage Cocktail, BioLegend Cat#133311), та інкубували при 4 ◦C протягом 20 хв. Потім клітини промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином, двічі ресуспендованим у FVD (BioLegend Cat#423101) та інкубували при 4 ◦C протягом 20 хвилин. Клітини двічі промивали фосфатним буферним розчином і ресуспендували в мишачому буфері для фіксації FoxP3 (BD ​​Pharmingen BD Sciences Cat#51-9006124) та інкубували при 4 ◦C протягом 30 хвилин. Після фіксації клітини промивали мишачим буфером для пермеабілізації FoxP3 (BD ​​Pharmingen BD Sciences Cat # 51-9006125), ресуспендованим у буфері для пермеабілізації FoxP3, та інкубували при 37 ◦C протягом 30 хв. Клітини ресуспендували в антитілах до фактора транскрипції (ROR gamma(t), eBioscience Cat#17-6988-82; T-bet, eBioscience Cat# 12-5825-82) та інкубували при 4 ◦C протягом 20 хвилин. Клітини двічі промивали буфером для пермеабілізації, потім ресуспендували в буфері FACs і аналізували за допомогою проточного цитометра BD FACSCantoTM II і програмного забезпечення BD FACSDivaTM.

Статистичний аналіз

Селезінкові та легеневі популяції NCR+ та NCR− ILC3 аналізували за допомогою непарних t-тестів. Аналіз сукупності кінетичного експерименту порівнювали за допомогою звичайного одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) і тесту множинного порівняння Тьюкі. Аналіз цитокінів у селезінці та легенях досліджували за допомогою двостороннього дисперсійного аналізу та тесту множинних порівнянь Шидака. Середні значення для груп лікування були визначені як суттєво різні зі значенням p < 0.05.

Стратегія стробування

Спочатку, використовуючи зону прямого розсіювання (FSC-A) і область бічного розсіювання (SSC-A), лімфоцити були закриті. Потім дублетні клітини виключали за допомогою FSC-A та FSC-висоти (FSC-H). Живі клітини вводили, беручи клітини, негативні щодо FVD. Потім CD127+ і клітини-коктейлі лінії були взяті, щоб звузити ILC. Потім клітини CD45+ були закриті. Щоб переконатися, що всі NK-клітини були виключені, DX5− був включений. Для ідентифікації факторів транскрипції ILC3 клітини ROR t + були потім відкриті, і з цих клітин NCR+ ILC3 були T-bet+ і NKp46+, а NCR− ILC3 були T-bet− і NKp46. Для ідентифікації цитокінів після стробування лімфоцитів, окремих клітин, живих клітин і лінії CD127+–CD45+, IL-17 та IL-22 потім було застосовано строб як виробляється ILC3s, оскільки ILC3s були б єдиними клітинами в цих останніх воротах, які могли б виробляти IL-22 та IL-17.

Цистанче корисний для чоловіків - зміцнює імунну систему

5. Висновки

Незважаючи на те, що підвищена продукція IL-17 та IL-22 у селезінці, що спостерігалася в моделі без пухлини, була втрачена в моделі зараження пухлиною, спостерігався протилежний зсув у NCR+ і Популяції NCR− ILC3 у легенях. Це свідчить про те, що вакцинація DC могла вплинути на ILC3 у моделі зараження пухлиною, а також у мишей без пухлини. Однак вплив цього зв’язку між DC у вакцині та ILC3 на протипухлинні відповіді залишається невідомим і є напрямком майбутніх досліджень. Таким чином, дослідження, описані тут, демонструють наявність зв’язку між вакцинами на основі DC і субпопуляціями ILC3, як у мишей без пухлин, так і у мишей із пухлиною. Ці комунікації та їхній подальший вплив на імунні відповіді видаються складними. Ці спостереження зробили внесок у літературу, яка намагається розшифрувати взаємозв’язок між вакцинами DC та ILC3 у спробі розробити покращені стратегії вакцинації DC. Ми рекомендуємо подальші дослідження з вивчення потенціалу розробки стратегій вакцинації, які можуть модулювати ці комунікації для оптимізації відповідей ILC3 для сприяння протипухлинним відповідям і обмеження підтримки пропухлинних відповідей.

Список літератури

1. Кріньє, А.; Вів'є, Е.; Bléry, M. Хелпер-подібні вроджені лімфоїдні клітини та імунотерапія раку. Сьомін. Immunol. 2019, 41, 101274. [CrossRef] [PubMed]

2. Салімі, М.; Ван, Р.; Яо, X.; Лі, X.; Ван, X.; Ху, Ю.; Чанг, X.; Фан, П.; Донг, Т.; Ogg, G. Активовані вроджені популяції лімфоїдних клітин накопичуються в пухлинних тканинах людини. BMC Cancer 2018, 18, 341. [CrossRef] [PubMed]

3. Спітс, Х.; Бернінк, Дж. Х.; Lanier, L. NK-клітини та вроджені лімфоїдні клітини типу 1: партнери в захисті господаря. Нац. Immunol. 2016, 17, 758–764. [CrossRef] [PubMed]

4. Брухард, М.; Ghiringhelli, F. Розшифровка ролі вроджених лімфоїдних клітин у раку. Фронт. Immunol. 2019, 10, 656. [CrossRef]

5. Маззурана, Л.; Рао, А.; Ван Акер, А.; Mjösberg, J. Роль вроджених лімфоїдних клітин в імунній системі людини. Сьомін. Імунопатолог. 2018, 40, 407–419. [CrossRef]

6. Solano-Gálvez, SG; Товар-Торрес, С.М.; Трон-Гомес, MS; Weiser-Smeke, AE; Álvarez-Hernández, DA; Франюті-Келлі, Джорджія; Тапіа-Морено, М.; Ібарра, А.; Гутьєррес-Кобе, Л.; Васкес-Лопес, Р. Дендритні клітини людини: онтогенез та їх підгрупи в здоров'ї та хворобах. Мед. Sci. 2018, 6, 88. [CrossRef]

7. Штейнман, Р.М.; Хеммі, Х. Дендритні клітини: перетворення вродженого імунітету на адаптивний. Curr. Топ. мікробіол. Immunol. 2006, 311, 17–58. [CrossRef]

8. Фу, Ч.; Ма, Т.; Чжоу, Л.; Mi, QS; Цзян, А. Вакцини проти раку на основі дендритних клітин: виклики, досягнення та майбутні можливості. Immunol. Розслідувати. 2022, 51, 2133–2158. [CrossRef]

9. Карімі, К.; Boudreau, JE; Фрейзер, К.; Лю, Х.; Delanghe, J.; Голді, Дж.; Сін, З.; Брамсон, JL; Wan, Y. Посилений протипухлинний імунітет, викликаний дендритними клітинними вакцинами, є результатом їхньої здатності залучати NK-клітини, що виробляють CTL та IFN. мол. Тер. 2008, 16, 411–418. [CrossRef]

10. Бауер, А.Л.; Saunderson, SC; Колдуелл, Ф. Дж.; Дамані, Т.Т.; Pelham, SJ; Данн, AC; Джек, RW; Штойцнер, П.; McLellan, AD NK-клітини необхідні для імунотерапії на основі дендритних клітин під час зараження пухлиною. J. Immunol. 2014, 192, 2514–2521. [CrossRef]

11. Пампена, MB; Леві, Е. М. Природні клітини-кілери як клітини-помічники у вакцинах проти раку дендритних клітин. Фронт. Immunol. 2015, 6, 13. [CrossRef] [PubMed]

12. Гарднер, А.; де Мінго Пулідо, А.; Ruffell, B. Дендритні клітини та їх роль в імунотерапії. Фронт. Immunol. 2020, 11, 924. [CrossRef] [PubMed]

13. Кортез В.С.; Робінетт, М. Л.; Колонна, М. Вроджені лімфоїдні клітини: нове уявлення про функцію та розвиток. Curr. Опін. Immunol. 2015, 32, 71–77. [CrossRef] [PubMed]

14. Монтальдо, Е.; Juelke, K.; Романьяні, К. Вроджені лімфоїдні клітини групи 3 (ILC3s): походження, диференціювання та пластичність у людей і мишей. Євро. J. Immunol. 2015, 45, 2171–2182. [CrossRef]

15. Вакка, П.; Chiossone, L.; Мінгарі, MC; Моретта, Л. Гетерогенність NK-клітин та інших вроджених лімфоїдних клітин у децидуальних оболонках людини та миші. Фронт. Immunol. 2019, 10, 170. [CrossRef] [PubMed]

16. Ранкін, LC; Girard-Madoux, MJ; Seillet, C.; Мільке, Л.А.; Керділес, Ю.; Феніс, А.; Відуайлд, Е.; Путоцький, Т.; Мондо, С.; Ланц, О.; та ін. Комплементарність і надмірність вроджених лімфоїдних клітин, що продукують IL-22-. Нац. Immunol. 2016, 17, 179–186. [CrossRef] [PubMed]

17. Хоорвег, К.; Пітерс, CP; Корнеліссен, Ф.; Апарісіо-Домінго, П.; Папазян Н.; Каземір, Г.; Mjösberg, JM; Спітс, Х.; Купедо, Т. Функціональні відмінності між вродженими лімфоїдними клітинами NKp44(-) і NKp44(+) RORC(+). Фронт. Immunol. 2012, 3, 72. [CrossRef]

18. Каррега, П.; Лояконо, Ф.; Ді Карло, Е.; Скарамучча, А.; Мора, М.; Конте, Р.; Бенеллі, Р.; Spaggiari, GM; Кантоні, К.; Кампана, С.; та ін. NCR(+)ILC3 зосереджується на раку легенів людини та пов’язаний з внутрішньопухлинними лімфоїдними структурами. Нац. Комун. 2015, 6, 8280. [CrossRef]

19. Спітс, Х.; Артіс, Д.; Колонна, М.; Діфенбах, А.; Ді Санто, Японія; Еберл, Г.; Коясу, С.; Локслі, Р.М.; Маккензі, А.Н.; Мебіус, RE; та ін. Вроджені лімфоїдні клітини – пропозиція щодо єдиної номенклатури. Нац. Rev. Immunol. 2013, 13, 145–149. [CrossRef]

20. Наречена, Р.; Фінлей, CM; Вілліс, К.; Бевінгтон, SL; Солей, Дж.; Ng, STH; Бейкер, С.М.; Ендрюс, С.; Хепворт, М.Р.; Withers, DR Мережі реципрокних транскрипційних факторів керують функцією та ідентичністю субмножини ILC3, резидентної в тканинах. Нац. Immunol. 2021, 22, 1245–1255. [CrossRef]

21. ван Бік, JJP; Мартенс, AWJ; Бакдаш, Г.; de Vries, IJM Вроджені лімфоїдні клітини в пухлинному імунітеті. Biomedicines 2016, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

22. Маттнер, Дж.; Вірц С. Друг чи ворог? Неоднозначна роль вроджених лімфоїдних клітин у розвитку раку. Trends Immunol. 2017, 38, 29–38. [CrossRef]

23. Кірхбергер С.; Ройстон, діджей; Булард, О.; Торнтон, Е.; Франкіні, Ф.; Szabady, RL; Гаррісон, О.; Powrie, F. Вроджені лімфоїдні клітини підтримують рак товстої кишки через вироблення інтерлейкіну-22 на моделі миші. J. Exp. Мед. 2013, 210, 917–931. [CrossRef] [PubMed]

24. Іршад, С.; Флорес-Борха, Ф.; Лоулер, К.; Моніпенні, Дж.; Еванс, Р.; Мале, В.; Гордон, П.; Чунг, А.; Газінська, П.; Нур, Ф.; та ін. Вроджені лімфоїдні клітини RORgammat(+) сприяють метастазам раку молочної залози в лімфатичних вузлах. Cancer Res. 2017, 77, 1083–1096. [CrossRef] [PubMed]

25. Гок, Дж.; Лв, М.; Бессман, Нью-Джерсі; Фламар, А.Л.; Сахота, С.; Сузукі, Х.; Тенг, Ф.; Пуцель Г.Г.; Еберл, Г.; Withers, DR; та ін. Порушення регуляції ILC3s сприяє прогресуванню та стійкості до імунотерапії раку товстої кишки. Cell 2021, 184, 5015–5030.e16. [CrossRef]

26. Лю, Ю.; Пісня, Ю.; Лін, Д.; Лей, Л.; Мей, Ю.; Джин, З.; Гонг, Х.; Чжу, Ю.; Ху, Б.; Чжан, Ю.; та ін. NCR(-) Вроджені лімфоїдні клітини групи 3 оркеструють вісь IL-23/IL-17 для сприяння розвитку гепатоцелюлярної карциноми. EBioMedicine 2019, 41, 333–344. [CrossRef] [PubMed]

27. Брухард, М.; Гейндро, М.; Перріше, А.; Truntzer, C.; Баллот Е.; Бойдо, Р.; Racoeur, C.; Барсак, Е.; Чалмін, Ф.; Hibos, C.; та ін. Залучення та активація вроджених лімфоїдних клітин типу 3 сприяють протипухлинним імунним відповідям. Нац. Immunol. 2022, 23, 262–274. [CrossRef]

28. Рехакер, Л.; Хлопчик, М.; Бісьо, В.; Руссен, Ф.; Денізо, Ж.; Вінсент-Саломон, А.; Боркоман, Е.; Седлік, К.; Piaggio, E.; Тубер, А.; та ін. Вроджені лімфоїдні клітини: підмножини NK і цитотоксичні ILC3 інфільтрують метастатичні лімфатичні вузли раку молочної залози. Oncoimmunology 2022, 11, 2057396. [CrossRef]

29. Cesta, MF Нормальна структура, функція та гістологія селезінки. Токсикол. патол. 2006, 34, 455–465. [CrossRef]

30. Ісігуро, Т.; Накадзіма, М.; Найто, М.; Муто, Т.; Tsuruo, T. Ідентифікація генів, що диференціально експресуються в сублініях меланоми миші B16 з різними метастатичними потенціалами. Cancer Res. 1996, 56, 875–879.

31. Сабо, SJ; Кім, ST; Коста, GL; Чжан, X.; Фатман, CG; Glimcher, LH. Новий фактор транскрипції, T-bet, керує прихильністю Th1 лінії. Cell 2000, 100, 655–669. [CrossRef] [PubMed]