Рецептор глутамату відіграє важливу роль у захисті від Botrytis cinerea через електричні сигнали в томатах

Анотація:

Гени глутамат-подібних рецепторів рослин (GLR) гомологічні генам іонотропних глутаматних рецепторів ссавців (iGluR). Хоча GLR були причетні до захисту рослин від біотичного стресу, зв’язок між GLR-опосередкованим імунітетом рослин проти грибкових патогенів та електричними сигналами залишається погано вивченим. Тут ми виявили, що попередня обробка інгібітором GLR, 6,7-динітрихіноксалін-2,3-діоном (DNQX), збільшила чутливість рослин томатів до некротрофного грибкового патогену Botrytis cinerea. Оцінка подвійних мутантів glr3.3, glr3.5 і glr3.3/glr3.5 при зараженні B. cinerea показала, що GLR3.3 і GLR3.5 томатів є важливими для імунітету рослин проти B. cinerea, де GLR3. 3 грає головну роль.

Аналіз змін мембранного потенціалу, викликаних глутаматом (Glu) або гліцином (Gly), виявив значно знижену амплітуду шляхом нокауту GLR3.3 у томатах. Хоча лікування Glu або Gly значно підвищувало імунітет проти B. cinerea у рослин дикого типу, цей ефект був значно послаблений у мутантів glr3.3. Таким чином, наші дані демонструють, що GLR3.3- і GLR3.5-опосередкований імунітет рослин проти B. cinerea пов’язаний з електричними сигналами в рослинах томатів.

Від міцності імунітету безпосередньо залежить стан нашого здоров'я. Коли імунітет сильний, ми краще боремося з хворобами та інфекціями. І навпаки, якщо наша імунна система слабка, хвороботворні мікроорганізми можуть легше вторгнутися в наш організм і викликати у нас захворювання. Тому дуже важливо підтримувати імунну систему здоровою, яку можна покращити за допомогою дієти, фізичних вправ та зменшення стресу.

Під час дослідження було виявлено, що цистанхея трав’яна може значно підвищити імунітет. Загальні глікозиди цистанки пустирної, полісахариди цистанки пустерної та вербаскозид здатні істотно знижувати вміст МДА в тканинах печінки та мозку, активність теломерази в тканинах серця та мозку. Посилюється фагоцитарна функція макрофагів, значно підвищується проліферативна відповідь лімфоцитів і вміст ІЛ-2 у периферичній крові, що сприяє підвищенню імунної функції організму.

Клацніть на переваги цистанчі для здоров’я

1. Введення

Рослинам, які ростуть у природному середовищі, постійно загрожують різноманітні патогени. Ці біотичні стресори впливають на виробництво сільськогосподарських культур і часто спричиняють економічні втрати. Оскільки рослинам не вистачає мобільності, вони придбали низку систем передачі сигналів під час еволюції, щоб ефективно пом’якшувати несприятливі наслідки змін навколишнього середовища. Чим швидше маневрують ці сигнали, тим більша ймовірність того, що рослини адаптуються та протистоять наближаючому стресу. Сигнали, про які повідомлялося на даний момент, включають потік кальцію, АФК (активні форми кисню), електричні сигнали тощо [1–5], які реагують протягом секунд або хвилин.

Гени глутамат-подібних рецепторів рослин (GLR) є гомологічними генам іонотропних глутаматних рецепторів ссавців (iGluR), які запускають електричні та Ca2 плюс сигнальні каскади [3,6]. Вважається, що рослинні GLR мають зв’язування лігандів, а також активність іонних каналів. GLR мають 20 членів родини у Arabidopsis [7] і 13 членів у рису [8]. У рослинах томатів є 13 повнорозмірних генів GLR [9].

Важливо, що GLR беруть участь у реакції рослин на біотичний стрес. Наприклад, AtGLR3.3 є життєво важливим модулем імунітету рослин проти бактеріального патогена P. syringae pv. томат DC3000 (Pst DC3000), ооміцет Hyaloperonospora arabidopsidis та комаха Spodoptera littoralis [10–12].

Крім того, Wang et al. (2019) повідомили, що GLR3.5 функціонує в захисті томатів від кореневої нематоди (RKN) Meloidogyne incognita [13]. Надмірна експресія GluR-комплементарної ДНК редьки в рослинах Arabidopsis підвищує стійкість до некротичного грибкового патогену, B. cinerea. Однак мутанти Arabidopsis glr3.3 не демонструють підвищеної вразливості до грибкового патогену порівняно з Col-0. Таким чином, роль GLR в імунітеті рослин проти грибкових патогенів залишається суперечливою.

GLR рослин беруть участь у генерації та передачі електричних сигналів. Існування електричних сигналів у рослин відкрили Берден-Сандерсон і Чарльз Дарвін [14,15]. Вони являють собою сигнали швидкого реагування, що генеруються миттєвою зміною градієнта електричного потенціалу на плазматичній мембрані або мембрані альвеолярного листка [16]. Усі рослини можуть виробляти електричні сигнали на великій відстані, які відіграють важливу роль у зв’язку між різними тканинами та органами, що призводить до інтеграції екологічних реакцій [17,18].

В останні роки функція електричних сигналів у GLR-опосередкованій стійкості рослин до біотичного стресу привернула велику увагу [19]. У Arabidopsis комахи, що харчуються листям, можуть спричинити зміни у поверхневому потенціалі, що призводить до експресії кількох ключових жасмонатних (JA)-індукованих регуляторних генів у дорослій фазі рослин [3]. Атака галлової нематоди на коріння помідорів викликає передачу електричних сигналів і сигналів АФК від коренів до листя, що призводить до накопичення JA в листі [13]. Фармер та ін. (2014) висунули гіпотезу про те, що дистальний синтез JA у рослин після поранення залежить від опосередкованих кладою 3 GLR електричних сигналів [20]. Однак зв’язок між електричними сигналами та індукованим GLR імунітетом рослин проти грибкових патогенів не був повністю обґрунтованим.

Томат (Solanum lycopersicum L.) за економічним значенням є однією з найбільш значущих культивованих культур у світі [21]. Тим не менш, грибкові захворювання шкодять виробництву томатів, що призводить до значних економічних збитків [22]. Зокрема, типовий некротрофний гриб Botrytis cinerea займає друге місце в топ-10 патогенів грибів у молекулярній патології рослин [23]. Він має широкий спектр хазяїв і може інфікувати понад 200 видів рослин, включаючи різноманітні товарні культури [24]. B. cinerea може спричинити значне зниження врожайності томатів та якості плодів після збору врожаю [25]. Однак сорт томатів із широкою стійкістю до B. cinerea ще не створено. Таким чином, розуміння молекулярних механізмів стійкості томатів до B. cinerea є особливо важливим.

У рослинах томатів є 13 повнорозмірних генів GLR. У цьому дослідженні GLR3.3 і GLR3.5, які відіграють позитивну роль у холодостійкості [26] і захисті від RKN [13], були функціонально охарактеризовані щодо імунітету рослин томатів проти B. cinerea. Ми виявили, що GLR3.3 і GLR3.5 є важливими гравцями в імунітеті рослин проти B. cinerea в томатах, можливо, через зв’язування з лігандом глутаматом (Glu) або гліцином (Gly), таким чином запускаючи електричні сигнали. Це відкриття має внутрішню наукову цінність із потенціалом для розробки нових стратегій підвищення стійкості культур до B. cinerea.

2. Матеріали та методи

2.1. Рослинні матеріали, умови вирощування та хімічна обробка

Лінії томатів (CRISPR-Csa9-відредаговані лінії glr3.3, glr3.5 і glr3.3/3.5), використані в цьому дослідженні, були на тлі дикого типу (WT) cv Ailsa Craig (AC). , як повідомлялося раніше [27]. У разі безґрунтової субстратної культури рослини томатів культивували в горщиках, які містили змішаний субстрат (вермикуліт:торф, 1:3, об/об) і удобрювали поживним розчином Хогланда.

У разі гідропонної культури насіння томатів спочатку пророщували в піддонах, наповнених змішаним субстратом (вермикуліт:перліт, 1:1, об/об), а після появи сходів пересаджували в пластикові контейнери місткістю 1,5 л (чотири саджанці). за контейнер). Контейнери заповнювали поживним розчином Енші наполовину, який постійно вентилювався за допомогою аерації повітря від повітряного насоса [21]. Були наступні умови вирощування: 14 годин світла/8 годин темряви; 24 ◦C/20 ◦C денна/нічна температура; і 400 мкмоль м-2 с-1 PPFD (щільність фотосинтетичного потоку фотонів). Обробці піддавали чотиритижневі рослини томатів.

Для аналізу попередньої обробки DNQX (6,7-динітрихіноксалін-2, 3-діон, інгібітор GLR) рослини WT обробляли позакореневим спреєм 1 мМ DNQX або H2O як контроль за 12 годин до B. cinerea щеплення. Аналіз попередньої обробки Glu та Gly проводили, коли мутанти glr3.3 і рослини WT обробляли 20 мМ Glu, 20 мМ Gly або H2O як контроль один раз на день як на абаксіальній, так і на адаксіальній поверхнях листя. Через 2 дні після фармакологічної обробки рослини піддавали інокуляції патогеном.

2.2. Інокуляція збудника та визначення симптомів захворювання

У цьому дослідженні використовувався штам B. cinerea BO5-10. Інокуляцію проводили суспензією B. cinerea щільністю 2 × 105 спор мл–1 [28]. Суспензією обприскували цільнолистову частину рослин томатів. Інокульовані рослини поміщали в герметичний ящик для підтримки вологості близько 90 відсотків. Температура і світло були такими ж, як і в звичайних умовах культивування.

Після інокуляції збудника кількісно оцінювали накопичення мРНК актину B. cinerea через {{0}} день після інокуляції (dpi) [29]. Флуоресценцію хлорофілу вимірювали флуорометром для хлорофілу (IMAG-MAXI; Heinz Walz) при 3 dpi. Фотохімічну квантову ефективність ФСII (ΦPSII) аналізували як Fm0–F/Fm0 [30].

2.3. Субклітинна локалізація

Фрагменти генів GLR3.3 і GLR3.5 ампліфікували за допомогою праймерів, наведених у Додатковій таблиці S1, і клонували у вектор pAC402 із міткою зеленого флуоресцентного білка (GFP) [31]. Штам Agrobacterium GV3101, що містить плазміди, і Agrobacterium, що містить FLS2-mCherry як маркер локалізації на плазматичній мембрані, тимчасово коекспресували в трансгенній Nicotiana benthamiana (експресовано за допомогою гістону 2B-mCherry для позначення локалізації ядра), як описано раніше [32]. Через 2 дні після інфільтрації флуоресцентні сигнали білків, мічених GFP- або mCherry, оцінювали в листі за допомогою конфокального мікроскопа Zeiss LSM 780 на раніше описаних довжинах хвиль збудження/випромінювання [28].

2.4. Виділення РНК, транскрипція та qRT-PCR

Загальну РНК виділяли з листя помідорів за допомогою набору RNAsimple Total RNA (Tiangen, Китай) і проводили зворотну транскрипцію за допомогою ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Японія). Процес qRT-PCR проводили за допомогою системи LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche, Швейцарія). Реакційну систему проводили, як описано в попередньому експерименті [28]. Специфічні праймери для гена актину B. cinerea та гена актину внутрішнього контролю томатів перераховані в Додатковій таблиці S1.

2.5. Запис електричного потенціалу

Для реєстрації електричного потенціалу використовували гідропонні рослини томатів у фазі чотирьох листків. Капіляри з боросилікатного скла із зовнішнім діаметром 1,5 мм і внутрішнім діаметром 0.86 мм (Sutter Instrument Company, Америка) були сформовані в скляні мікроелектроди з діаметром наконечника близько 0 .5 мм для вимірювання внутрішньоклітинного цитоплазматичного потенціалу. Витягувач вертикальної мікропіпетки APE-2 (Narishige, Токіо, Японія) використовувався для витягування капілярів після нагрівання. Мікроелектроди заповнювали 1 М KCl і вставляли в клітини мезофілу листка. Листок занурювали в основний розчин (складався з 5 мМ MES, {{10}},5 мМ CaSO4, 0,05 мМ KCl і pH 6,0) [13], який був виконується, як показано на малюнку S1 у додатку. Кожен електрод був підключений до диференціального підсилювача. Для виявлення сигналів використовувалися два двоканальних підсилювача (FD223 і Duo773, World Precision Instruments). Гідропонний розчин замінювали таким же розчином з додаванням 2 мМ Glu або 2 мМ Gly за допомогою інфузійної трубки, коли значення виміряного мембранного потенціалу було стабільним. Амплітуди - це різниці потенціалів відносно базової лінії до змін.

2.6. Статистичний аналіз

Експерименти проводилися за повністю рандомізованим планом, і в кожному експерименті використовувалися мінімум три повтори. Якщо не зазначено інше, для кожної біологічної реплікації два листки кожної з двох рослин об’єднували та використовували як незалежний зразок. Три окремих експерименти були проведені незалежно. Ми провели дисперсійний аналіз даних за допомогою програмного забезпечення SAS версії 8 (SAS Institute), а потім використали тест Тьюкі, щоб визначити значущість на 5-відсотковому рівні.

3. Результати

3.1. Попередня обробка інгібітором GLR підвищує сприйнятливість томатів до B. cinerea

Щоб дослідити роль GLR у захисті рослин від B. cinerea, рослини томатів обприскували DNQX або H2O (контроль) протягом 12 годин перед інокуляцією B. cinerea. При 3 dpi з B. cinerea інокульоване листя демонструвало видимі ураження хворобою. Пошкодження листя, викликане інфекцією B. cinerea, оцінювали за допомогою флуоресцентного зображення хлорофілу для визначення відхилень у квантовому виході фотосистеми II (ΦPSII) (Рис. 1a,b). Після інокуляції B. cinerea ΦPSII значно знизився. Примітно, що значення ΦPSII в рослинах, оброблених DNQX, було нижчим, ніж у контролі. Обробка DNQX також збільшила кількість мРНК актину B. cinerea в листі (рис. 1c). Ці результати вказують на те, що GLR позитивно регулюють імунітет рослин проти B. cinerea в рослинах томатів.

Рисунок 1. Обробка DNQX підвищує чутливість помідорів до B. cinerea. Чотиритижневі рослини томатів обробляли 1 мМ DNQX або H2O за 12 годин до інокуляції B. cinerea: (а) псевдокольорові зображення листя томатів, що показують ΦPSII при 3 dpi; (b) кількісні значення ΦPSII при 3 dpi; (c) кількість транскриптів актину B. cinerea в листі томатів, інокульованих B. cinerea, на 1 dpi. Результати на панелях (b,c) представлені як середні значення ± SD; n=4. Статистично значущі відмінності між методами лікування (p < 0.05, тест Тьюкі) відображаються різними літерами. Експерименти, описані вище, проводилися тричі, кожен раз з однаковими результатами.

3.2. Субклітинна локалізація GLR3.3 і GLR3.5

GLR3.3 і GLR3.5 помідорів є гомологічними GLR3.3 і GLR3.6 арабідопсису відповідно (9), які, як повідомляється, беруть участь у реакції на напад нематод і холодостійкість помідорів. Для визначення субклітинної локалізації GLR3.3 і помідорів GLR3.5, GLR3.3-GFP, GLR3.5-GFP і GFP були трансформовані в Agrobacteriumtumefaciens, а потім тимчасово експресувалися в N. benthamiana. Конфокальна мікроскопія епідермальних клітин листя показала, що контрольний сигнал GFP виявили локалізацію в клітинних мембранах, цитозолях і ядрах (рис. 2). мембранах клітин не спостерігалося, що GLR3.3 і GLR3.5 локалізуються разом з гістоном 2B-mCherry в ядрах. Результати свідчать про те, що GLR3 томата.3-GFP і GLR3.5-CFP локалізуються в плазматична мембрана клітини.

Рисунок 2. Субклітинна локалізація GLR3.3 і GLR3.5. GLR-GFP томатів тимчасово коекспресували з FLS2-mCherry (утворювач локалізації на плазматичній мембрані) у листі N. benthamiama. Сигнали GFP і mCherry візуалізували за допомогою конфокальної мікроскопії через 48 годин після інфільтрації. Бар=25 мкм.

3.3. GLR3.3 і GLR3.5 діють у захисті рослин від B. cinerea

Щоб дослідити роль GLR в імунітеті рослин, CRISPR/Cas 9-опосередковані нокаутні рослини GLR3.3 або GLR3.5 томатів із редагованим геном і подвійні мутанти glr3.3/3.5 були інфіковані B. cinerea. Результати показали, що нокаут GLR33 і GLR3.5 призвів до очевидного зниження PSll порівняно з контролем WT (рис. 3a, b). Відповідно, накопичення мРНК актину B. cinerea в листі значно збільшилося (рис. 3c) у мутантів glr3.3 або glr3.5.

Тим часом подвійні мутанти glr3.3/glr3.5 показали більше ослаблення захисту рослин порівняно з мутантами glr3.3 і glr3.5. Ці спостереження припускають, що GLR3.3 і GLR3.5 функціонують надлишково, щоб створити опір Б. Кемерону. Крім того, GLR3.3 відіграє головну роль, оскільки мутанти glr3.3 були більш сприйнятливими до інокуляції B. cinerea, ніж мутанти glr3.5. На цій основі для подальшого дослідження було обрано GLR3.3.

3.4. Розпізнавання Glu та Gly GLR викликало електричні сигнали в імунній відповіді

Оскільки Glu або Gly можуть бути розпізнані GLR для запуску деполяризації мембрани [33], ми визначили Glu- або Gly-індуковану електричну передачу сигналів шляхом моніторингу впливу Glu і Gly на потенціал мембрани в листі томатів. Обробка Glu і Gly викликала значні зміни мембранного потенціалу за короткий час із збільшенням амплітуди приблизно на 17–20 мВ (рис. 4). Примітно, що зміна мембранного потенціалу, індукована Glu і Gly, була значно послаблена у мутантів glr3.3. Ці знахідки свідчать про те, що електричні сигнали в листі томатів, індуковані Glu або Gly, частково залежать від GLR3.3.

Рисунок 3. Вплив редагування GLR3.3 і GLR3.5 на захист рослин від інокуляції томатів B. cinerea: (a) псевдокольорові зображення листя томатів, що показують pPSll з роздільною здатністю 3 dpi; (b) кількісне визначення pPSllat 3 dpi; (c) кількість транскриптів актину B. cinerea в листі томатів, інокульованих B. cinerea, при 1 dpi. Результати на панелях (b,c) представлені як середні значення - SD; n=4. Статистично значні відмінності між методами лікування (p < 0.05, тест Тьюкі) відображаються різними буквами. Експерименти, описані вище, проводилися тричі, кожен раз з однаковими результатами.

Рисунок 4. Glu або Gly впливає на мембранний потенціал листя WT і glr3.3: (а) типові зміни мембранного потенціалу в мутантних листках томатів WT або glr3.3, оброблених Glu або Gly; (b) кількісна оцінка змін амплітуди мембранного потенціалу. Результати на панелі (b) представлені як середні значення ± SD; n=4. Показано статистично значущі відмінності між варіантами лікування (p < 0.05, тест Tukey). ) (a) WT плюс 2мМ Glu WT плюс 2мМ Gly glr3.3 плюс 2мМ Gly glr3.3 плюс 2мМ Glu WT плюс Контрольний розчин (a) (b) Рисунок 4. Glu або Gly впливає на мембранний потенціал WT і glr3.3 листя: (а) типові зміни мембранного потенціалу в мутантних листках томатів WT або glr3.3, оброблених Glu або Gly; (b) кількісна оцінка змін амплітуди мембранного потенціалу. Результати на панелі (b) представлені як середні значення ± SD; n=4. Статистично значущі відмінності між методами лікування (р <0,05, критерій Тьюкі) показані різними літерами. Експерименти, описані вище, проводилися тричі, кожен раз з однаковими результатами.

Мутанти glr3.3 виявляли більшу чутливість до B. cinerea, що узгоджувалося зі зниженням електричних сигналів, індукованих Glu або Gly. На основі цих спостережень ми припустили, що розпізнавання Glu і Gly GLR є критичним для імунітету проти B. cinerea. Щоб перевірити цю гіпотезу, було проведено фармакологічний аналіз за допомогою Glu- або Gly-екзогенної обробки. Перед інокуляцією B. cinerea рослини WT і мутант glr3.3 попередньо обробили Glu, Gly або H2O (контроль).

У рослинах WT індуковане інокуляцією B. cinerea зниження ΦPSII і збільшення накопичення мРНК актину B. cinerea були значно послаблені попередньою обробкою екзогенним Glu або Gly при 3 dpi (рис. 5). Однак симптоми захворювання у мутанта glr3.3 були більш серйозними, і сприятливий вплив Glu і Gly на резистентність проти B. cinerea значно зменшився через нокаут GLR3.3. Таким чином, ці результати вказують на те, що Glu- та Gly-індукований імунітет рослин проти B. cinerea частково залежить від GLR3.3.

Рисунок 5. Glu- або Gly-індукований імунітет проти B. cinerea частково залежить від GLR3.3. Чотиритижневі рослини томатів обробляли 20 мМ Glu, 20 мМ Gly або водою один раз на день протягом двох днів перед інокуляцією B. cinerea: (a) псевдокольорові зображення листя томатів, що показують ΦPSII при 3 dpi ; (b) кількісне визначення ΦPSII при 3 dpi; (c) кількість транскриптів актину B. cinerea в листі томатів, інокульованих B. cinerea, на 1 dpi. Результати на панелях (b,c) представлені як середні значення ± SD; n=4. Статистично значущі відмінності між методами лікування (р <0,05, критерій Тьюкі) показані різними літерами. Експерименти, описані вище, проводилися тричі, кожен раз з однаковими результатами.

4. Обговорення

s - це білки катіонних каналів, які існують у бактеріях, рослинах і тваринах. У тварин доведено, що GLR беруть участь у нейротрансмісії та імунній регуляції, а їхній ліганд Glu діє як сигнальний агент між двома системами [34–36]. У рослин GLR відіграють позитивну роль у імунітеті проти біотичного стресу [10,12,13]. Примітно, що GLR-індукований захист від RKN і укусів комах пов’язаний з електричними сигналами [3]. Однак зв’язок між GLR-опосередкованою стійкістю до грибкових захворювань та електричними сигналами не був повністю обґрунтований. Тут ми надаємо переконливі докази того, що GLR3.3- і GLR3.5-модульований імунітет рослин проти типового грибкового патогену B. cinerea пов’язаний з електричними сигналами.

У цьому дослідженні вперше була розкрита роль GLR в імунітеті розсади томатів проти B. cinerea. Застосування інгібітора GLR DNQX підвищило чутливість рослин томатів до B. cinerea (рис. 1). Крім того, нокаут GLR3.3 або GLR3.5 значно послабив імунітет рослини, що призвело до посилення симптомів захворювання на листках (рис. 3). Ці висновки підтверджують думку про те, що рослинам томатів потрібні GLR для створення адекватного захисту від некротрофного грибкового патогену B. cinerea. Хоча надмірна експресія GluR редьки пригнічує ріст B. cinerea [37], жоден із мутантів Arabidopsis glr не виявився більш чутливим до B. cinerea [12], що свідчить про те, що функція GLR може відрізнятися у різних видів. У цьому дослідженні подвійні мутанти glr3.3/glr3.5 показали більш чутливий фенотип порівняно з одномутантними glr3.3 і glr3.5. Ці висновки свідчать про те, що GLR3.3 і GLR3.5 функціонують надлишково. Примітно, що порівняння фенотипів між мутантами glr3.3 і glr3.5 свідчить про те, що GLR3.3 відіграє головну роль у захисті від B. cinerea.

Електричні сигнали є швидкою реакцією, що бере участь у GLR-опосередкованій стійкості рослин до біотичного стресу. Тут електричні сигнали, індуковані Glu або Gly, були значно послаблені у мутантів glr3.3. Обробка Glu або Gly індукувала мембранний потенціал на короткий час. Однак варіація амплітуди суттєво зменшилася у мутантів glr3.3 (рис. 4). Подібним чином у Arabidopsis генерація та поширення електричних сигналів, викликаних пошкодженням листя, послаблені у мутантів glr3.3 та glr3.6 [3]. Однак послаблення індукованих раною змін поверхневого потенціалу проявляється в скороченні тривалості, але амплітуда залишається такою ж, як WT у мутантів Arabidopsis glr3.3 після поранення листя. Ці відмінності в результатах можуть бути наслідком відмінностей у видах і методах лікування. Згідно з нашими результатами, нокаут GLR3.3 пригнічує деполяризацію мембрани коренів Arabidopsis, спричинену лікуванням Glu [38]. Усі ці результати свідчать про те, що електричні сигнали, індуковані Glu або Gly, частково залежать від GLR3.3.

Екзогенна обробка Glu індукує імунні відповіді на численні захворювання, такі як грибок Magnaporthe Oryza, що викликає грибок рису, некротрофний гриб Alternaria alternata в плодах томатів і бактеріальний збудник Ralstonia solanacearum, що передається через грунт [39–41]. Sun та ін. (2019) повідомили, що обробка Glu підвищує стійкість плодів томатів проти B. cinerea [42]. У цьому дослідженні екзогенна обробка Glu або Gly індукувала імунітет проти B. cinerea у рослин WT; однак переваги цього лікування були значно пригнічені у мутанта glr3.3 (рис. 5). Представлені тут дані продемонстрували, що GLR3.3 був необхідний для Glu- або Gly-індукованого імунітету проти B. cinerea. Таким чином, ці результати свідчать про те, що резистентність B. cinerea, індукована Glu або Gly, частково залежить від GLR3.3.

На основі наданих тут даних ми припускаємо, що GLR беруть участь у захисних реакціях на B. cinerea через електричні сигнали. З огляду на опосередкований фітогормонами імунітет, сигнальний шлях саліцилової кислоти сприяє захисту від біотрофних і гемібіотрофних патогенів, тоді як сигнальний шлях JA/етилен функціонує проти некротрофних патогенів [43,44]. Антагоністичний зв'язок між цими двома шляхами очевидний у багатьох патосистемах рослин [45,46].

Проте було показано, що GLR3.3 позитивно опосередковує резистентність проти біотрофного патогену Pst DC3000, і в той же час є важливим для імунітету проти некротрофного патогену B. cinerea. Наша пропозиція є розумною, оскільки GLR3.3 може розпізнавати Glu, який вважається різновидом DAMP [6,47]. DAMP запускають ранні вторинні сигнали та індукують експресію JA/етилену, гена захисту сигналу SA. Крім того, введення штучного струму в поверхню стебла індукує значне збільшення накопичення ЖА в рослинах [13].

Згідно з цими результатами, GLR3.3 може відігравати важливу роль у ранній фазі стійкості рослин через індуковані Glu або Gly електричні сигнали, які відповідають за секунди або хвилини, вище за течією шляху гормонального сигналу. Сигнальний шлях JA також може бути активований електричними сигналами. Крім того, добре задокументовано, що AtGLR3.3 бере участь у стійкості рослин, опосередковуючи [Ca2 плюс]цит варіації та реакції окислення [12]. Взаємозв’язок між цими шляхами та електричними сигналами в регуляції стійкості рослин проти B. cinerea вимагає подальшого дослідження.

5. Висновки

Представлені тут дані показують, що GLR3.3 і GLR3.5 відіграють позитивну роль у захисті рослин томатів від некротрофного патогену B. cinerea за допомогою електричних сигналів. Наше дослідження дає нові знання про механізм захисту рослин від B. cinerea. Тим не менш, буде цікаво продовжити дослідження зв’язку між кількома сигнальними шляхами, індукованими GLR, які сприяють імунітету рослин проти грибкових патогенів.

Авторські внески:

Концептуалізація, SF, CP і KS; методика, КС; програмне забезпечення, SF і PW; перевірка, SF, CP і KS; формальний аналіз, SF, CH і QM; розслідування, SF, CP та SD; ресурси, КС; курація даних, SF і CP; написання — підготовка оригіналу, SF і KS; написання—перегляд і редагування, КС; нагляд, КС; адміністрування проекту, КС; фінансування, KS Усі автори прочитали та погодилися з опублікованою версією рукопису.

Фінансування:

Ця робота була підтримана Національним фондом природничих наук Китаю (31772355, 32172650), Фондом природничих наук провінції Чжецзян для видатних молодих учених (LR19C150001), Програмою ключових досліджень і розвитку провінції Чжецзян (2021C02040) і Зоряною ніччю. Науковий фонд Шанхайського інституту передових досліджень Чжецзянського університету (SN-ZJU-SIAS-0011).

Заява інституційної наглядової ради:

Не застосовується.

Заява про інформовану згоду:

Не застосовується.

Заява про доступність даних:

Необроблені дані, що підтверджують висновки цієї статті, будуть надані авторами без зайвих застережень.

Подяки:

Автори хотіли б висловити свою щиру вдячність Національному фонду природничих наук Китаю, Фонду природничих наук провінції Чжецзян, Ключовій програмі досліджень і розвитку провінції Чжецзян і Науковому фонду Зоряної ночі Шанхайського інституту передових досліджень Чжецзянського університету Дослідження для їх фінансової підтримки.

Конфлікт інтересів:

Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів.

Список літератури

1. Гілрой, С.; Сузукі, Н.; Міллер, Г.; Чой, WG; Тойота, М.; Девіредді, Арканзас; Міттлер, Р. Приливна хвиля сигналів: кальцій і АФК на передньому краї швидкої системної сигналізації. Trends Plant Sci. 2014, 19, 623–630. [CrossRef]

2. Гедріх, Р.; Сальвадор-Рекатала, В.; Дрейєр, І. Електропроводка та міжміський зв'язок заводу. Trends Plant Sci. 2016, 21, 376–387. [CrossRef]

3. Мусаві, С.А.; Шовен, А.; Паско, Ф.; Келленбергер, С.; Фермер, Е. Е. Гени, подібні до глутаматного рецептора, опосередковують передачу сигналів від листка до листка. Nature 2013, 500, 422–426. [CrossRef]

4. Чой, В.Г.; Міллер, Г.; Уоллес, І.; Харпер, Дж.; Міттлер, Р.; Гілрой, С. Організація швидкої передачі сигналів на великі відстані в рослинах за допомогою Ca2 plus, ROS та електричних сигналів. Завод J. 2017, 90, 698–707. [CrossRef]

5. Марцек, М.Й.; Гілрой, С.; Poovaiah, BW; Танака, К. Взаємодія сигналів Ca2 plus і ROS в імунній відповіді рослин. Plant Sci. 2019, 283, 343–354. [CrossRef]

6. Тойота, М.; Спенсер, Д.; Савай-Тойота, С.; Jiaqi, W.; Чжан, Т.; Ку, AJ; Хоу, Джорджія; Гілрой, С. Глутамат запускає захисну сигналізацію рослин на основі кальцію на великій відстані. Наука 2018, 361, 1112–1115. [CrossRef]

7. Вудік, М.М.; Мічард, Е.; Олівейра, Північна Кароліна; Feijo, JA Порівняння глутаматних рецепторів рослин і тварин: спільні риси, але різні долі? J. Exp. Бот. 2018, 69, 4151–4163. [CrossRef]

8. Ні, Дж.; Ю, З.; Ду, Г.; Чжан, Ю.; Тейлор, JL; Shen, C.; Сюй, Дж.; Лю, X.; Ван, Ю.; Wu, Y. Гетерологічна експресія та функціональний аналіз сімейства ГЛУТАМАТОВОГО РЕЦЕПТОРА рису вказує на його роль у викликаному глутаматом потоці кальцію в коренях рису. Райс 2016, 9, 9. [CrossRef] [PubMed]

9. Ауїні, А.; Мацукура, К.; Езура, Х.; Asamizu, E. Характеристика 13 генів, подібних до глутаматного рецептора, закодованих у геномі томата за структурою, філогенією та профілями експресії. Gene 2012, 493, 36–43. [CrossRef] [PubMed]

10. Лі, Ф.; Ван, Дж.; Мак.; Чжао, Ю.; Ван, Ю.; Хасі, А.; Qi, Z. Глутаматний рецептор-подібний канал 3.3 бере участь у опосередкуванні цитозольного кальцієвого переходу, викликаного глутатіоном, транскрипційних змін і реакцій вродженого імунітету у Arabidopsis. Фізіол рослин. 2013, 162, 1497–1509. [CrossRef] [PubMed]

11. Нгуєн, Коннектикут; Куренда А.; Штольц, С.; Четелат, А.; Фермер, Е. Е. Ідентифікація клітинних популяцій, необхідних для передачі електричних сигналів від листка до листка в пошкодженій рослині. Proc. Natl. акад. Sci. США 2018, 115, 10178–10183. [CrossRef]

12. Манзур, Х.; Келоніемі, Дж.; Чілц, А.; Wendehenne, D.; Пугін, А.; Пуансо, Б.; Гарсія-Брюггер, А. Участь глутаматного рецептора AtGLR3.3 у сигналізації захисту рослин і стійкості до Hyaloperonospora arabidopsidis. Плант Дж. 2013, 76, 466–480. [CrossRef] [PubMed]

13. Ван, Г.; Ху, К.; Чжоу, Дж.; Лю, Ю.; Кай, Дж.; Пан, К.; Ван, Ю.; Ву, X.; Ши, К.; Ся, X.; та ін. Системна сигналізація кореневих пагонів забезпечує захист коренів від нематод на основі жасмонату. Curr. Biol. 2019, 29, 3430–3438. [CrossRef] [PubMed]

14. Darwin, CR Комахоїдні рослини; Джон Мюррей: Лондон, Великобританія, 1875 рік.

15. Burdon-Sanderson, JS Примітка про електричні явища, які супроводжують подразнення листка Dionæa muscular. Proc. R. Soc. Лонд. 1873, 21, 495–496.

16. Сухова Є.; Акінчиц Є.; Сухов В. Математичні моделі електричної активності рослин. J. Membr. Biol. 2017, 250, 407–423. [CrossRef]

17. Лі, Дж. Х.; Фан, Л.Ф.; Чжао, ді-джей; Чжоу, К.; Яо, JP; Ван, ZY; Хуан Л. Електричні сигнали рослин: міждисциплінарний виклик. J. Plant Physiol. 2021, 261, 153418. [CrossRef] [PubMed]

18. Гарсія-Сервін, Массачусетс; Мендоза-Санчес, М.; Контрерас-Медіна Л. М. Електричні сигнали як варіант зв'язку з рослинами: огляд. Теор. Exp. Фізіол рослин. 2021, 33, 125–139. [CrossRef]

19. Лі, М.; Ван, Ф.; Лі, С.; Ю, Г.; Ван, Л.; Лі, К.; Чжу, X.; Лі, З.; Юань, Л.; Liu, P. Імпортери керують передачею жасмонової кислоти від листа до листа при системному імунітеті, викликаному ранами. мол. Завод 2020, 13, 1485–1498. [CrossRef]

20. Фермер, Е.Е.; Гасперіні, Д.; Акоста, І. Ф. Гіпотеза стискання клітин для активації синтезу жасмонату у відповідь на поранення. Новий Фітол. 2014, 204, 282–288. [CrossRef]

21. Дінь, С.; Шао, X.; Лі, Дж.; Ахаммед, Г.Дж.; Яо, Ю.; Дінг, Дж.; Ху, З.; Ю, Дж.; Shi, K. Форми азоту та метаболізм впливають на захист рослин від листя та кореневих патогенів у томатах. Навколишнє середовище рослинної клітини. 2021, 44, 1596–1610. [CrossRef]

22. Лі, X.; Ян, Р.; Chen, H. Медіаторна субодиниця Arabidopsis thaliana MED8 регулює імунітет рослин до Botrytis Cinerea, взаємодіючи з основним фактором транскрипції спіраль-петля-спіраль (bHLH) FAMA. PLoS ONE 2018, 13, e193458. [CrossRef]

23. Дін, Р.; Ван Кан, JA; Преторіус, ZA; Хаммонд-Козак, К.Е.; Ді П'єтро, А.; Спану, П.Д.; Радд, Дж. Дж.; Дікман, М.; Каман, Р.; Елліс, Дж.; та ін. Топ-10 грибкових патогенів у молекулярній патології рослин. мол. Рослина Pathol. 2012, 13, 414–430. [CrossRef]

24. Бай, Ю.; Ліндхаут, П. Одомашнення та розведення томатів: що ми отримали і що ми можемо отримати в майбутньому? Енн Бот. 2007, 100, 1085–1094. [CrossRef] [PubMed]

25. Ван, X.; Чжоу, X.; Цай, З.; Го, Л.; Чень, X.; Чень, X.; Лю, Дж.; Фен, М.; Цю, Ю.; Чжан, Ю.; та ін. Штам біоконтролю Pseudomonas aeruginosa CQ-40 сприяє росту та контролю Botrytis cinerea в томатах. Патогени 2020, 10, 22. [CrossRef]

26. Лі Х.; Цзян, X.; Lv, X.; Ахаммед, Г.Дж.; Го, З.; Ци, З.; Ю, Дж.; Zhou, Y. Tomato GLR3.3 і GLR3.5 забезпечують стійкість до охолодження, викликану холодною акліматизацією, регулюючи апопластичне виробництво H2O2 і окисно-відновний гомеостаз. Навколишнє середовище рослинної клітини. 2019, 42, 3326–3339. [CrossRef]

27. Ху, Ч.; Дуань, С.; Чжоу, Дж.; Ю, Дж. Характеристики трансдукції електричного сигналу травоїдних тварин / рани в томатах. Фронт. Agric. Sci. інж. 2021, 8, 292–301.

28. Чжан Х.; Ху, З.; Лей, К.; Чжен, К.; Ван, Дж.; Шао, С.; Лі, X.; Ся, X.; Кай, X.; Чжоу, Дж.; та ін. Рослинний фітосульфокіновий пептид ініціює ауксинозалежний імунітет через цитозольний Ca2 плюс передачу сигналів у томатах. Рослинна клітина 2018, 30, 652–667. [CrossRef] [PubMed]

29. Чжан С.; Лі, X.; нд, З.; Шао, С.; Ху, Л.; Є, М.; Чжоу, Ю.; Ся, X.; Ю, Дж.; Ши, К. Антагонізм між передачею сигналів фітогормонів лежить в основі варіацій у сприйнятливості рослин томатів до захворювань при підвищеному рівні CO2. J. Exp. Бот. 2015, 66, 1951–1963. [CrossRef]

30. Генті, Б.; Briantais, JM; Бейкер, Н.Р. Взаємозв'язок між квантовим виходом фотосинтетичного транспорту електронів і припиненням флуоресценції хлорофілу. Біохім. біофіз. Acta 1989, 990, 87–92. [CrossRef]

31. Ма, К.; Лю, Ю.; Фанг, Х.; Ван, П.; Ахаммед, Г.Дж.; Зай, В.; Shi, K. Важлива роль мітохондріальної альфа-кетоглутаратдегідрогенази E2 у базальній імунній відповіді проти бактеріальних патогенів у томатах. Фронт. Plant Sci. 2020, 11, 579772. [CrossRef]

32. Ляо Ю.; Тянь, М.; Чжан, Х.; Лі, X.; Ван, Ю.; Ся, X.; Чжоу, Дж.; Чжоу, Ю.; Ю, Дж.; Ши, К.; та ін. Зв’язування саліцилової кислоти з мітохондріальною альфа-кетоглутаратдегідрогеназою E2 впливає на окисне фосфорилювання мітохондрій і компоненти транспортного ланцюга електронів і відіграє роль у базальному захисті від вірусу тютюнової мозаїки в томатах. Новий Фітол. 2015, 205, 1296–1307. [CrossRef]

33. Стівенс, Н.Р.; Ци, З.; Spalding, EP Підтипи глутаматних рецепторів, підтверджені відмінностями в десенсибілізації та залежності від генів GLR3.3 і GLR3.4. Фізіол рослин. 2008, 146, 529–538. [CrossRef] [PubMed]

34. Болдирєв А.А.; Карпентер, Д.О.; Джонсон, П. Нові докази подібної ролі рецепторів глутамату в нервовій та імунній системах. J. Neurochem. 2005, 95, 913–918. [CrossRef]

35. Фаціо, Ф.; Улів'єрі, М.; Volpi, C.; Гаргаро, М.; Фалларіно, Ф. Націлювання на метаботропні глутаматні рецептори для лікування нейрозапалення. Curr. Опін. Pharmacol. 2018, 38, 16–23. [CrossRef]

36. Ганор, Ю.; Левіт, М. Нейромедіатор глутамат і Т-клітини людини: рецептори глутамату та прямі та сильні ефекти, індуковані глутаматом, на нормальні Т-клітини людини, ракові Т-клітини людського лейкемії та лімфоми та аутоімунні Т-клітини людини. J. Neural Transm. 2014, 121, 983–1006. [CrossRef] [PubMed]

37. Кан, С.; Кім, HB; Лі, Х.; Чой, JY; Heu, S.; О, CJ; Квон, С.І.; An, CS Надмірна експресія в Arabidopsis глутаматного рецептора, націленого на плазматичні мембрани, з маленької редьки збільшує опосередкований глутаматом Ca2 плюс приплив і затримує грибкову інфекцію. мол. Клітини 2006, 21, 418–427.

38. Ци, З.; Стівенс, Н.Р.; Spalding, EP. Надходження кальцію опосередковується GLR3.3, рецептором глутамату Arabidopsis із широким профілем агоністів. Фізіол рослин. 2006, 142, 963–971. [CrossRef]

39. Кадотані, Н.; Акагі, А.; Такацудзі, Х.; Міва, Т.; Igarashi, D. Екзогенні протеїногенні амінокислоти викликають системну стійкість у рису. BMC Plant Biol. 2016, 16, 60. [CrossRef] [PubMed]

40. Сео, С.; Накахо, К.; Гонг, SW; Такахаші, Х.; Шигеморі, Х.; Мітсухара, І. L-гістидин індукує стійкість у рослин до бактеріального патогену Gastonia solanacearum частково через активацію сигналізації етилену. Фізіологія рослинної клітини. 2016, 57, 1932–1942. [CrossRef]

41. Ян, Дж.; Сонце, C.; Фу, Д.; Yu, T. Тест на інгібування L-глутаматом росту Alternaria alternata шляхом індукції резистентності в плодах томатів. Харчова хім. 2017, 230, 145–153. [CrossRef]

42. Sun, C.; Джин, Л.; Кай, Ю.; Хуан, Ю.; Чжен, X.; Ю, Т. Обробка L-глутаматом підвищує стійкість плодів томатів до захворювань шляхом індукції експресії рецепторів глутамату та накопичення амінокислот. Харчова хім. 2019, 293, 263–270. [CrossRef]

43. Лі, Н.; Хан, X.; Фенг, Д.; Юань, Д.; Хуан, Л. Дж. Перехресні перешкоди між саліциловою кислотою та етиленом/жасмонатом у захисті рослин: чи розуміємо ми, про що вони шепочуть? Міжн. J. Mol. Sci. 2019, 20, 671. [CrossRef] [PubMed]

44. Фермер, Е.Е.; Гао, YQ; Лензоні, Г.; Вулфендер, JL; Wu, Q. Рани та механостимульовані електричні сигнали контролюють гормональні реакції. Новий Фітол. 2020, 227, 1037–1050. [CrossRef] [PubMed]

45. Чжан Ю.; Пісня, РФ; Юань, ХМ; Лі, ТТ; Ван Л.Ф.; Лу, К.К.; Го, JX; Liu, WC Надмірна експресія N-кінця CATALASE2 посилює біосинтез рослинної жасмонової кислоти та стійкість до некротрофного збудника Botrytis cinerea B05.10. мол. Рослина Pathol. 2021, 22, 1226–1238. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Карлз, Л.; Ван дер Дус, Д.; Хікман, Р.; Янсен, В.; Верк, М.Ц.; Проєтті, С.; Лоренцо, О.; Солано, Р.; Пітерс, CM; Van Wees, SC Оцінка ролі транскрипційних репресорів фактора реакції етилену в опосередкованому саліциловою кислотою придушенні генів, що реагують на жасмонову кислоту. Фізіологія рослинної клітини. 2017, 58, 266–278. [CrossRef]

47. Танака, К.; Хейл, М. Пов’язані з пошкодженням молекулярні моделі (DAMP) у вродженому імунітеті рослин: застосування моделі небезпеки та еволюційних перспектив. Annu. Преподобний Фітопатол. 2021, 59, 53–75. [CrossRef]

Shuxian Feng †, Caizhe Pan †, Shutting Ding, Qiaomei Ma, Chaoyi Hu, Ping Wang і Kai Shi *.

Кафедра садівництва Чжецзянського університету, Ханчжоу 310058, Китай; 21916054@zju.edu.cn (SF)

22016198@zju.edu.cn (CP); 3130100256@zju.edu.cn (SD); 11916060@zju.edu.cn (QM); cyhu@zju.edu.cn (CH); 11916061@zju.edu.cn (PW)

Листування: kaishi@zju.edu.cn; Тел.: плюс 86-0571-88982383

Ці автори зробили рівний внесок у цю роботу.

For more information:1950477648nn@gmail.com