Перше клінічне випробування на людях щодо ефективності депігментації шкіри гліцинаміду гідрохлориду

Контакти:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Анотація:Попереднє дослідження ідентифікувало певні низькомолекулярні антимеланогенні пептиди, які мають загальну послідовність з -меланоцитстимулюючим гормоном (MSH) і закінчуються гліцинамідною частиною. Сам гліцинамід також продемонстрував антимеланогенну активність у клітинних аналізах, але ні гліцин, ні норацетилгліцинамід був активним, що свідчило про особливу структуру та діяльнісний зв'язок. Метою цього дослідження було вивчити ефективність депігментації шкіри гліцинаміду гідрохлориду у людей. Потенціал первинного подразнення шкіри гліцинаміду гідрохлориду був оцінений шляхом тестування на 30 людях. Ефективність депігментації шкіри гліцинаміду гідрохлориду оцінювали в подвійному сліпому клінічному тесті за участю 21 людини. Випробуваний і контрольний продукт наносили на визначені місця на правій або лівій стороні обличчя двічі на день протягом восьми тижнів. Параметри кольору шкіри, тобто індекс меланіну, значення L* (відображає світлоту шкіри), значення a* (почервоніння) і значення b* (жовтизна) вимірювали за допомогою приладів. Індивідуальний топологічний кут (ITAo, що представляє колір шкіри) був розрахований за значеннями L* і b. Ступінь шкірипігментаціябуло візуально оцінено двома тестерами. Тест на первинне подразнення шкіри показав, що розчин, що містить до 10 відсотків гліцинаміду гідрохлориду, не спричинив жодних несприятливих реакцій шкіри. У тесті на ефективність досліджуваний продукт значно знизив індекс меланіну та підвищив значення L* і ITAo через два тижні застосування відносно базове значення на початку тесту. Це також значно знизило ступіньпігментаціячерез 6 тижнів застосування відносно вихідного значення. Відмінності в індексі меланіну, значенні L*, ITAo та ступеніпігментаціяміж тестовою та контрольною групами стала статистично значущою через шість або вісім тижнів застосування. Під час тесту на ефективність ознак подразнення шкіри не спостерігалося. Це дослідження свідчить про те, що гліцинамід гідрохлорид має великий потенціал для використання в боротьбі з гіперпігментацією шкіри.

Ключові слова:меланін; гліцинаміду гідрохлорид; депігментуючий;пігментація; освітлення шкіри;відбілювання; пептид

cistanche покращують відбілювання

1. Введення

Колір шкіри людини в основному визначається вмістом і розподілом різних пігментних речовин, таких як меланін, гемоглобін, каротиноїди [1]. Генетичні чинники в першу чергу визначають колір шкіри, але на нього також сильно впливають набуті фактори. Меланін виробляється за допомогою процесу, у якому амінокислота під назвою L-тирозин метаболізується в серії ферментативних реакцій у меланосомах, які є органелами меланоцитів. Існують різні типи меланіну, такі як еумеланін і феомеланін, які надають різні кольори [2]. Меланосоми постачають меланін до оточуючих кератиноцитів, і, як наслідок, меланін розподіляється по шкірі та експресується, створюючи різні кольори шкіри [3]. Окрім впливу на зовнішній вигляд шкіри, меланін відіграє важливу роль у захисті організму від токсичності ультрафіолетових (УФ) променів [4]. Таким чином, метаболізм меланіну в шкірі став важливою темою дослідження як з фізіологічної, так і з естетичної точки зору [5,6].

Порушення метаболізму меланіну може спричинити різні типи пігментних захворювань шкіри, які поділяються на гіперпігментацію та гіпопігментацію [7,8]. Гіперпігментація виникає, коли меланін накопичується надмірно або нерівномірно через запалення, старіння, УФ-промені, фізичні пошкодження та інші внутрішні/зовнішні стимулюючі фактори [9,10]. У той же час генетичні або епігенетичні дефекти у виробництві меланіну можуть призвести до гіпопігментації, як-от альбінізм або вітіліго [11,12].

Стратегії профілактики та лікування гіперпігментації включають фотозахист, фармакотерапію, хірургічне лікування (хімічний пілінг та лазерне лікування) та косметичний камуфляж [13–15]. Хімічний пілінг і лазерне лікування часто проводять, але вони мають побічні ефекти, такі як дерматит і рецидивипігментація[16,17]. Гідрохінон в основному використовується як фармакотерапевтичний засіб, але він потенційно може викликати подразнення шкіри, алергію, мутації та рак [18]. У сфері косметики,освітлення шкіриДомінує функціональна косметика, що містить арбутин, ніацинамід та похідні вітаміну С, але задоволеність споживачів їх безпечністю та ефективністю освітлення шкіри низька [19]. Ця дослідницька група шукалаосвітлення шкіриагенти з різних природних джерел і ідентифікували численні природні сполуки, такі як р-кумарова кислота, ресвератрол і 7-сульфат лютеоліну, які інгібують клітинний синтез меланіну за допомогою різних механізмів [20–23].

Пептиди все частіше використовуються як активні інгредієнти в дерматології та продуктах по догляду за шкірою [24,25]. Чим менший пептид, тим дешевше його виробництво, тим вища його стабільність і тим легше він поглинається шкірою.

Наші останні дослідження виявили певні низькомолекулярні антимеланогенні пептиди [26,27]. У цих дослідженнях використовувався спеціальний алгоритм для прогнозування послідовностей активних пептидів з використанням бібліотеки комбінацій синтетичних пептидів позиційного сканування [28,29]. Використовуючи цей метод, можна було ідентифікувати антимеланогенні пептиди шляхом оцінки активності 80 тетрапептидних пулів замість оцінки активності всіх 160 000 можливих типів тетрапептидів [27]. Антимеланогенну активність пептидів попередньо оцінювали на клітинах меланоми B16-F10, оброблених β-меланоцитстимулюючим гормоном (MSH). Послідовність активного тетрапептиду була передбачена як R-(F/L)-(C/W)-(G/R)-NH2. З окремих протестованих тетрапептидів RFWG-NH2 і RLWG-NH2 показали високу антимеланогенну активність. Тетрапептид FRWG-NH2, який має ту саму послідовність, що й -MSH (ацетил-SYSMEHFRWGKPV-NH2), також продемонстрував подібну активність. Серед протестованих трипептидів FWG-NH2, LWG-NH2 і RWG-NH2 були відносно активними. Дипептид WG-NH2 і G-NH2 (гліцинамід) зберегли свою антимеланогенну активність, тоді як ні ацети-G-NH2, ні G (гліцин) не були активними. Вважається, що ці низькомолекулярні антимеланогенні пептиди націлені на рецептор меланокортину 1 (MC1R), оскільки вони мають послідовність, подібну до -MSH. Ці низькомолекулярні антимеланогенні пептиди можуть бути дуже корисними у вивченні MC1R-залежних фізіологічних функцій меланоцитів [30].

Було показано, що гліцинамід дуже ефективно інгібує клітинне вироблення меланіну шляхом зниження активації цАМФ-чутливого зв’язуючого білка (CREB) і експресії гена асоційованого з мікрофтальмією фактора транскрипції (MITF) і тирозинази (TYR) у відповідь на -MSH [27] У цьому дослідженні ми повідомляємо про результати першого випробування на шкіру людини гліцинаміду (у формі гідрохлориду), який є найменшим із низькомолекулярних антимеланогенних пептидів.

2. Матеріали та методи

2.1. Матеріали

Гліцинамід гідрохлорид був придбаний у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США), HangzhouDayangchem Co., Ltd. (Ханчжоу, Китай) і Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Токіо, Японія). Випробуваний продукт (Melapep) ), що містить 10 відсотків гліцинаміду гідрохлориду як активний інгредієнт, надано Ruby Crown. Co., Ltd. (www.rubycrown.com, Тегу, Корея). Контрольний продукт включав ту саму композицію без гліцинаміду гідрохлориду.

2.2. Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ)

Хроматографічний аналіз продуктів проводили за допомогою системи HPLC Waters Alliance (Waters, Milford, MA, USA), що складається з модуля розділення Waters e2695 і детектора Waters 2996Photodiode Array. Стаціонарною фазою була колонка Hector-M C18 5 мкм, 4,6 мм × 25{{10}} мм Hector-M C18 (RS Tech Co., Теджон, Корея), а рухомою фазою була 20 мМ фосфорної кислоти, що містить 5.0 мМ 1-октансульфонат натрію (pH 3,0). Швидкість потоку рухомої фази становила 0,6 мл/хв. Довжина хвилі детектування становила 210 нм. Продукт розбавляли рухомою фазою в 10 разів і пропускали через шприцевий фільтр (0,2 мкм, кат. № 431219, Corning, Inc. NY, США) перед ін’єкцією. Об'єм введеного зразка становив 10 мкл.

2.3. Тест на первинне подразнення шкіри

Первинний тест на подразнення шкіри було проведено відповідно до рекомендацій Ради з засобів особистої гігієни (PCPC) (2014) і стандартних операційних процедур (SOP) Dermapro Co., Ltd. (www.dermapro.co.KR, Сеул, Корея), щоб визначити, чи тестові продукти викликали подразнення шкіри людини. Тестовий проект (№ 1-220777-AN-02-DICN19165) був схвалений 1 серпня 2019 року комітетом з біоетики Dermapro Co., Ltd. і проведений відповідно до етичних принципів, заснованих на щодо Гельсінської декларації.

Суб'єкти були відібрані зі здорових добровольців, які відповідають критеріям включення та виключення. Ми отримали письмову інформовану згоду суб'єктів.

2.3.1. Критерії включення

(1) Здорові заявники віком 20−60 років без захворювань шкіри. (2) Кандидати, які добровільно підписали форму письмової згоди перед тестуванням після того, як їх повідомили про мету та зміст тесту. (3) Кандидати, які були готові співпрацювати з вимогами тесту та негайно повідомляти про будь-які несподівані наслідки. (4) Заявники, за якими можна спостерігати протягом усього періоду тестування.

2.3.2. Критерії виключення

(1) Жінки, які були вагітні, годували грудьми або могли завагітніти. (2) Заявники з шкірними захворюваннями в анамнезі, включаючи атопічний дерматит, псоріаз, екзему та сезонну алергію протягом останнього місяця перед тестуванням. (3) Заявники з ненормальнимипігментація, може перешкоджати підрахунку балів на місці тестування. (4) Заявники, які приймають протизапальні, антигістамінні або імунодепресанти. (5) Заявники, які використовували місцеві протизапальні препарати в пункті тестування протягом останніх двох тижнів до тестування. (6) Заявники із шкірними захворюваннями, які могли перешкодити проведенню тесту. (7) Заявники з аутоімунними захворюваннями або імунодефіцитом в анамнезі. (8) Заявники, які отримували імунотерапію протягом останнього тижня перед тестуванням або планували пройти курс лікування протягом тестового періоду. (9) Заявники, які отримували лікування від хронічних захворювань, таких як астма та діабет. (10) Заявники, які брали участь в інших тестах або брали участь у подібних тестах протягом останніх чотирьох тижнів до тесту. (11) Заявники, які зазнали подразнення шкіри або алергії у відповідь на кріпильну стрічку.

2.3.3. Умови участі

(1) Під час прикріплення пластиру суб’єктам заборонялося потрапляти воду на місце тестування. (2) Якщо від суб’єкта вимагали приймати або вживати ліки, про це слід було повідомити спеціаліста з тестування. (3) Суб'єкт повинен був дотримуватися графіка перевірки. (4) Суб’єкти повинні були повідомити тестеру про всі аномальні шкірні симптоми, які виникли протягом періоду тестування.

2.3.4. Критерії вилучення суб’єктів протягом періоду тестування

(1) Якщо суб’єкт добровільно відмовився від тестування через раптовий нещасний випадок, хворобу, вагітність тощо. (2) Якщо була серйозна побічна шкірна реакція, викликана досліджуваним матеріалом. (3) Якщо випробуваний не дотримувався протоколу тесту. (4) Якщо тест не вдалося виконати належним чином через особливі обставини, наприклад, якщо не вдалося зв’язатися з суб’єктом.

2.3.5. Тестування патчів

Тестові матеріали (150 мкл) наносили на Finn Chambers® (Smart Practice, Hillerød, Данія) за допомогою піпетки Microman M250 (Gilson, Villiers le bel, Франція). Камери прикріплювали до спини суб'єктів і захищали стрічкою Micropore (3M, Сент-Пол, Міннесота, США) протягом 24 годин. Тестери оцінювали шкірні реакції у суб’єктів двічі, перші 20 хв. після зняття пластиру, а потім через 24 години, використовуючи систему класифікації шкірної реакції, описану Фрошем і Клігманом [31] з невеликими модифікаціями, такими як: 0, видимої реакції немає; 1, легка плямиста або дифузна еритема; 2 — помірно рівномірна еритема; 3 — інтенсивна еритема з набряком; і, 4, інтенсивна еритема з набряком і везикулами. Оцінку відповіді (R у відсотках) розраховували як R=(Σ (рівень спостережуваної реакції × частота відповіді)/(загальна кількість чотирьох оцінок × загальна кількість двох спостережень × загальна кількість суб’єктів)) × 100 ( відсоток). Потенціал первинного подразнення шкіри досліджуваних матеріалів був описаний на основі R таким чином: R < 0,87="" відсотка,="" не="" подразнює/незначно="" подразнює;="" 0,87="" відсотка="" менше="" або="" дорівнює="" r="">< 2,42="" відсотка,="" легке="" подразнення;="" 2,42="" відсотка="" менше="" або="" дорівнює="" r="">< 3,44="" відсотка,="" помірно="" подразнює;="" і="" r="" більше="" або="" дорівнює="" 3,44="" відсотка,="" сильно="">

2.4. Тест на ефективність депігментації шкіри

Було проведено тестування для оцінки ефективності тестового продукту щодо депігментації шкіри. Тестовий проект (№ 1-220777-AN-02-DICN19168) був схвалений 16 серпня 2019 року комітетом з біоетики Dermapro Co., Ltd. і проведений відповідно до етичних принципів, заснованих на Гельсінкській декларації. Суб'єкти тестування були відібрані зі здорових добровольців, які відповідають критеріям включення та виключення. Ми отримали письмову інформовану згоду від пацієнта (тестованих).

2.4.1. Критерії включення

(1) Чоловіки або жінки віком 20–60 років з гіперпігментацією на обличчі, такою як мелазма або лентиго. (2) Здорові люди без гострих або хронічних фізичних захворювань, у тому числі захворювань шкіри. (3) Ті, хто підпадає під типи II, III та IV класифікації типу шкіри Фіцпатріка. (4) Заявники, які були проінформовані про мету, зміст тощо тесту та добровільно підписали угоду про проходження тесту. (5) Заявники, за якими можна було стежити під час тестування.

2.4.2. Критерії виключення

(1) Ті, хто були вагітні, годували грудьми або могли завагітніти. (2) Ті, у кого в анамнезі була фотоалергія або фоточутливість. (3) Ті, хто використовував зовнішні препарати, що містять стероїди, більше одного місяця для лікування шкірних захворювань. (4) Ті, хто брав участь у подібних тестах протягом 6 місяців до тесту. (5) Ті, у кого чутлива та дратівлива шкіра. (6) Ті, хто має аномалії шкіри, такі як плями, вугри, еритема, розширення капілярів тощо на місці тестування. (7) Ті, хто використовував ту саму або подібну косметику чи ліки на місці тестування протягом трьох місяців після початку тесту. (8) Ті, хто споживав ліки або продукти харчування дляосвітлення шкіриефекти. (9) Хворі на атопічний дерматит або інші інфекційні захворювання шкіри. (10) Ті, хто отримував медикаментозне лікування (пілінг шкіри, ботокс, інший догляд за шкірою тощо) у місці тестування протягом 6 місяців до тестування. (11) Ті, хто отримував імунізацію, антигістамінні препарати, протизапальні засоби тощо протягом трьох місяців до тесту. (12) Ті, хто отримував системні стероїди, гормональну терапію або променеву терапію протягом одного місяця до тесту. (13) Люди з хронічними харчовими захворюваннями (астма, діабет, високий кров’яний тиск тощо). (14) Ті, хто має роботу, пов’язану з перебуванням під сонячним світлом протягом тривалого часу. (15) Ті, хто приймав препарати, що викликають фоточутливість. (16) Ті, кого тестувальник визнав непридатним для участі в тестуванні.

2.4.3. Умови участі

(1) Суб’єкти не повинні були використовувати косметику чи ліки, які претендують на функціональність протягом періоду тестування. (2) Суб’єкти повинні були уникати впливу більш ніж звичайного рівня сонячного світла в повсякденному житті протягом періоду тестування і повинні були використовувати сонцезахисний крем, виходячи на вулицю. (3) Суб’єкти не повинні були плутати досліджувані продукти та застосовувати їх відповідно до приписів. (4) Суб’єкти не повинні були змінювати косметичні продукти, які використовували протягом періоду тестування, крім тестових продуктів. (5) Суб'єкти повинні були повідомити тестеру про всі аномальні симптоми. (6) Суб'єкти повинні були точно дотримуватися інструкцій щодо використання та обмежень продуктів. (7) Суб'єкти повинні були дотримуватися графіка перевірки та підтвердити тестеру використання продуктів.

2.4.4. Критерії вилучення суб’єктів протягом періоду тестування

(1) Якщо суб’єкт добровільно відмовився від тестування через раптовий нещасний випадок, хворобу, вагітність тощо. (2) Якщо досліджуваний матеріал викликав серйозну побічну реакцію. (3) Якщо випробуваний не відповідав протоколу тесту. (4) Якщо тесту перешкоджали особливі обставини, наприклад, якщо було неможливо відстежити суб'єкта. (5) Якщо суб’єкт надмірно пив або курив, або піддавався надмірному ультрафіолетовому опроміненню.

2.4.5. Застосування тестових продуктів

Тестовий і контрольний продукти (0,6 мл) вмочували в листи нетканого матеріалу розміром 4 × 3 см2 (назва продукту, тип бавовняної шкіри), придбані в Blue and Pink (Gimpo-si, Корея), які потім були окремо упаковані для використання піддослідними.

Тест був подвійним сліпим; ані тестувальникам, ані випробовуваним не було повідомлено, який продукт є яким. Після отримання тестових продуктів у тій самій упаковці від постачальника, менеджер тестових продуктів маркував пакети тестовими кодами в окремій кімнаті, недоступній для тестувальників або суб’єктів. Тестувальники отримували тестові продукти від менеджера тестових продуктів у сліпому стані, а суб’єкти також отримували продукти від тестувальника в сліпому стані.

Метод блокової рандомізації використовувався для розподілу досліджуваних продуктів між суб’єктами. Таблиця випадкового розподілу блоків (SSPP, SPSP, SPPS, PPSS, PSPS і PSSP) була надана суб’єкту, щоб визначити порядок тестових продуктів, S або P, які будуть використовуватися нею та трьома іншими суб’єктами в порядку.

Піддослідні використовували досліджувані продукти після вмивання обличчя та перед використанням будь-яких інших косметичних засобів двічі на день, вранці та ввечері, протягом восьми тижнів. Суб'єкти прикріплювали тестовий і контрольний продукти до визначених місць на лівій і правій сторонах обличчя відповідно (або навпаки) на 30 хвилин відповідно до рекомендацій постачальника.

2.4.6. Оцінка кольору шкіри

Піддослідні відвідували дослідницький центр кожні два тижні для оцінки їх шкіри. Після вмивання обличчя суб’єкти відпочивали 20 хв. перед оцінкою шкіри в лабораторії підтримували температуру 22 ± 2°C і відносну вологість 50 ± 5 відсотків.

Індекс меланіну та індекс еритеми вимірювали за допомогою Mexameter® MX18 (Courage plus Khazaka electronic GmbH, Кельн, Німеччина). Зонд мексаметра випромінює світло трьох певних довжин хвиль (зелений, λ=568 нм; червоний, λ=660 нм; та інфрачервоний, λ=880 нм), а приймач вимірює світло, відбите шкірою . Вимірювання повторювали тричі та усереднювали.

Колір шкіри виражається за допомогою простору кольорів лабораторії Internationale de l'Eclairage на основі ступеня світлості (L*), ступеня від зеленого до червоного (a*) і ступеня від синього до жовтого (b*) [32]. Параметри кольору шкіри L*, a* і b* вимірювали за допомогою Spectrophotometer® CM-2500d (Minolta, Токіо, Японія) [32]. Індивідуальний типологічний кут (ITA◦), що представляє колір шкіри, був розрахований за допомогою рівняння: ITA◦=(арктангенс [(L*−50)/b*])(180/3,14159) [33].

Візуальна оцінка проводилася двома тестувальниками. Вони незалежно один від одного оцінили ступінь пігментації шкіри за шкалою від {{0}} до 9 (0, світлий; 9, темний; кроки, 0.5). Якщо значення внутрішньокласового коефіцієнта кореляції між двома тестувальниками було більше 0,8, дані приймалися та використовувалися усереднені значення. Фотографії шкіри були зроблені під час використання VISIA® (Canfield Scientific, Inc., Ферфілд, Нью-Джерсі, США). Для оцінки безпеки шкіри випробувачі досліджували шкіру на подразнення, а суб’єкти проводили самооцінку подразнення шкіри в кожну точку часу оцінювання.

2.4.7. Оцінка побічних реакцій шкіри

Протягом восьмитижневого випробувального періоду піддослідні відвідували інститут кожні два тижні. Під час кожного візиту дослідники оцінювали суб’єктивні симптоми, запитуючи, чи відчували суб’єкти несприятливі шкірні реакції, такі як свербіж, поколювання, лоскотання, печіння, поколювання, скутість і стягнення протягом останніх двох тижнів. Учасників просили негайно повідомляти, якщо побічні шкірні реакції виникли між інтервалами відвідувань. Тестери також досліджували будь-які побічні шкірні реакції, такі як еритема, набряк, розмір і папули, щоб оцінити об’єктивні симптоми.

2.5. Статистичний аналіз

Дані аналізували за допомогою програмного пакету SPSS (IBM, Чикаго, Іллінойс, США). Дані виражаються як середнє ± стандартне відхилення (SD). Нормальний розподіл даних перевіряли за допомогою тесту Шапіро-Вілкса, і нормальність приймалася, якщо ексцес і асиметрія знаходяться в межах ± Попередня однорідність тесту, а контрольні групи до тесту перевірялися за допомогою парного тесту. Залежні від часу зміни порівняно з базовим значенням, а також відмінності між досліджуваною та контрольною групами в кожній часовій точці аналізували за допомогою повторних вимірювань ANOVA для параметричних значень і пост-хок тесту Вілкоксона зі знаковим рангом для непараметричних значень. Швидкість зміни (у відсотках) від базового значення розраховували наступним чином; швидкість зміни=[значення після лікування − базове значення до лікування)/базове значення до лікування] × 100 (відсотки).

3. Результати

3.1. Тестові продукти

У цьому дослідженні використовували досліджуваний продукт, що містив 10 відсотків гліцинаміду гідрохлориду, і контрольний продукт того ж складу без гліцинаміду гідрохлориду. Окрім основного інгредієнта, продукти містили гліцерин, 1,2-гександиол та воду. У таблиці 1 наведено склад досліджуваного продукту та контрольного продукту.

Типові ВЕРХ-хроматограми досліджуваних і контрольних продуктів показані на малюнку 1. Випробуваний продукт, але не контрольний продукт, містив гліцинамід гідрохлорид. Пік гліцинаміду гідрохлориду на хроматограмі ВЕРХ вказано стрілкою. Крім того, на рисунку 1 показана хімічна структура.

У ВЕРХ 1-октансульфонат натрію було включено до рухомої фази як агент для утворення іонних пар, щоб посилити утримування протонованої форми гліцинаміду, який інакше дуже швидко елюювався з колонки з октадецилоксидом кремнію з оберненою фазою. Наявність амідного зв’язку, що поглинає ультрафіолет, у гідрохлориді гліцинаміду дозволяло виявити при 210 нм.

3.2. Тест на первинне подразнення шкіри

у цьому тесті на початкових етапах тесту брали участь 31 суб’єкт жіночої статі, які відповідали критеріям включення та виключення; однак один суб’єкт вибув (DSA-19046-10; добровільна відмова), тому загалом 30 суб’єктів пройшли весь тест. Середній вік досліджуваних становив 40,43 ± 7,13 року, найстаршому учаснику було 50 років, а наймолодшому – 21 рік.

Тестування оклюзійних пластирів було проведено з метою оцінки безпеки продуктів для шкіри. Як показано в таблиці 2, суб’єкти, яких лікували тестом, контрольним продуктом і еталонним продуктом, не виявили побічних шкірних реакцій у два різні періоди часу спостереження. Оцінка відповіді в усіх випадках була, таким чином, нульовою, що вказувало на те, що потенціал первинного подразнення шкіри цих продуктів є дуже низьким, і їх можна класифікувати як «не подразнюють/злегка подразнюють».

3.3. Тест на ефективність депігментації шкіри

Тест розпочався з 23 учасників жіночої статі, хоча згодом двох було виключено (№16, добровільна відмова; №18, недотримання протоколу), тож остаточна кількість учасниць становила 21. Інформація про суб’єктів була зібрана в опитуванні на основі анкети. Середній вік досліджуваних становив 48,43 ± 4,14 року; найстаршому учаснику – 55 років; а наймолодшому був 41 рік. Таблиця 3 показує характеристики шкіри обстежених.

Було проведено подвійне сліпе випробування, щоб оцінити ефективність депігментації тестованого продукту. Ні тестувальник, ні суб'єкт не змогли відрізнити досліджуваний продукт від контрольного продукту, і клінічне випробування проводилося відповідно до встановленого методу. Піддослідні наносили тестовий і контрольний продукт на ліву або праву сторону обличчя двічі на день протягом восьми тижнів і кожні два тижні відвідували інститут для оцінки стану шкіри.

Для інструментальної оцінки параметрів кольору шкіри використовували два типи приладів. Спочатку гекзаметром вимірювали індекс меланіну та індекс еритеми. Як показано в таблиці 4 і на малюнку 2а, значне зниження індексу меланіну спостерігалося через два, чотири, шість і вісім тижнів як у тестовій, так і в контрольній групах порівняно з базовими значеннями перед початком тесту. Коли досліджуваний продукт застосовували для два, чотири, шість і вісім тижнів спостерігалося значне зниження індексу меланіну порівняно з базовим значенням. Рівень зниження індексу меланіну склав 1,48 відсотка через два тижні, 2,87 відсотка через чотири тижні, 3,92 відсотка через шість тижнів і 5,88 відсотка через вісім тижнів. Значні відмінності були виявлені між тестовою та контрольною групами через шість і вісім тижнів після початку тесту. З іншого боку, не було змін індексу еритеми ні в досліджуваній, ні в контрольній групах порівняно з базовими значеннями, виміряними перед тестуванням. початок тесту (табл. 5 і рис. 2b).

Ми також використовували спектрофотометр для вимірювання значень L*, a* і b*, які відображали світлоту шкіри, почервоніння та жовтизну відповідно. Як показано в таблиці 6 і на малюнку 2c, значне збільшення світлості шкіри (значення L*) спостерігалося через два, чотири, шість і вісім тижнів як у тестовій, так і в контрольній групах порівняно з базовими значеннями перед початком тесту. Порівняно з базовими значеннями тестовий продукт збільшив значення L* на 0,88 відсотка через два тижні, 0,85 відсотка через чотири тижні, 1,16 відсотка через шість тижнів і 1,40 відсотка через вісім тижнів . Значні відмінності були виявлені між досліджуваним продуктом і контрольним продуктом через шість і вісім тижнів після початку тесту. З іншого боку, незважаючи на те, що спостерігалися деякі зміни у значеннях* і b* як у тестовій групі, так і в контрольній групі порівняно з тим, що було перед початком тесту, ці зміни не були послідовними (таблиці 7 і 8, малюнок 2d,e). Значення* тимчасово знизилося на другому тижні в контрольній групі та на другому та восьмому тижнях у дослідній групі. Значення* тестової групи було нижчим, ніж контрольної групи на восьмому тижні. Показник b* знизився на восьмому тижні лише в контрольній групі, а різниці в значенні b* між контрольною та дослідною групами не спостерігалося.

ITA◦, розрахований на основі значень L* і b*, використовувався для вираження кольору шкіри. Що вищий ITA◦, то світліший колір шкіри. Як показано в таблиці 9 і малюнку 2f, значні зміни кольору шкіри спостерігалися через два тижні, чотири тижні, шість тижнів і вісім тижнів як у досліджуваній групі, так і в контрольній групі порівняно з базовими значеннями до початку тесту. У порівнянні з базовими значеннями тестовий продукт збільшив ITA◦ на 3,28 відсотка через два тижні, на 4,43 відсотка через чотири тижні, на 6,48 відсотка через шість тижнів і на 8,07 відсотка через вісім тижнів. Значна різниця в ITA◦ також була виявлена ​​між досліджуваним продуктом і контрольними продуктами через вісім тижнів після початку тесту.

Як показано в таблиці 10 і на малюнку 3а, ділянка шкіри, на яку було нанесено контрольний продукт, суттєво не змінилася з точки зору ступеняпігментаціяпротягом восьми тижнів, але ступінь пігментації на ділянці шкіри, на яку наносили досліджуваний продукт, значно зменшився через шість і вісім тижнів. Коли досліджуваний продукт наносили протягом шести та восьми тижнів, ступінь пігментації зменшився на 1,42 відсотка та 3,45 відсотка, відповідно, відносно базового значення перед початком тесту. На восьмому тижні після початку тесту також спостерігалася значна різниця в ступеніпігментаціяміж досліджуваним продуктом і контрольним продуктом. На малюнку 3b показано зображення двох репрезентативних людей.

Не було жодних побічних реакцій на досліджувані та контрольні продукти, про які повідомляли суб’єкти або які виявляли випробувачі протягом восьми тижнів.

4. Обговорення

Це перше дослідження, яке повідомляє про безпеку та ефективність депігментації гліцинаміду гідрохлориду, нанесеного на шкіру обличчя людини. У первинному тесті на подразнення шкіри досліджуваний продукт, що містить 10 відсотків гліцинамідгідрохлориду, не викликав жодних побічних реакцій у 30 людей. У подвійному сліпому тесті на ефективність досліджуваний продукт і контрольний продукт використовували відповідно на лівій і правій сторонах обличчя у 21 суб’єкта, випадково розподілених у різні групи. Протягом восьмитижневого тестового періоду ділянки шкіри, на які наносили тестовий продукт, стали світлішими, ніж ділянки, на які наносили контрольний продукт. Обидва візуальна оцінка ступеняпігментація, і інструментальна оцінка індексу меланіну, напруженості шкіри та кольору шкіри підтвердила ефективність депігментації досліджуваного продукту, що містить гліцинамід гідрохлорид.

Ефективність продукту депігментації шкіри людини можна оцінити за допомогою моделей штучної засмаги та природної гіперпігментації [34–36]. У цьому дослідженні з використанням натуральногопігментаціямоделі, зміни параметрів кольору шкіри в тестовій і контрольній групах протягом восьми тижнів тесту відстежували з двотижневими інтервалами. Контрольний продукт, який не містив гліцинаміду гідрохлориду, також викликав значні зміни індексу меланіну, значення L* та ITA через два тижні після початку тесту. Точна причина цього наразі незрозуміла, і на зміни могли вплинути кілька факторів. Інгредієнти, що містяться в контрольному продукті, такі як гліцерин і 1,2-гександиол, могли змінити стан поверхні шкіри, покращуючи чистоту, блиск і яскравість. Тим не менш, додаткові зміни параметрів, згаданих вище, через два тижні не були значущими в контрольній групі. Крім того, ступіньпігментація(оцінено візуально) не було суттєво зменшено контрольним продуктом порівняно з до початку тесту. Тому вважається, що продукт має дуже слабкий контрольосвітлення шкіриефект, якщо такий є.

У випадку досліджуваного продукту, на додаток до значної зміни індексу меланіну, значення L* та ITAo через два тижні після початку тесту, зміни мали тенденцію до поступового збільшення після цього. Крім того, ступіньпігментаціядосяг значно нижчого рівня, ніж базове значення. Це свідчить про те, що використання тестового продукту може покращити колір шкіри порівняно з використанням жодного продукту.

З шостого тижня від початку тесту спостерігалася значна різниця в меланіновому індексі та значенні L* між тестовою групою та контрольною групою, а через вісім тижнів також була різниця в ITAo та ступеніпігментація. Ці результати підтверджують висновок про те, що різниця в ефективності між досліджуваними та контрольними продуктами була зумовлена ​​наявністю або відсутністю гліцинаміду гідрохлориду; отже, ефективність депігментації шкіри тестованого продукту була зумовлена ​​його основним компонентом, гліцинамід гідрохлоридом.

У цьому дослідженні розчин гліцинаміду гідрохлориду, змочений листами нетканого матеріалу, наносили на обличчя, і було отримано позитивні результати щодо його ефективності депігментації шкіри. Цей метод нанесення виявився ефективним, але варто дослідити, чи можна змінити рецептуру та метод нанесення. підвищить ефективність продукту. Окрім місцевого нанесення на шкіру, необхідно вивчити методи перорального введення та ін’єкцій, щоб визначити їхню клінічну ефективність у майбутніх дослідженнях.

Статистичний аналіз відмінностей між тестовою та контрольною групами проводили за допомогою повторного вимірювання ANOVA з попарними порівняннями. Крім того, міжгрупові відмінності індексу меланіну, значення L*, ITAo тапігментаціяступеня були статистично значущими після 8-тижневого лікування. У поточному дослідженні рівень зниження меланінового індексу для досліджуваного продукту, що містить 10 відсотків гліцинаміду гідрохлориду, становив 5,88 відсотка (вихідний рівень 184,03 ± 22,70; восьмий тиждень 173,30 ± 20,79). Watanabe et al. повідомиливідбілювання шкіриефекти місцевого окисленого глутатіону в подвійному сліпому та плацебо-контрольованому клінічному дослідженні у тридцяти здорових жінок [36]. Місцеве лікування досліджуваним продуктом, що містить 2 відсотки окисленого глутатіону, протягом 10 тижнів знизило індекс меланіну на 10,7 відсотка (початковий рівень, 272,77±26,17; 10-й тиждень, 243,47±26,31) [36]. Незважаючи на те, що умови тесту, такі як базовий індекс меланіну, тестова доза та тривалість тесту, відрізняються один від одного, непряме порівняння цих двох досліджень свідчить про те, що гліцинаміду гідрохлорид має потенціал для використання як гіпопігментованого засобу. Подальші дослідження є необхідна оптимізація його дози, складу та методу застосування для досягнення кращої ефективності при депігментації шкіри.

Стаціонарний колір шкіри відображає відносне співвідношення кількості меланіну, що надходить з меланоцитів, до кількості меланіну, втраченого внаслідок десквамації кератину шкіри. Таким чином, пригнічення синтезу меланіну або посилення втрати меланіну є двома можливими стратегіями лікування гіперпігментації. Гліцинаміду гідрохлорид є корисною речовиною для першої стратегії, оскільки він може пригнічувати синтез меланіну шляхом зниження рівнів TYR та інших ферментів, які беруть участь у синтезі меланіну в меланоцитах [27]. Якщо це так, поєднання гліцинаміду гідрохлориду з засобами для пілінгу шкіри, такими як гліколева кислота [37,38], може призвести до подальшого підвищення ефективності депігментації завдяки синергізму між речовинами з різними механізмами дії.

Багато існуючих засобів для депігментації знижують синтез меланіну шляхом інгібування внутрішньоклітинного процесу передачі сигналу, відповідального за експресію гена TYR, або інгібування активності TYR безпосередньо [39,40]. Однак гліцинаміду гідрохлорид може перешкоджати зв’язуванню гормону з його рецепторами та блокувати ініціацію внутрішньоклітинних процесів передачі сигналу, тим самим пригнічуючи експресію TYR [27]. Відповідно, гліцинаміду гідрохлорид може діяти за допомогою механізму, відмінного від багатьох існуючих депігментуючих агентів, і очікуються синергетичні ефекти, якщо він використовується в комбінації з іншими депігментуючими агентами.

Пептидні гормони, похідні від проопіомеланокортину, такі як -MSH, -MSH і адренокортикотропний гормон (АКТГ), регулюють шкірупігментація, запалення та фіброз [8,30,41]. При зв’язуванні цих агоністів з MC1R і послідовних активаціях аденілатциклази (AC) і протеїнкінази A (PKA) фосфорилюється фактор транскрипції CREB, який, у свою чергу, індукує експресію MITF [42]. Експресія MITF також індукується іншими сигнальними шляхами, які включають каскад Wnt/Frizzled/ глікогенсинтази кінази 3/-катеніну та каскад протеїнкіназ фактора стовбурових клітин/c-Kit/мітоген-активованих [43,44]. MITF керує не тільки генною експресією меланогенних ферментів, але й біогенезом меланосом [2,45].

Низькомолекулярні антимеланогенні пептиди, виявлені в попередньому дослідженні, включають FRWG-NH2, RWG-NH2, WG-NH2 і G-NH2 (гліцинамід), які мають загальні послідовності з -MSH(ацетил-SYSMEHFRWGKPV-NH2) [27] . Було висунуто гіпотезу, що ці низькомолекулярні антимеланогенні пептиди можуть заважати рецепторному зв’язуванню -MSH конкурентним чином, таким чином блокуючи ініціацію внутрішньоклітинних процесів передачі сигналу (рис. 4). Якщо низькомолекулярні антимеланогенні пептиди діють як антагоністи MC1R, вони можуть пригнічувати активацію MC1R іншими агоністами, такими як -MSH і АКТГ, і впливати на інші фізіологічні явища, пов’язані із запаленням і фіброзом, а такожпігментація [30].

Хоча для механізму дії потрібні більш прямі докази, дане дослідження демонструє, що форма гідрохлоридної солі гліцинаміду, найменшої необхідної частини антимеланогенних пептидів, демонструє ефективність депігментації шкіри, не викликаючи подразнення шкіри у людей. Потрібні подальші дослідження для вивчення ефективності депігментації інших антимеланогенних тетрапептидів, трипептидів і дипептидів, згаданих вище.

На завершення, це дослідження показує, що гліцинаміду гідрохлорид має великий потенціал для контролю гіперпігментації шкіри.

Список літератури

1. Костін Г.Є.; Слух, VJ Пігментація шкіри людини: Меланоцити змінюють колір шкіри у відповідь на стрес. FASEB J. 2007, 21, 976–994. [CrossRef] [PubMed]

2. Скіаффіно М.В. Сигнальні шляхи в біогенезі та патології меланосом. Міжн. J. Biochem. Cell Biol. 2010, 42, 1094–1104. [CrossRef] [PubMed]

3. Кардіналі, Г.; Чеккареллі, С.; Ковач, Д.; Аспіт, Н.; Лотті, Л.В.; Торрісі, М.Р.; Пікардо, М. Фактор росту кератиноцитів сприяє перенесенню меланосом до кератиноцитів. Дж. Розслідувати. Derm. 2005, 125, 1190–1199. [CrossRef] [PubMed]

4. Епштейн, Дж. Х. Фотоканцерогенез, рак шкіри та старіння. J. Am. акад. Derm. 1983, 9, 487–502. [CrossRef]

5. Сломінський, А.; Кім, Т.К.; Брозина, А.А.; Janjetovic, Z.; Брукс, DL; Шваб, Л.П.; Скобовят, Ч.; Jozwicki, W.; Seagroves, TN Роль меланогенезу в регуляції поведінки меланоми: Меланогенез призводить до стимуляції експресії HIF-1альфа та HIF-залежних супутніх шляхів. Арк. Біохім. біофіз. 2014, 563, 79–93. [CrossRef]

6. Сломінський Р.М.; Змієвський, М.А.; Сломінскі А. Т. Роль пігменту меланіну в меланомі. Exp. Дерма.2015, 24, 258–259. [CrossRef]

7. Фістарол С.К.; Lin, PH Порушення пігментації. J. Dtsch. Дерматол. Ges. 2010, 8, 187–201. [CrossRef]

8. Сломінський, А.; Тобін, ді-джей; Шибахара, С.; Wortsman, J. Пігментація меланіну в шкірі ссавців і її гормональна регуляція. фізіол. 2004, 84, 1155–1228. [CrossRef]

9. Роуз П. Т. Пігментні розлади. Мед. Clin. N. Am. 2009, 93, 1225–1239. [CrossRef]

10. Каллендер В.Д.; St Surin-Lord, S.; Девіс, ЄС; Маклін, М. Постзапальна гіперпігментація: Етіологічні та терапевтичні міркування. Am. Дж. Клін. Derm. 2011, 12, 87–99. [CrossRef]

11. Ганджу, П.; Нагпал, С.; Мохаммед, MH; Нішал Кумар, П.; Панді, Р.; Натараджан, В.Т.; Mande, SS; Gokhale, RS Профілювання мікробної спільноти показує дисбактеріоз в ураженій шкірі суб’єктів вітіліго. наук. Rep.2016, 6, 18761. [CrossRef] [PubMed]

12. Шприц, Р.А.; Андерсен, GH Генетика вітіліго. Derm. Clin. 2017, 35, 245–255. [CrossRef] [PubMed]

13. Павліч, В.; Бркіч, З.; Марін, С.; Цикміл, С.; Гойков-Вукеліч, М.; Аокі, А. Депігментація меланіну ясен за допомогою Er: YAG-лазер: огляд літератури. Я. Космет. Лазерна терм. 2018, 20, 85–90. [CrossRef] [PubMed]

14. Саксена, С.; Андерсен, Р.М.; Maibach, HI Підводні камені клінічних випробувань виявили потребу в добре переносимих, більш ефективних депігментуючих агентах. J. Dermatol. Пригощати. 2015, 26, 440–450. [CrossRef] [PubMed]

15. Леві, Л.Л.; Емер, Дж. Дж. Емоційна користь косметичного камуфляжу при лікуванні захворювань шкіри обличчя: особистий досвід та огляд. Clin. Космет. Розслідувати. Derm. 2012, 5, 173–182.

16. Чу, Ч.; Чоу, CY; Cheng, YP Негайна пігментація після лазерного лікування. JAMA Derm. 2015, 151, 1021–1022. [CrossRef]

17. Бореллі К.; Урсін, Ф.; Steger, F. Підйом хімічного пілінгу в європейській дерматології 19-го століття: поява агентів, рецептур та методів лікування. J. Eur. акад. Derm. Venereol. 2020. [CrossRef]

18. Джоу, Т.; Hantash, BM. Гідрохінон-індукована депігментація: звіт про випадок і огляд літератури. Dermatitis 2014, 25, e1–e5. [CrossRef]

19. Десмедт, Б.; Courselle, P.; Де Бір, Джо; Рогірс, В.; Гросбер, М.; Деконінк, Е.; Де Паепе, К. Огляд засобів для відбілювання шкіри з оглядом нелегального ринку косметики в Європі. J. Eur. акад. Derm. Venereol.2016, 30, 943–950. [CrossRef]

20. Кім, М.; Парк, Дж.; Пісня, К.; Кім, HG; Кох, Дж.С.; Boo, YC Скринінг рослинних екстрактів на інгібуючі ефекти людської тирозинази. Міжн. Я. Космет. наук. 2012, 34, 202–208. [CrossRef]

21. Парк, Дж.; Boo, YC. Виділення ресвератролу з Vinifera caulis Віті та його потужне інгібування гумантирозинази. Evid. На основі доповнення. Чергувати. Мед. 2013, 2013, 645257. [CrossRef] [PubMed]

22. Квак, JY; Seok, JK; Suh, HJ; Чой, YH; Гонг, СС; Кім, Д.С.; Boo, YC Антимеланогенні ефекти лютеолін7-сульфату, виділеного з phyllospadix iwatensis makino. бр. J. Derm. 2016, 175, 501–511. [CrossRef] [PubMed]

23. Лі, SW; Кім, JH; Пісня, Х.; Seok, JK; Гонг, СС; Boo, YC Luteolin 7-Sulfate послаблює синтез меланіну шляхом інгібування CREB- і MITF-опосередкованої експресії тирозинази. Антиоксиданти 2019, 8, 87. [CrossRef] [PubMed]

24. Малеріх, С.; Берсон, Д. Космецевтика нового покоління: найновіші пептиди, фактори росту, цитокіни та стовбурові клітини. Derm. Clin. 2014, 32, 13–21. [CrossRef]

25. Чжан, Л.; Falla, TJ Космецевтика та пептиди. Clin. Derm. 2009, 27, 485–494. [CrossRef]

26. Seok, JK; Лі, SW; Чой, Дж.; Кім Ю.М.; Boo, YC Ідентифікація нових антимеланогенних гексапептидів за допомогою позиційного сканування комбінаторної бібліотеки синтетичних пептидів. Exp. Derm. 2017, 26, 742–744. [CrossRef]

27. Кім, Дж. Х.; Seok, JK; Кім Ю.М.; Boo, YC Ідентифікація малих пептидів і гліцинаміду, які інгібують синтез меланіну, використовуючи комбінаторну бібліотеку синтетичних пептидів позиційного сканування. бр. J. Derm. 2019, 181, 128–137. [CrossRef]

28. Пінілла К.; Аппель, JR; Блан, П.; Houghten, RA Швидка ідентифікація високоафінних пептидних лігандів з використанням позиційного сканування комбінаторних бібліотек синтетичних пептидів. Біотехніка 1992, 13, 901–905.

29. Рано, Т.А.; Тімкі, Т.; Петерсон, Е.П.; Ротонда, Дж.; Ніколсон, DW; Беккер, JW; Чепмен, К.Т.; Комбінаторний підхід Thornberry, NAA для визначення специфічності протеази: застосування до ферменту, що перетворює інтерлейкін-1бета (ICE). Chem. Biol. 1997, 4, 149–155. [CrossRef]

30. Сломінський А.Т.; Сломінський Р.М.; Змієвський, М.А. Націлювання на рецептор меланокортину типу 1 за допомогою малих пептидів.Br. J. Derm. 2019, 181, 17–18. [CrossRef]

31. Фрош, П. Дж.; Клігман А. М. Тест мильної камери. Новий метод оцінки подразнювальної дії мила. J. Am.Acad. Derm. 1979, 1, 35–41. [CrossRef]

32. Pierard, Керівництво GE EEMCO для оцінки кольору шкіри. J. Eur. акад. Derm. Venereol. 1998, 10, 1–11 [Перехресне посилання]

33. Вілкс, М.; Райт, CY; дю Плессіс, Дж. Л.; Рідер, А. Фіцпатрік. Тип шкіри, кут індивідуальної типології та індекс меланіну в африканському населенні: кроки до універсально застосовної оцінки фоточутливості шкіри. JAMA Derm. 2015, 151, 902–903. [CrossRef] [PubMed]

34. Boo, YC p-кумарова кислота як активний інгредієнт у косметиці: огляд, зосереджений на її антимеланогенних ефектах. Антиоксиданти 2019, 8, 275. [CrossRef] [PubMed]

35. Boo, YC Ефективність освітлення шкіри людини ресвератролом та його аналогами: від досліджень in vitro до косметичних застосувань. Антиоксиданти 2019, 8, 332. [CrossRef] [PubMed]

36. Ватанабе, Ф.; Хашизуме, Е.; Чан, Г.П.; Kamimura, A. Ефекти місцевого окисленого глутатіону на відбілювання шкіри та покращення її стану: Подвійне сліпе та плацебо-контрольоване клінічне випробування у здорових жінок. Клін. Космет. Розслідувати. Derm. 2014, 7, 267–274. [CrossRef]

37. de Villiers, MM; Нарсай, К.; ван дер Ватт, Дж. Г. Фізико-хімічна стабільність складених кремів, що містять a-гідроксикислоти. Міжн. J. Pharm. Compd. 2000, 4, 72–75.

38. Sharad, J. Терапія пілінгом гліколевої кислоти - поточний огляд. Clin. Космет. Розслідувати. Derm. 2013, 6, 281–288. [CrossRef]

39. Піллайяр, Т.; Маніккам, М.; Namasivayam, V. Агенти для відбілювання шкіри: перспектива медичної хімії інгібіторів тирозинази. J. Фермент. Inhib. Мед. Chem. 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

40. Золгадрі, С.; Бахрамі, А.; Хасан Хан, MT; Муньос-Муньос, Дж.; Гарсіа-Моліна, Ф.; Гарсіа-Кановас, Ф.; Saboury, AAA комплексний огляд інгібіторів тирозинази. J. Фермент. Inhib. Мед. Chem. 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

41. Стейнхофф, М.; Стендер, С.; Зелігер, С.; Ансель, Дж. К.; Шмельц, М.; Люгер, Т. Сучасні аспекти шкірного нейрогенного запалення. Арк. Derm. 2003, 139, 1479–1488. [CrossRef] [PubMed]

42. Буска, Р.; Ballotti, R. Cyclic AMP, ключовий месенджер у регуляції пігментації шкіри. Pigment Cell Res.2000, 13, 60–69. [CrossRef] [PubMed]

43. Тачібана, М. MITF: Потік, що тече для пігментних клітин. Pigment Cell Res. 2000, 13, 230–240. [CrossRef][PubMed]44. Ебанкс, Дж.П.; Wickett, RR; Boissy, RE Механізми регулювання пігментації шкіри: підйом і спад кольору обличчя. Міжн. J. Mol. наук. 2009, 10, 4066–4087. [CrossRef]

45. Саймон, Дж. Д.; Пелеш, Д.; Вакамацу, К.; Іто, С. Сучасні проблеми в розумінні меланогенезу: хімія сполучення, біологічний контроль, морфологія та функція. Пігментно-клітинна меланома Res. 2009, 22, 563–579. [CrossRef]