Епігенетичний регулятор BRD4 бере участь у запальній відповіді в нирках щурів, викликаній кадмієм

для отримання додаткової інформації:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong та ін

Cistanche tubulosa запобігає захворюванням нирок, натисніть тут, щоб отриматипродукти та Cistanche DHT

АНОТАЦІЯ

Кадмій (Cd) описано як потенційний індуктор запалення, тоді як все більше доказів показує, що неадекватне запалення є фактором, що сприяєураження нирок. Отже, дослідження запальної відповіді, викликаної Cd, має велике значення для з’ясування механізму індукованої Cd нефротоксичності. Бромодомен містить 4(BRD4) є важливим епігенетичним регулятором, що бере участь у розвитку багатьох запальних захворювань, але його регуляторна роль у викликаних Cdзапальнийвідповідь ще належить уточнити. Тут ми виявили, що лікування Cd у щурів Sprague-Dawley (2 мг/кг маси тіла, внутрішньовенно, 5 послідовних днів) і у щурівклітина ниркилінія (NRK{{0}}E, 0–10 мкМ, 12 год) індукувала транскрипцію запальних цитокінів, які могли бути знижені JQ1 (інгібітор BRD4, 25 мг/кг маси тіла, внутрішньовенно , 3 дні поспіль in vivo; 0,5 мкМ, 12 годин in vitro) або малу інтерферуючу РНК BRD4 (siRNA, in vitro), що свідчить про те, що BRD4 бере участь у запальній відповіді, викликаній Cd. Далі наше дослідження прояснило роль BRD4 у запальній відповіді, викликаній Cd. Інгібування BRD4 зменшило ядерну транслокацію та активацію NF-κB, спричинену Cd, in vivo та in vitro. Cd підвищив рівень ацетилювання RelA K310 і посилив зв’язування BRD4 з ацетильованим NF-κB RelA in vivo та in vitro, які були скасовані інгібуванням BRD4. Підводячи підсумок, наше дослідження показує, що BRD4 бере участь у транскрипції запальних цитокінів, викликаній Cd, опосередковуючи активацію сигнального шляху NF-κB і посилюючи зв’язування з ацетильованим NF-κB RelA у щурів.нирка,отже, BRD4 може бути потенційною терапевтичною мішенню для захворювань нирок, спричинених Cd.

Ключові слова: BRD4КадмійЗапальні ниркицитокіни NF-κB JQ1

1. Введення

Кадмій (Cd) є забруднювачем важкого металу з високою токсичністю та тривалим періодом напіврозпаду. З розвитком промислового виробництва зростаюча загроза забруднення кадмієм для навколишньої безпеки та здоров’я людини викликала занепокоєння (Wang та ін., 2020; Horiguchi та Oguma, 2016). Після того, як він поглинається організмом, Cd викликає пошкодження багатьох органів іниркає основним органом-мішенню (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Раніше ми систематично перевіряли, що інгібування аутофагії, окислювальний стрес і апоптоз синергічно сприяють нефротоксичності, спричиненій Cd, у щурів (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Запалення є фізіологічною реакцією, яка діє як захисна реакція проти інфекції або травми, але неконтрольовані та невідповідні запальні реакції, спричинені Cd, можуть завдати шкоди, наприклад, пошкодити нормальні тканини спостерігача та сприяти аутоімунним захворюванням (Hossein-Khannazer та ін., 2020; Zhang та ін., 2020). Запальна реакція, викликана Cd, загострює серцево-судинні захворювання та пошкодження печінки, що свідчить про те, що запалення може відігравати важливу роль у опосередкованій Cdниркапатологічні процеси (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Епігенетика відноситься до спадкових модифікацій експресії генів на основі змін послідовності, не пов’язаної з ДНК, і оборотність цих модифікацій дозволяє відкривати нові терапевтичні цілі (Vendetti and Rudin, 2013). Сімейство бромодоменів і позакінцевих доменів (BET) включає бромодомен, що містить 2 (BRD2), BRD3, BRD4 і бромодомен, специфічний для яєчок (BRDT), який характеризується двома бромодоменами та зв’язуванням з ацетильованими лізинами гістонів і негістонів ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee and Bohmann, 2018). Білки BET діють як коактиватори транскрипції багатьох генів, таким чином регулюючи клітинний цикл, запальну відповідь, окислювальний стрес та інші фізіологічні процеси в різних патологічних моделях (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 є особливо добре вивченим представником сімейства білків BET, і накопичення досліджень показало, що він є новою епігенетичною мішенню для регулювання різноманітниххвороби нирок, включаючи хронічний нефрит, діабетичну нефропатію та експериментальне ураження нирок (Zeng and Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Було підтверджено участь BRD4 у процесі транскрипції, залежному від ядерного фактора κB (NF-κB) для регулювання запальних реакцій при багатьох захворюваннях (Xu and Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 може бути рекрутований ацетильованим RelA (субодиниця NF-κB, ген, що кодує білок) на лізині 310 (RelA-K310ac) через його бромодомени, таким чином активуючи циклін-залежну кіназу 9 (CDK9) і фосфорилюючи РНК-полімеразу II для сприяння транскрипції цільових генів NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Недавні дослідження показують, що інгібітори BRD4 можуть бути потенційним терапевтичним варіантом для запальних захворювань. У моделях ушкоджень спинного мозку щурів інгібування BRD4 послаблювало запальну реакцію та сприяло функціональному відновленню мікроглії (Dey et al., 2019). Крім того, інгібування BRD4 скасувало експериментальне запалення нирок у мишачих моделей односторонньої обструкції сечоводу, антимембранного базального ГН та інфузії ангіотензину II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

З огляду на потенційні прозапальні ефекти Cd і регуляторні ефекти BRD4 на запалення, ми припустили, що BRD4 бере участь у запальній відповіді, викликаній Cd. Як і очікувалося, BRD4 опосередковує процес транскрипції запальних цитокінів у моделях нирок щурів, підданих Cd. Наше дослідження розкриває потенційний механізм у запальній відповіді, викликаній Cd, і дає нові знання про терапію індукованої Cd нефротоксичності.

2. Матеріали та методи

2.1. Хімічні речовини та антитіла

Кадмій хлорид (CdCl2, безводний, 439800) був придбаний у Sigma-Aldrich (Карлсбад, Каліфорнія, США). (плюс)-JQ1 (HY-13030) було отримано від MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA). Набір для екстракції ядерного білка було придбано в Інституті біотехнології Beyotime (Шанхай, Китай, P0027). Ефективний хемілюмінесцентний набір (ECL, 32209) і реагент для аналізу білка біцинхонінової кислоти (BCA, 23225) були отримані від Thermo Fisher Scientific (Медісон, Вісконсин, США). Були використані первинні антитіла проти таких білків: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) були придбані в Proteintech Group (м. Ухань, Китай); -актин (3700 с), гістон H3 (His3, 4499), сіртуїн 1 (Sirt1, 8469), нормальний кролячий IgG (IgG, 4394) були придбані в Cell Signaling Technology (Денверс, Массачусетс, США); BRD4 (ab128874), K (лізин) ацетилтрансфераза 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (ацетил K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488-кон’югований ослячий антикролячий антибіотик (ab150073) були придбані від Abcam (Кембридж, Великобританія). Другі антитіла: козячий антимишачий IgG (H плюс L) (115-035-003) і козячий антикролячий IgG (H плюс L) (111-035-003) були придбані в Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, США). ).

2.2. Тварини та досліди

Двадцять чотири щури Sprague-Dawley (самці, 6 тижнів, 110–120 г) були придбані у Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Цзінань, Шаньдун, Китай). Щурам дозволили вільний доступ до їжі та води в кімнаті з контрольованим навколишнім середовищем (24 ± 5 ​​градусів, 12 годинний цикл світло/темрява). Експериментальні процедури були застосовані до Директиви Ради Європейських Співтовариств 2010/63/EU щодо експериментів на тваринах, і всі процедури були схвалені Комітетом з догляду та використання тварин університету Янчжоу. Після одного тижня акліматизації щурів випадковим чином розділили на чотири групи: (1) Контрольна група: внутрішньоочеревинно вводили відповідний розчинник (фізіологічний розчин або розчин 2-гідроксипропіл- -циклодекстрину). (2) Група Cd: CdCl2 (2 мг/кг маси тіла, розчинений у фізіологічному розчині), введений внутрішньочеревно протягом 5 послідовних днів для встановлення моделі інтоксикації Cd. (3) Група Cd плюс JQ1: CdCl2 (2 мг/кг маси тіла) вводять внутрішньочеревно протягом 5 днів поспіль, щоб встановити модель інтоксикації Cd, і JQ1 (25 мг/кг маси тіла, розчинений у 2-гідроксипропіл{{ 25}}розчин циклодекстрину) вводять внутрішньочеревно на 6–8 день. (4) Група JQ1: JQ1 (25 мг/кг маси тіла) вводять внутрішньочеревно на 6-8 дні. Статистичні дані щодо вмісту кадмію в сироватці крові та тканинах нирок щурів наведено в таблиці S1, що відображає успішне створення моделей щурів із опроміненням кадмієм.

Після 8 днів лікування щурів вбили вивихом шийки матки під глибоким наркозом після 12 годин голодування. Тканини нирок розрізали і 1 г тканини кожної нирки швидко зберігали при -80 ◦C для наступного вестерн-блоттингу та кількісного аналізу ПЛР (кПЦР). Залишок тканини швидко фіксували в 4% параформальдегіді (PFA) для імуногістохімічного (IHC) фарбування.

2.3. Культивування клітин і лікування

Лінія клітин нирок щурів (NRK{{0}}E) була отримана з Шанхайського банку клітин Китайської академії наук. Клітини NRK-52E культивували з модифікованим Дульбекко середовищем Ігла (DMEM, Gibco, 12800-017), що містило 5 відсотків фетальної бичачої сироватки (FBS, Gibco, 10437-028), пеніцилін і стрептоміцин (1 00 U/мл) у зволоженому стані 5 відсотків CO2 і 95 відсотків повітря при 37 градусах. CdCl2 (розчинений у надчистій воді) і JQ1 (розчинений у диметилсульфоксиді) зберігалися окремо при 4 градусах і -20 градусах і розводилися в робочих розчинах перед використанням. Схема експерименту була наступною: (1) Клітини обробляли 0, 2,5, 5, 10 мкМ Cd протягом 12 годин або 5 мкМ Cd протягом 0, 6, 12, 24 годин для виконання наступних аналізів. (2) Клітини обробляли 5 мкМ Cd та/або 0,5 мкМ JQ1 протягом 12 годин для виконання наступних аналізів. (3) Клітини трансфікували siBRD4 та/або обробляли 5 мкМ Cd ще протягом 12 годин для виконання наступних аналізів.

2.4. Трансфекція малої інтерферуючої РНК

Ми трансфікували 20 нМ малої інтерферуючої РНК BRD4 (siBRD4, Invitrogen, Каліфорнія, США) у клітини NRK-52E за допомогою трансфекційного реагенту Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, кат. № 13778150) протягом 24 годин згідно з інструкціями до продукту. Були використані такі сенсові siRNA:

siBRD4 з цільовою послідовністю 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′;

siCt (негативний контроль siRNA), з цільовою послідовністю 5′- UUCUCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. Вестерн-блот

Зразки тканини нирки та клітини NRK-52E лізували в буфері RIPA, що містить інгібітори протеази, для вилучення загального білка. Ядерний білок заздалегідь готували зі свіжих тканин і клітин і зберігали при -80 градусах. Зразки білка (20–30 мкг на зразок) розділяли за допомогою SDS-PAGE електрофорезу, потім переносили на полівініліденфторидні мембрани (Millipore, ISEQ00010). Мембрани блокували 5% знежиреним молоком протягом 90 хвилин та інкубували 12 годин при 4 градусах з такими первинними антитілами: -актин (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Потім мембрани промивали TBST та інкубували з відповідними вторинними антитілами (1:10000) протягом 90 хв при кімнатній температурі (КТ). Мембрани інкубували з електрохемілюмінесценцією (ECL, ThermoFisher Scientific) і визначали на Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Франція), а оптичну щільність аналізували за допомогою ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США).

2.6. Імунофлуоресцентне (ІФ) фарбування

Клітини NRK{{0}}E, посіяні в 24-планшет з лунками, вирощували приблизно до 60 відсотків злиття. Клітини обробляли 5 мкМ Cd та/або 0,5 мкМ JQ1 протягом 12 годин, потім фіксували PFA (4 відсотки, 10 хвилин), пермеабілізували Triton X- 100 (0,1 відсотки, 15 хвилин), блокували BSA (2 відсотки, 90 хвилин) при кімнатній температурі та інкубували з первинним антитілом (NF-κB p65, розведення 1:50) протягом ночі при 4 градусах. Після тричі промивання PBS клітини інкубували з вторинним антитілом (розведення 1:500) протягом 90 хвилин і з DAPI протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, потім клітини спостерігали під конфокальним мікроскопом. Ядерну транслокацію NF-κB аналізували в трьох незалежних дослідженнях.

2.7. КПЦР

Сумарну РНК тканини нирок і клітин NRK-52E екстрагували за допомогою набору RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Японія). 1 мкг загальної РНК використовували для синтезу 1-го ланцюга кДНК відповідно до інструкції виробника (Roche, Basel, Швейцарія). Для визначення відносних рівнів мРНК за допомогою системи ПЛР у реальному часі LightCycler® 96 (Roche) було взято 2 мкл комплементарної ДНК (кДНК) на лунку. Обчисліть відносні рівні мРНК відповідно до рівняння 2-△△CT. Праймери були перераховані в таблиці S2. -актин був еталонним геном щурів.

2.8. Коімунопреципітація (Co-IP)

Тканини нирок і клітини NRK-52E лізували у свіжоприготованому буфері для лізису клітин (20 мМ HEPES–KOH, pH 7,5, 150 ммоль/л NaCl, 2 ммоль/л EDTA, 1% Triton X{{8} }), що містить PMSF. Гранули протеїну G (100 мкл на зразок, Bio-Rad, Hercules, Каліфорнія, США) змішували з 2 мкг антитіла BRD4, RelA-K310ac або IgG на зразок і обертали протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Потім лізати загального білка інкубували з комплексом гранули-антитіло протягом ночі при 4°. Після тричі промивання буфером для лізису клітин імунопреципітати ресуспендували в 1 × SDS PAGE буфері для зразків для конфігурації зразків. Білки-мішені виявляли за допомогою вестерн-блоттингу з первинними антитілами проти BRD4 та анти-RelA K310ac.

2.9. Статистичний аналіз

Усі дані були отримані з принаймні трьох незалежних експериментів і виражені як середнє значення ± SEM, якщо не зазначено інше. Експериментальні групи порівнювали за допомогою непарного двостороннього t-критерію Стьюдента або одностороннього дисперсійного аналізу (ANOVA) за допомогою SPSS 22.0 (SPSS Inc., Чикаго, Іллінойс, США). Значимість була встановлена ​​на р <>

3. Результати

3.1. Cd індукує експресію запальних цитокінів in vivo та in vitro

Було доведено, що Cd є забруднювачем навколишнього середовища, регулюючи низку біологічних процесів, спричиняє пошкодження нирок (Wang et al., 2019c). У цьому дослідженні зміни в рівнях транскрипції запальних цитокінів досліджували після впливу кадмію, щоб з’ясувати, чи пов’язане запалення з нефротоксичністю, спричиненою кадмієм. Дані показали, що вплив кадмію значно підвищив рівень білка інтерлейкіну (IL)-1 і фактора некрозу пухлин (TNF) у клітинах NRK-52E (рис. 1A-B) і тканинах нирок щурів (рис. 1C). -D). Водночас, як показано на рис. 1E-F, вплив кадмію підвищував транскрипційні рівні запальних цитокінів (IL-1, IL-6, TNF- і (протеїн хемоаттрактанта моноцитів-1) MCP -1) in vivo та in vitro. Ці дані свідчать про те, що Cd індукує експресію запальних цитокінів у нирках щурів.

3.2. BRD4 бере участь у індукованому Cd процесі транскрипції запальних цитокінів

BRD4 — нещодавно описаний епігенетичний регулятор, який зв’язується з ацетильованими або негістоновими гістонами для регулювання процесів запалення при багатьох захворюваннях. Тут інгібітор BRD4 JQ1 і BRD4-siRNA були використані для вивчення ролі BRD4 у запальній відповіді, викликаній Cd. Дані показали, що підвищені рівні Cd IL-1 і TNF-протеїну були знижені лікуванням JQ1 in vivo та in vitro (рис. 2A–D) і нокдауном BRD4 in vitro (рис. S1A-B). Водночас лікування JQ1 значно пригнічувало посилені Cd рівні транскрипції IL-1, IL-6, TNF- і MCP-1 у клітинах NRK-52E (рис. 2E) і тканини нирок щурів (рис. 2F). Крім того, нокдаун BRD4 значно знизив рівні транскрипції запальних цитокінів у клітинах NRK-52E під впливом Cd (рис. S1C). У сукупності ці результати свідчать про те, що BRD4 є критичним регулятором запальної реакції, викликаної Cd, у нирках щурів.

3.3. Рівні експресії BRD4 залишаються незмінними після експозиції Cd

Далі зміни в рівнях експресії BRD4 були виявлені після впливу Cd. Клітини NRK-52E обробляли Cd під градієнтом концентрації, і щурам внутрішньочеревно вводили Cd протягом 5 днів, щоб з’ясувати вплив Cd на експресію BRD4 у нирках in vivo та in vitro. Результати показали, що рівні білка BRD4 не змінювалися ні в клітинах NRK-52E, які зазнали Cd (рис. 3A-B), так і в тканинах нирок щурів (рис. 3C-D). Крім того, рівні мРНК BRD4 не змінювалися після впливу Cd (рис. 3E-F). Ці результати вказують на те, що BRD4 опосередковує запальну відповідь, викликану Cd, не залежить від змін рівня експресії.

3.4. BRD4 регулює ядерну транслокацію NF-κB, яку стимулює Cd

Роль BRD4 у запальній відповіді, викликаній Cd, була досліджена в нашому дослідженні. Зміна сигнального шляху NF-κB тісно пов’язана з транскрипцією запальних цитокінів (Chi et al., 2021). Наше дослідження виявило, що BRD4 бере участь у регульованій Cd ядерній транслокації та активації NF-κB. Спочатку субклітинну локалізацію NF-κB визначали за допомогою фарбування IF та фарбування IHC. Дані на рис. 4A та D показали, що JQ1 інгібує NF-κB ядерну транслокацію, спричинену Cd, у клітинах NRK-52E та тканинах нирок щурів. У той же час результати вестерн-блоттингу показали, що JQ1 значно знижував рівні ядерного білка NF-κB, збільшені Cd, in vivo (рис. 4B-C) та in vitro (рис. 4E-F). Подібним чином нокдаун BRD4 також суттєво пригнічував ядерну транслокацію NF-κB, спричинену Cd (рис. S2A), і знижував підвищені Cd рівні ядерного білка NF-κB (рис. S2B-C) у клітинах NRK-52E. Взяті разом, інгібування BRD4 може зменшити ядерну транслокацію NF-κB, спричинену Cd, що свідчить про те, що BRD4 опосередковує активацію сигнального шляху NF-κB у нирках після впливу Cd.

3.5. Cd підвищує рівні ацетилювання RelA K310

Дослідження підтвердили, що BRD4 зв’язується з ацетильованим RelA K310 через його домени брому для регулювання NF-κB-залежної транскрипції (Morgado-Pascual та ін., 2019; Zhong та ін., 2018). Таким чином, було виявлено рівень ацетилювання RelA K310 і експресію двох ферментів. Дані показали, що рівні білка RelA-K310ac і ацетилази Ep300 постійно знижувалися зі збільшенням концентрації Cd, тоді як рівень білка деацетилази Sirt1 поступово зростав у клітинах NRK-52E (рис. 5A-B) і тканинах нирок щурів (рис. 5C-D). Крім того, рівні мРНК Ep300 і Sirt1 показали однакові тенденції (рис. 5E-F). Ці результати свідчать про те, що Cd сприяє рівню ацетилювання RelA K310, таким чином, BRD4 може брати участь у транскрипції запальних цитокінів у нирках, викликаній Cd.

3.6. Cd посилює зв’язування BRD4 з RelA-K310ac для посилення його транскрипційної функції

Зв’язування з сайтами ацетилювання є основою для регуляції транскрипції BRD4 (Huang et al., 2009). Щоб перевірити, чи Cd регулює функцію BRD4 шляхом посилення зв’язування BRD4 з RelA-K310ac, взаємодія між RelA-K310ac і BRD4 була виявлена ​​за допомогою Co-IP. Дані на рис. 6A показали, що Cd значно посилив взаємодію між RelA-K310ac і BRD4 у клітинах NRK-52E, яка була послаблена лікуванням JQ1 або нокдауном BRD4. Також така ж тенденція спостерігалася в тканинах нирок щурів (рис. 6B). Ці результати демонструють, що Cd посилює зв’язування BRD4 з RelA-K310ac, що сприяє NF-κB-залежній транскрипції та згодом сприяє запальній відповіді, викликаній Cd.

4. Обговорення

Повідомлялося, що Cd є потенційним тригером запалення через його високу токсичність, тоді як точний механізм досі не повністю зрозумілий (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Наше дослідження підтвердило, що Cd індукує експресію запальних цитокінів у клітинах нирок щурів, і виявило, що BRD4, епігенетична мішень, яка виконує критичні функції в ряді клітинних процесів, включаючи запалення, сприяє запальній відповіді, викликаній Cd. Подальші експерименти показали, що BRD4 бере участь в активації сигнального шляху NF-κB, який сприяє Cd. Крім того, Cd підвищив рівень ацетилювання RelA K310, тим самим збільшуючи зв’язування BRD4 з ацетильованим NF-κB RelA для сприяння NF-κB-залежній транскрипції запальних цитокінів.

Запалення є одним із природних механізмів захисту від екзогенних хімічних речовин, тоді як неконтрольована та невідповідна запальна реакція може пошкодити нормальні тканини та спровокувати аутоімунні захворювання (Jian et al., 2018). Підвищені Cd біологічні маркери запалення часто асоціювалися з різними захворюваннями. Дослідження показали, що Cd-індуковане запалення бере участь в атерогенезі (Tinkov et al., 2018). Крім того, Cd сприяв експресії запальних цитокінів, які сприяли пошкодженню тканин легенів і яєчок і індукували гепатотоксичність (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Ці шкідливі ефекти узгоджуються з нашими результатами, що запальна відповідь бере участь у пошкодженні нирок, спричиненому Cd. Все більше досліджень зосереджено на механізмах виникнення Cd-індукованого запалення. Як добре вивчений член сімейства білків BET, BRD4 відіграє вирішальну роль у багатьох біологічних процесах, включаючи запалення. Тут використовували JQ1 (інгібітор BRD4) і siRNA для дерегуляції функціональної активності BRD4 і виявили, що інгібування BRD4 знижує індуковану Cd транскрипцію запальних цитокінів у нирках щурів, що свідчить про те, що BRD4 бере участь у запальній відповіді, викликаній Cd . Загальноприйнято вважати, що порушення регуляції експресії BRD4 є вирішальною подією у виникненні запальної відповіді. При травмі спинного мозку, патологічній гіпертрофії серця та інших захворюваннях, пов’язаних із запаленням, невпорядкована експресія BRD4 сприяла експресії запальних цитокінів (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Однак Cd не впливав на рівні експресії BRD4 в поточних експериментальних умовах, що змусило нас розглянути питання про те, чи BRD4 опосередковує Cd-спровоковану запальну відповідь через інші шляхи.

NF-κB є важливим регуляторним фактором у запальних процесах і відповідає за контроль експресії багатьох медіаторів запалення (Lawrence, 2009). Повідомлялося про дослідження, що BRD4 бере участь у регуляції сигнального шляху NF-κB. Хуан та ін. (2017) припустили, що BRD4 регулює IKK-опосередковану активацію NF-κB через шляхи p38 і JNK-MAPK. Wang та ін. (2019a) виявили, що нокдаун BRD4 або лікування JQ1 блокує активований ліпополісахаридом (LPS) сигнальний шлях NF-κB у мікроглії. Мен та ін. (2014) продемонстрували, що лікування JQ1 блокувало експресію запальних цитокінів шляхом пригнічення активації NF-κB в клітинах RAW 264.7, оброблених LPS. Ці звіти показали, що BRD4 опосередковує активацію NF-κB у багатьох моделях запалення, тоді як інгібування BRD4 є ефективним терапевтичним підходом до протизапальної дії. У поточному дослідженні інгібування BRD4 блокувало ядерну транслокацію NF-κB у тканинах нирок щурів, які зазнали Cd, і клітинах NRK-52E, що свідчить про те, що BRD4 опосередковує сигнальний шлях NF-κB, активований Cd.

Як правило, після активації NF-κB різними стимулами та транслокації в ядро, BRD4 зв’язується з ацетильованим NF-κB RelA на сайті K310, що підвищує його стабільність і транскрипційну активність у ядрі (Hajmirza et al., 2018). Таким чином, рівень ацетилювання RelA K310 впливає на регуляторну функцію BRD4 щодо запальної відповіді. У нейронах гіпокампу деацетилаза Sirt1 опосередковувала деацетилювання RelA K310 для регулювання експресії BACE1, що сприяло виробленню нейронального амілоїду (Flores-Leon et al., 2019). У клітинах гліобластоми фотодинамічна терапія стресом пригнічувала деацетилазу Sirt1 і активувала ацетилазу Ep300, що підвищувало рівні RelA-K310ac і призводило до підвищеного виробництва оксиду азоту, який сприяє виживанню (Fahey et al., 2019). Наше дослідження виявило, що Cd сприяє рівню ацетилювання RelA K310, збільшуючи експресію Ep300 і знижуючи експресію Sirt1, що вказує на те, що Cd впливає на регуляторну функцію BRD4 шляхом підвищення рівнів ацетилювання RelA K310.

Примітно, що наші результати показали, що лікування JQ1 було більш ефективним, ніж нокдаун BRD4, у полегшенні запальної реакції, викликаної Cd. JQ1 має високу спорідненість зв’язування з BRD4 і може майже повністю блокувати зв’язування BRD4 з хромосомою, тоді як siBRD4 може лише перешкоджати експресії білка BRD4, щоб зменшити зв’язування BRD4 з сайтом-мішенню, припускаючи, що BRD4 опосередковує запальний відповідь, викликаний Cd, може залежати від зв'язування з ацетильованим NF-κB RelA. Недавні дослідження показали подібний регуляторний механізм: після ядерної транслокації та активації NF-κB BRD4 потім взаємодіяв з ацетильованим RelA для коактивації транскрипційної активації NF-κB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 був залучений до цільових промоторів NF-κB у різних станах запальної стимуляції, тоді як лікування JQ1 діяло, запобігаючи зв’язуванню BRD4 з ацетильованим NF-κB RelA, таким чином знижуючи транскрипційну активність NF-κB (Zou et al., 2014). Наші результати показали, що інгібування BRD4 блокує Cd-посилену взаємодію між BRD4 і RelA-K310ac у нирках щурів, підтверджуючи наші вище результати про те, що інгібування BRD4 пригнічує Cd-індуковану транскрипційну активність NF-κB, що вказує на те, що Cd посилює зв’язування BRD4 з ацетильованим NF-κB RelA для збільшення транскрипції запальних цитокінів.

Підводячи підсумок, наше дослідження виявило регуляторні механізми BRD4 у викликаній Cd запальній відповіді в нирках щурів: (1) BRD4 опосередковує індуковану Cd ядерну транслокацію та активацію NF-κB. (2) Cd підвищує рівні ацетилювання RelA K310 і посилює зв’язування BRD4 з ацетильованим NF-κB RelA, що сприяє NF-κB-залежній транскрипції запальних цитокінів. Крім того, інгібування BRD4 значно пом’якшило рівень запальних цитокінів Cd, що свідчить про те, що цільовий BRD4 має потенціал для розробки як ефективного засобу лікування запальних захворювань, включаючи Cd-індукований нефрит.

Заява про авторський внесок CrediT

Zhongguo Gong: Концептуалізація, Методологія, Візуалізація, Формальний аналіз, Перевірка, Розслідування, Формальний аналіз, Керування даними, Написання – оригінальний проект. Gang Liu: Концептуалізація, Методологія, Візуалізація, Керування даними, Написання – оригінальний проект, Адміністрування проекту, Залучення фінансування. Венцзін Лю: програмне забезпечення, ресурси, методологія, формальний аналіз. Хуей Цзоу: адміністрування проекту, нагляд. Ruilong Song: програмне забезпечення, формальний аналіз, нагляд. Hongyan Zhao: програмне забезпечення, формальний аналіз, нагляд. Янь Юань: Нагляд. Jianhong Gu: Нагляд. Цзяньчунь Бянь: отримання фінансування, нагляд. Цзяцяо Чжу: Написання – перегляд і редагування, Керівництво. Цзунпін Лю: Написання – огляд і редагування, Керівництво,

Адміністрування проекту, залучення фінансування, концептуалізація.

Декларація конкуруючих інтересів

Автори заявляють, що у них немає відомих конкуруючих фінансових інтересів або особистих стосунків, які могли б вплинути на роботу, про яку йдеться в цій статті.

Подяка

Ця робота була підтримана Національним фондом природничих наук Китаю (№ 31872533, 31902329, 32072933), Національною ключовою програмою досліджень і розвитку Китаю (№ 2016YFD0501208) та проектом Пріоритетної академічної програми розвитку вищої освіти Цзянсу заклад (PADP). Рукопис було відредаговано одним або декількома висококваліфікованими англомовними редакторами ELIXIGEN для належної англійської мови, граматики, пунктуації, орфографії та загального стилю.

Список літератури

Алмір, Р.С., АльБашер, Г.І., Аларіфі, С., Алкахтані, С., Алі, Д., Абдель Монейм, А.Е., 2019. Маточне молочко послаблює нефротоксичність, спричинену кадмієм, у самців мишей. наук. Доповідь 9 (1), 5825.

Араб-Нозарі, М., Мохаммаді, Е., Шокрзаде, М., Ахангар, Н., Амірі, Ф.Т., Шакі, Ф., 2020. Спільний вплив нетоксичних рівнів кадмію та фтору викликає гепатотоксичність у щурів через викликаючи окисне пошкодження мітохондрій, апоптоз і шляхи NF-kB. Навколишнє середовище. наук. забруднення. рез. Міжн. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Порошок насіння пажитника пом’якшує спричинене кадмієм пошкодження яєчок і гепатотоксичність у самців щурів. Exp. Токсикол. патол. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting на Nrf2: як передача сигналів Nrf2 може впливати на терапевтичну активність інгібіторів білка BET. Біоесе 40 (5), 1800007.

Чі, К., Чжан, К., Лу, Ю., Чжан, Ю., Сю, С., Лі, С., 2021. Роль селенопротеїну S у формуванні позаклітинної пастки нейтрофілів, що залежить від активних форм кисню, індукованого селеном дефіцитний артеріїт. Redox Biol. 44, 102003 Дей, А., Ян, В., Гегонне, А., Нісіяма, А., Пан, Р., Ягі, Р., Грінберг, А., Фінкельман, Ф.Д., Пфайфер, К., Чжу, Дж ., Сінгер, Д., Чжу, Дж., Озато, К., 2019. BRD4 спрямовує розвиток гемопоетичних стовбурових клітин і модулює запальні реакції макрофагів. EMBO J. 38 (7)

Фагерберг, Б., нар, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Вплив кадмію пов’язаний з рецептором активатора плазміногену розчинної урокінази, циркулюючим маркером запалення та майбутніх серцево-судинних захворювань. Навколишнє середовище. рез. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Попередні сигнальні події призводять до підвищеного виробництва оксиду азоту, що сприяє виживанню, у фотодинамічно заражених клітинах гліобластоми. Вільний радикал. Biol. Мед. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Варіації різних метаболітів і важких металів у Oryza sativa L., пов’язані з хронічною хворобою нирок невідомої етіології в Шрі-Ланці. Хемосфера 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Індуковане пальмітиновою кислотою виснаження НАД (плюс) пов’язане зі зниженою функцією SIRT1 і підвищеною експресією BACE1 в нейронах гіпокампу. Нейрохім. рез. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Лікування кадмієм індукує ехінококоз, пошкодження ДНК, запалення та апоптоз у серцевій тканині білих щурів Wistar. Навколишнє середовище. Токсикол. Pharmacol. 59, 43–52. запалення і рак. Біопрепарати 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Гострий вплив кадмію викликає тривалий нейтрофільоз разом із затримкою індукції гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора в печінці мишей. Арк. Токсикол. 90 (12), 3005–3015.

Хоссейн-Ханназер, Н., Азізі, Г., Есламі, С., Альхассан Мохаммед, Х., Файяз, Ф., Хоссейнзаде, Р., Усман, А.Б., Камалі, А.Н., Мохаммаді, Х., Джадіді-Ніараг, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Вплив впливу кадмію на індукцію запалення. Імунофармакол. Імунотоксикол. 42 (1), 1–8.