Вплив тропісетрону на окислювальний стрес, SIRT1, FOXO3a та Claudin-1 у нирковій тканині діабетичних щурів, індукованих STZ

edmund.chen@wecistanche.com

Анотація

Тропісетрон є 5-антагоністом рецептора HT3, який має захисну дію проти DN. Метою цього дослідження було дослідити можливі молекулярні механізми, пов’язані з ренопротекторними ефектами тропісетрону у щурів із діабетом, індукованим STZ. Тварини були поділені на 5 рівних груп; контроль, тропісетрон, діабет, тропісетрон плюс діабет і глібенкламід плюс діабет (n=7). Для індукції цукрового діабету 1 типу тваринам одноразово вводили СТЗ (55 мг/кг, в/б). Щурів з діабетом лікували тропісетроном (3 мг/кг) і глібенкламідом (1 мг/кг) протягом 2 тижнів. Згідно з проведеним аналізом, цукровий діабет привів донирковий дисфункція (зниження швидкості клубочкової фільтрації та сечовини та креатиніну в сечі, а також підвищення рівня сечовини та креатиніну в плазмі) та аномалії в системі антиоксидантного захисту (зниження TAC та підвищення MDA), порівняно з контрольною групою, яким запобігав тропісетрон лікування. Кількісна полімеразна ланцюгова реакція зворотної транскрипції та вестерн-блоттинг продемонстрували, що експресія гена SIRT1 зменшилася, тоді як експресія генів FOXO3a та NF-κB, а також співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a та рівень білка claudin-1 зросли вниркадіабетичних щурів порівняно з контрольною групою. Тут результати цього дослідження показали, що лікування тропісетроном скасовувало ці зміни. Крім того, усі ці зміни порівнювали з тими, які викликав глібенкламід як позитивний контроль. Таким чином, тропісетрон покращивсяураження нироквнаслідок діабетичної нефропатії, ймовірно, шляхом пригнічення окисного стресу та зміни рівнів SIRT1, FOXO3a та клаудину-1.

Ключові слова:ураження нирок; функції нирок; захворювання нирок; нирка; тканини нирок

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ НИРКОВУ/НИРКОВУ НЕДОСТАТНІСТЬ

вступ

Діабетична нефропатія (ДН) — це мікросудинне захворювання, яке характеризується надмірною протеїнурією із захворюваністю 25–40 відсотків (Chen та ін. 2011; Ritz та ін. 2010). Морфологічні та функціональні зміни, включаючи гіпертрофію клубочків, надмірне накопичення позаклітинного матриксу та гломерулосклероз і, зрештою, втратуфункції нироквниркапов’язані з гіперглікемією і, як наслідок, порушенням метаболізму глюкози (Kanwar et al. 2008; Vikram et al. 2014). Тому особлива увага приділяється ефективному веденню або лікуванню, яке може бути необхідним для боротьби з хворобою на ранній стадії. Накопичення даних вказує на те, що утворення активних форм кисню (АФК) як пряма причина гіперглікемії, а згодом і утворення запальних цитокінів є основними механізмами розвитку діабетичних ускладнень (Beckman and Ames 1998; Giacco and Brownlee 2010; Jaimes et al. 2010). ; Кірітоші та ін., 2003). Очевидно, що дисбаланс між прооксидантною та антиоксидантною захисною здатністю призводить до накопичення вільних радикалів, які можуть пошкодити клітинні макромолекули, включаючи ДНК, а також модифікацію білка та перекисне окислення ліпідів (Peluso and Raguzzini 2016).

Сіртуїни ссавців є сімейством NAD плюс -залежних деацетилаз, що включає сім членів (SIRT1-7). Серед них SIRT1, перший член сімейства, був найбільш детально вивчений (Dong et al. 2014). Недавні дослідження показали, що SIRT1 відіграє важливу роль у регуляції клітинної смерті/довголіття, а також у відповіді на гострий і хронічний стрес у ссавців шляхом послаблення пошкодження ДНК, запалення та апоптозу (Hasegawa та ін. 2013; Yun та ін. 2012). ). Декілька досліджень вказують на більш високі рівні зниження регуляції активності SIRT1 у хворих на цукровий діабет.нирки,як in vivo, так і in vitro (Akhtar and Siragy 2019; Du et al. 2016; Kumar et al. 2014; Papadimitriou et al. 2015; Park et al. 2016; Shi and Huang 2018).

SIRT1 може здійснювати свою дію, регулюючи кілька білків, таких як фактори транскрипції ядерного фактора каппаВ (NF-κB) і родини FOXO (Brunet та ін. 2004; Langley та ін. 2002; Motta та ін. 2004; Yeung та ін. 2004). Нещодавно було повідомлено, що SIRT1 регулює метаболізм глюкози, сприяючи утворенню FOXO (Kobayashi et al. 2005). FOXO3a є підгрупою сімейства факторів транскрипції FOXO, які відіграють важливу роль під час окисного стресу (Accili and Arden 2004). Модифікації FOXO3a відбуваються шляхом фосфорилювання та ацетилювання, які можуть виникати одночасно в різних умовах. Відповідно до літератури, SIRT1 може деацетилювати FOXO3a, таким чином підвищуючи рівень його убіквітування та захищаючи від стресових факторів (Wang et al. 2017a). Існує мало інформації про механізм взаємодії між SIRT1 і FOXO під час гіперглікемічних станів (Yun та ін. 2012). Проте було припущено, що SIRT1 модулює активність FOXO, ймовірно, шляхом їх ядерної транслокації (Brunet et al. 2004), а також контролює ген-специфічну транскрипцію (Kobayashi et al. 2005). Таким чином, транслокація FOXO3a з цитоплазми в ядро ​​в основному спричинена активністю деацетилювання SIRT1, особливо в стані окисного стресу (Yun et al. 2012).

Wang та ін. повідомили, що лікування високим вмістом глюкози модулює експресію білків SIRT1 і FOXO3a у людининиркаепітеліальні клітини (Wang et al. 2017b). Крім того, FOXO3a функціонує як позитивний регулятор передачі сигналів NF-κB, у якому він може бути використаний для впливу на стратегії виживання клітин в умовах стресу (Li et al. 2012). Claudin-1 є передбачуваним маркером, специфічним для парієтальних епітеліальних клітин (PEC) (Huby та ін. 2009; Ohse та ін. 2009; Rincon-Choles та ін. 2006), який негативно асоціюється з експресією SIRT1 в обох проксимальних канальців і клубочкової області. Було показано, що зниження регуляції SIRT1 при діабеті підтверджується посиленням регуляції білка щільного з’єднання claudin-1 у подоцитах, що сприяє альбумінурії (Gong та ін. 2017; Hasegawa та ін. 2013). Оскільки окислювальний стрес, запальний цитокін та їхні молекулярні медіатори є основними темами шкідливого впливу діабету, антиоксиданти та протизапальні агенти можуть забезпечити нову терапію проти ДН (Elmarakby and Sullivan 2012).

Тропісетрон — нещодавно з’явився антагоніст 5-рецепторів НТ3, який було ідентифіковано як протиблювотний препарат під час хіміотерапії (Barzegar-Fallah та ін. 2015). Кілька звітів показали, що тропісетрон може мати антиапоптотичний, протидіабетичний, протипухлинний, протиліпідемічний, нейропротекторний і кардіопротекторний ефекти, які, ймовірно, опосередковані антиоксидантними та протизапальними механізмами (Aminzadeh 2017; Asadi et al. 2016; Barzegar-Fallah et al. 2015; Barzegar-Fallah та інші 2014; Gholizadeh-Ghaleh Aziz та інші 2019; Rashidi та Bazi 2020). Існують деякі дослідження, які підтверджують антиоксидантний ефект тропісетрону як in vitro, так і in vivo, наприклад, захисний ефект тропісетрону на спричинені гіперглікемією окислювальні порушення в клітинах PC12 (Aminzadeh 2017), полегшення пошкодження мітохондрій шляхом зниження нітрергічної активності. активність системи в мозку (Haj Mirzaian та ін. 2016), або послаблення окислювального стресу проти старіння мозку у мишей (Mirshafa та ін. 2020).

Нещодавно Barzegar Fallah та ін. виявлено, що тропісетрон покращує рівень глюкози в крові, а такожфункції нирокпро що свідчить зниження рівня азоту сечовини крові (BUN), рівня креатиніну сироватки та екскреції альбуміну з сечею. Крім того, вміст малонового діальдегіду (MDA), рівні глутатіону (GSH), активності супероксиддисмутази (SOD) і каталази (CAT) були виявлені. покращився у тварин із діабетом, які отримували тропісетрон (Barzegar-Fallah та ін., 2015). Однак немає інших вагомих доказів модуляції DN тропісетроном та її молекулярного механізму. Таким чином, це дослідження має на меті оцінити, по-перше, вплив тропісетрону на молекулярні медіатори, включаючи SIRT1, NF-κB і FOXO3a, а також клаудін-1, який є білком, який бере участь у тісних епітеліальних з’єднаннях і виконує роль головну роль внирковийдіабетична нефропатія; по-друге, порівняти дію тропісетрону зі стандартним проданим протидіабетичним препаратом, глібенкламідом, щоб знайти більш корисний і безпечний засіб як золотий стандарт протидіабетичного препарату.

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ ЗАХВОРЮВАННЯ НИРОК

Матеріали та методиЦе дослідження було проведено відповідно до Принципів догляду за лабораторними тваринами Університету медичних наук Урмія. Етичне схвалення було отримано згідно з Директивою ЄС 2010/63/EU щодо експериментів на тваринах відповідно до вказівок Комітету з медичної етики Міністерства охорони здоров’я Ірану (IR.UMSU.REC.1397.291). Тридцять п’ять щурів-самців лінії Wistar (вага 230–270 г, вік 3–4 місяці) були розподілені на 5 груп (по сім щурів у кожній групі): 1. Контрольна група: щури отримували фізіологічний розчин внутрішньочеревно протягом 2 тижнів. 2. Група тропісетрону: щури отримували тропісетрон внутрішньочеревно протягом 2 тижнів. 3. Група діабету: діабет був індукований ін’єкцією стрептозотоцину (STZ) у щурів. 4. Тропісетрон плюс група діабету: щури отримували 3 мг/кг тропісетрону (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) внутрішньочеревно протягом 2 тижнів після індукції діабету. 5. Група глібенкламід плюс діабет: щури отримували 1 мг/кг глібенкламіду (Gholizadeh-Ghaleh Aziz et al. 2019) внутрішньочеревно протягом 2 тижнів після індукції діабету.

Індукція діабетуСтрептозотоцин (50 мг/кг) вводили одноразово внутрішньоочеревинно для індукції діабету у щурів. На основі цього методу через 72 години після ін'єкції у щурів індукували діабет I типу. Діабет був діагностований і підтверджений шляхом створення незначної травми за допомогою ланцета в хвості голодних щурів, а потім краплю крові помістили на смужку глюкометра. Потім його вимірювали глюкометром (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN), і рівень глюкози в крові вище 300 мг/дл вважався показником індукції діабету. Через 2 тижні та 24 години перед анестезією щурів поміщали в метаболічні клітини одну за одною та збирали сечу. Потім зразки сечі відразу центрифугували з прозорою поверхнею зразків, які зберігалися при -20 градусах для аналізу сечовини та креатиніну. Після цього щурів зважували та анестезували шляхом внутрішньочеревної ін’єкції суміші кетаміну (60 мг/кг) і ксилазину (4 мг/кг). Потім розкривали черевну порожнину; кров брали із серця вузьким шприцом і змішували з етилендіамінтетраоцтовою кислотою (EDTA) і центрифугували при 4000×g протягом 20 хв. Потім отриману плазму зберігали при температурі -80 градусів для подальшого вимірювання сечовини, креатиніну та загальної антиоксидантної здатності (TAC). Обидваниркитварин вирізали, промивали холодною фізіологічною сироваткою та зважували. Ліворучниркатканини гомогенізували Ultra Turrax (T10B, IKA та Німеччина) у розчині, що містить РНКазу, щоб перевірити рівні експресії SIRT1, NF-κB та FOXO3a за допомогою методу ПЛР у реальному часі. правильнонирказаморожували при температурі -80 градусів для вимірювання MDA та вестерн-блот аналізу (загальний і фосфорильований FOXO3a і клаудин-1).

Рівень глюкози в крові натщеНаприкінці протоколу, після нічного голодування (від 14 до 18 годин), брали зразки крові з кінчика хвоста, а потім вимірювали рівень глюкози за допомогою цифрового глюкометра (Elegance, CT-X10, Франкенберг, Німеччина).Сечовина та плазма крові та креатинінЗ цією метою рівень сечовини та креатиніну в сечі та плазмі буде вимірюватися за допомогою економічних наборів, призначених для вимірювання сечовини та креатиніну (Biotechnical; Varginha, Minas Gerais, Brazil).Швидкість клубочкової фільтраціїШвидкість клубочкової фільтрації (СКФ) є найкращим загальним показникомфункції нирок, який оцінювався шляхом розрахунку кліренсу креатиніну (ШКФ=[UCr × V]/SCr) і використання концентрації креатиніну в плазмі та сечі, а також швидкості або об’єму сечі.

Малоновий діальдегід і загальна антиоксидантна здатністьMDA як кінцевий продукт перекисного окислення ліпідів оцінювали за допомогою реакції з тіобарбітуровою кислотою (Sigma-Aldrich; США) унирказразки згідно з протоколом виробника (Esterbauer and Cheeseman 1990). Коротко, 0.3–0,4 гтканини нирокгомогенізували в охолодженій льодом KCl (150 мМ) і потім центрифугували при 3000×g протягом 10 хв. Потім 0,5 мл супернатанту об’єднували з 3 мл фосфорної кислоти (1 відсоток, об’єм/об’єм) і після перемішування на вортексі до зразків додавали 2 мл 6,7 г/л ТБК. Зразки нагрівали при 100 градусах протягом 45 хв. Після охолодження на льоду н-бутанол (3 мл) об'єднували і продукти додатково центрифугували при 3000×g протягом ще 10 хв. Потім абсорбцію продуктів розглядали при 532 нм за допомогою спектрофотометрії. Рівень абсорбції порівнювали зі стандартною кривою. TAC вимірювали за допомогою набору загального антиоксидантного статусу Randox, у якому ABTS 2,2′-азино-біс(3-етилбензотіазолін-6-сульфонат) інкубували з пероксидазою та H2O2, що призвело до виробництва катіон-радикалу ABTS plus . Він має стабільний синьо-зелений колір, який оцінюється за допомогою 600-nm автоматичного аналізатора (Amini та ін. 2020).

CISTANCHE ПОКРАЩИТЬ БІЛЬ У НИРКАХ/НИРКАХ

Дизайн праймера та ПЛР у реальному часіРНК спочатку екстрагували відповідним набором (GENALL), а конденсовану РНК оцінювали якісно (електрофорез) і кількісно (нанокрапля), щоб забезпечити екстракцію РНК і застосування в наступних молекулярних методах. Потім відповідну кДНК синтезували з усіх екстрагованих зразків РНК. Праймери генів-мішеней і гена гліцеральдегіддегідрогенази (GAPDH) як гена господарювання досліджували на сайті NCBI за допомогою програмного забезпечення Generunner (додаткова таблиця). Потім експресію генів аналізували за допомогою синтезованих праймерів за допомогою ПЛР-набору з подальшим статистичним аналізом даних.

Вестерн-блотМетод Вестерн-блот використовувався для визначення рівнів білка FOXO3a (загального та фосфорильованого) та клаудин-1 унирка.Для виготовлення гелю для електрофорезу використовуються два гелі для розділення та укладання. Після приготування розчинного гелю та виливання його у форму через годину та після укладання додавали гель для укладання. Зразки завантажували в лунки, зроблені спеціальною гребінкою. Потім їх розділяли SDS-PAGE. Протягом години всі завантажені зразки були перенесені на мембрану PVDF. Згодом зразки блокували 5-відсотковим буфером знежиреного молока, включаючи 0,1 відсотка Tween 20, а потім інкубували з первинними антитілами протягом ночі при 4 градусах у шейкері-інкубаторі. Потім мембрани інкубували з вторинним антитілом, кон’югованим з пероксидазою хрону. Нарешті, бета-актин використовували як внутрішній стандарт для вестерн-блот аналізу. Наприкінці результати блоттингу зразків, залежно від рівня цільового білка, оцінювали на рентгенографічній плівці в темній кімнаті. Для кількісного визначення цільових білків результати сканування плівки обчислювали денситометром відносно рівня актину. Антитіла, які використовуються в аналізах Вестерн-блот, наведені в додатковій таблиці (каталожні номери та компанії).

Статистичний аналізРезультати були представлені як середнє значення ± SEM. Статистичний аналіз проводився за допомогою SPSS 16.0. Порівняння між групами оцінювали за допомогою тесту ANOVA з наступним тестом Tukey. Відмінності вважалися статистично значущими при P <>

Результати

Тропісетрон знижував рівень глюкози в крові натщесерце (мг/дл), масу нирок (г) та нирковий індекс (мг/г), водночас збільшував масу тіла (г) у щурів із діабетом, індукованим STZ.Подібно до попередніх досліджень у цій роботі, групи хворих на цукровий діабет показали серйозну (P < {{0}}.001)="" гіперглікемію="" порівняно="" з="" контрольною="" групою.="" споживання="" тропісетрону="" (p="">< 0,01)="" і="" глібенкламіду="" (p="">< 0,05)="" протягом="" 2="" тижнів="" суттєво="" знижувало="" рівень="" глюкози="" в="" крові="" в="" групах="" діабету,="" індукованого="" stz,="" але="" все="" ще="" було="" значно="" вищим,="" ніж="" у="" контрольній="" групі="" (p="">< 0,001).="" ).="" не="" було="" значної="" різниці="" у="" масі="" тіла="" (мт)="" між="" групами="" на="" початку="" цього="" дослідження="" (дані="" не="" показані).="" індукція="" діабету="" stz="" значно="" зменшилася="" (p=""><0,001) нарешті="" (bw)="" у="" діабетичних="">ниркавага (KW) спочатку не була значною серед груп; однак він був підвищений у групі діабетиків і зменшився після втручань.ниркаіндекс (KW/BW) був значно підвищений (P < {{0}}.001)="" у="" t1dm="" порівняно="" з="" контрольною="" групою.="" цікаво,="" що="" через="" 2="" тижні="" прийому="" тропісетрону="" та="" глібенкламіду="" квт/мв="" модулювався="" (p="">< 0,05)="" (табл.="">

Тропісетрон покращив біохімічний аналіз у щурів із діабетом, індукованим STZЯк і в попередніх дослідженнях, рівні сечовини в плазмі та сечі в групі діабетиків були значно вищими, ніж у контрольній групі (P < {{0}}.001).="" .="" у="" групі="" тропісетрону="" плюс="" діабет="" плазма="" (p="">< 0.{{10}}01)="" і="" сеча="" (p="">< 0.0="" 5)="" рівень="" сечовини="" значно="" знизився="" порівняно="" з="" показниками="" в="" групах="" діабету.="" проте="" сечовина="" все="" ще="" була="" значно="" нижчою,="" ніж="" у="" контрольній="" групі="" (p=""><0,01). немає="" істотної="" різниці="" в="" рівні="" сечовини="" в="" плазмі="" між="" тропісетроном="" і="" цукровим="" діабетом="" і="" контрольною="" групою.="" рівень="" креатиніну="" в="" плазмі="" (p=""><0,001) і="" сечі="" (p=""><0,05) показав="" значне="" підвищення="" у="" щурів="" з="" діабетом="" порівняно="" з="" контрольною="" групою.="" застосування="" тропісетрону="" значно="" знизило="" рівень="" креатиніну="" в="" сечі="" та="" плазмі="" крові="" (p=""><0,001) порівняно="" з="" групою="" хворих="" на="" діабет.="" у="" тварин="" із="" діабетом="" кліренс="" креатиніну="" як="" показник="" швидкості="" клубочкової="" фільтрації="" був="" достовірно="" нижчим,="" ніж="" у="" контрольній="" групі="" (р="">< 0,05).="" лікування="" тропісетроном="" значно="" підвищувало="" кліренс="" креатиніну="" порівняно="" з="" таким="" у="" групі="" діабету="" (p="">< 0,001).="" такі="" ж="" результати="" були="" отримані="" в="" групі="" лікування="" глібенкламідом.="" однак="" рівень="" сечовини="" в="" плазмі="" значно="" нижчий="" у="" групі,="" яка="" отримувала="" тропісетрон,="" порівняно="" з="" такою="" в="" групі,="" яка="" отримувала="" глібенкламід="" плюс="" діабет="" (p="">< 0,01)="" (табл.="">

Тропісетрон підвищував вміст TAC у плазмі та знижував рівень MDA у щурів із діабетом, індукованим STZРівень МДА в контрольній групі, тропісетрон, цукровий діабет, тропісетрон плюс діабет і глібенкламід плюс діабет становив 8,65 ± 1.01, 10.89 ± 1.6 35.54 ± 7,1, 18,76 ± 3,6 і 16,89 ± 4,1 нмоль/мг білка відповідно. Наше дослідження разом з дослідженнями інших продемонструвало найвищий рівень MDA у групі діабету, яка продемонструвала значне підвищення порівняно з контрольною групою (P < 0.00="" 1).="" рівень="" мда="" в="" групах="" тропісетрону="" плюс="" діабет="" і="" глібенкламід="" плюс="" діабет="" продемонстрував="" значне="" зниження="" (p="">< {{30}}.01)="" порівняно="" з="" групою="" діабету="" (рис.="" 1а).="" рівні="" tac="" у="" контрольній="" групі,="" групі="" тропісетрону,="" діабету,="" тропісетрону="" плюс="" діабет="" і="" глібенкламіду="" плюс="" діабет="" становили="" 0.65="" ±="" 0.{{40}}3,="" {{44}="" }.76="" ±="" 0.06,="" 0,26="" ±="" 0,08,="" 0,45="" ±="" 0,06="" і="" ​​0,57="" ±="" 0,08="" нмоль/мл="" відповідно.="" рівні="" tac="" знизилися="" в="" групі="" діабету="" порівняно="" з="" контрольною="" групою="" (p=""><0,001), як="" було="" показано="" раніше.="" введення="" як="" тропісетрону,="" так="" і="" глібенкламіду="" значно="" (p=""><0,01) підвищувало="" рівні="" tac="" у="" плазмі="" у="" тварин="" з="" діабетом="" порівняно="" з="" групою="" з="" діабетом="" (рис.="">

Тропісетрон збільшив SIRT1 і знизив експресію генів FOXO3a і NF-κB. Експресію генів оцінювали за допомогою ПЛР у реальному часі, що дало важливі докази різниці між групами. Відповідно, діабет асоціювався зі значним зниженням (0.65 ± 0.08) експресії гена SIRT1 (P < 0.01="" )="" і="" значне="" збільшення="" (p="">< 0.001)="" foxo3a="" (1,98="" ±="" 0.08)="" і="" nf-κb="" (1,71="" ±="" 0.14)="" експресія="" генів="" порівняно="" з="" контрольною="" групою.="" лікування="" тропісетроном="" підвищувало="" sirt1="" (0.88="" ±="" 0,3)="" і="" знижувало="" foxo3a="" (1,53="" ±="" 0,08)="" (p="">< 0,05)="" і="" nf-κb="" (1,27="" ±="" 0,03)="" (p="">< 0,01)="" рівні="" мрнк="" у="" діабетичних="" щурів="" (рис.="" 2a–c).="" подібні="" результати="" були="" отримані="" у="" тварин,="" які="" отримували="" стандартний="" препарат="">

Тропісетрон знижував експресію білка FOXO3a та клаудин-1Для оцінки експресії білка FOXO3a (загального та фосфорильованого) та клаудин- 1 після лікування тропісетроном і глібенкламідом було використано вестерн-блоттинг.ниркарізних груп. Аналіз даних демонструє значне збільшення співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a (4,6 ± 0.17) і клаудину-1 (3.02 ± 0.16 ) рівні білка в групі діабетиків порівняно з контролем (P < 0.001).="" введення="" тропісетрону="" помітно="" знизило="" співвідношення="" фосфорильованого="" foxo3a/загального="" білка="" foxo3a="" (2,14="" ±="" 0,31)="" і="" рівнів="" клаудину-1="" (2,4="" ±="" 0,12)="">ниркадіабетичних щурів (P < {{0}}.01).="" лікування="" глібенкламідом="" значно="" послаблювало="" як="" співвідношення="" фосфорильований="" foxo3a/загальний="" білок="" foxo3a="" (2,57="" ±="" 0,5)="" (p="">< 0,001),="" так="" і="" клаудин-1="" (2,2="" ±="" 0,11)="" (p="">< 0,05)="" )="" рівні="" білка="" у="" stz-індукованих="" діабетичних="" щурів="" (рис.="">

Обговорення Результати поточного дослідження наведені в наступних розділах: одноразова ін’єкція STZ-індукованого ЦД1 була пов’язана з тяжкою гіперглікемією, втратою ваги таниркадисфункція, яка проявляється вираженим підвищенням креатиніну та сечовини в плазмі та вираженим зниженням кліренсу креатиніну як показника ШКФ порівняно з контрольною групою. СТЗ порушує окислювальний баланс вниркатканини, що було доведено збільшенням MDA та зменшенням вмісту TAC. Подальший молекулярний аналіз показав, що діабет знижує мРНК SIRT1 і підвищує мРНК NF-κB, а також співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a та рівень білка claudin-1 униркасамців щурів. Значне поліпшення рівня сечовини, креатиніну, креатиніну

кліренс, а також мРНК SIRT1, мРНК NF-κB, співвідношення фосфорильований FOXO3a/загальний білок FOXO3a та білок клаудин-1, подібні до показників контрольних тварин, спостерігалися в групі тропісетрону з діабетом. DN, який характеризується декількома особливостями, такими як порушення внирковийструктурно-функціональної цілісності, підвищення вниркарозмір, а також клубочкова і тубулярна гіпертрофія є основною причиною термінальної стадіїзахворювання нирок(Singh et al. 2018; Yaribeygi et al. 2018). Прогресуюча альбумінурія, зниження ШКФ і підвищення артеріального тиску є найбільш вираженими функціональними симптомами, що спостерігаються у пацієнтів з діабетом (Alzahrani et al. 2020). Найбільш раннім маркером ДН є альбумінурія, яка спричинена прогресуючим пошкодженням клубочків як центральною ознакою ініціаціїураження нирок(Elsherbiny та ін. 2018). Згідно з нашими висновками, попередні дослідження показали, що ДН супроводжується підвищенням рівня креатиніну та сечовини в сироватці крові, що свідчить про дисфункціюниркова тканина(Шарма та ін. 2006; Танг та ін. 2018).

Накопичення даних вказує на те, що утворення вільних радикалів внаслідок гіперглікемії є ключовою подією у виникненні та прогресуванні діабетичних мікросудинних ускладнень, включаючи ДН. Надмірне виробництво АФК сприяє окислювальному пошкодженню, впливаючи на макромолекули, клітини та тканини, і призводить до незворотних інсультів або функціональних порушень (Kiritoshi et al. 2003).

MDA як маркер перекисного окислення ліпідів викликається атакою вільних радикалів на мембранні ненасичені жирні кислоти, які сприяють діабетичним ускладненням (Pieme et al. 2017). Загальний антиоксидантний статус оцінювали за TAC, який є біомаркером для визначення окислювального стресу при багатьох патологічних станах. Таким чином, порушення MDA і TAC у пацієнтів з цукровим діабетом відображають утворення вільних радикалів, які викликають стан окисного стресу (Peluso and Raguzzini 2016). Послідовно, результати цього дослідження показали збільшення MDA і зниження TAC у діабетичних щурівнирка. Враховуючи цей факт, ослаблення оксидативного стресу полегшувало діабетичні ускладнення, в т.ч.ураження нирок(Alzahrani та ін. 2020; Barzegar-Fallah та ін. 2015).

Тропісетрон, як 5-антагоніст HT3 з антиоксидантною та протизапальною діяльністю, виявляє захисну дію при кількох патологічних станах, таких як діабет (Barzegar-Fallah et al. 2015; Rashidi and Bazi 2020). Нефропротекторний ефект тропісетрону раніше був описаний в експериментах на тваринах. Згідно з цією точкою зору, тропісетрон покращував DN 5-незалежним від рецептора HT3 способом, запобігаючи підвищенню рівня глюкози в крові,нирковийРівні MDA, CAT, SOD, Gpx і TNF- та зниження екскреції цитокінів із сечею та альбумінурії (Barzegar-Fallah et al. 2015).

Відповідно до цього питання, у поточному дослідженні надано докази, які свідчать про те, що тропісетрон модулював гіперглікемію, втрату ваги та статус окисного стресу, що проявляється шляхом зниження MDA та збільшення вмісту TAC та покращенняниркадисфункція (значне зниження рівня сечовини і креатиніну в плазмі). Згідно з попередніми дослідженнями, глібенкламід застосовувався як стандартний препарат (Amini et al. 2020). Цікаво, що не спостерігалося істотної різниці у згаданих параметрах у групах, які вводили глібенкламід і тропісетрон,ниркадіабетичних щурів. Проте точні механізми захисного ефекту тропісетрону при ДН досі невідомі. Наскільки нам відомо, це перше дослідження, яке демонструє, що тропісетрон посилює експресію гена SIRT1 і знижує співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a, рівні NF-κB і білка claudin- 1 униркахворих на діабет тварин.

SIRT1 — це білкова деацетилаза III класу, яка бере участь у виживанні клітин у стресових умовах шляхом активації кількох ключових білків. Це важливий фактор для модуляції експресії генів у відповідь на генерацію АФК, таких як NF-κB і фактори транскрипції foxo (Brunet et al. 2004; Sengupta et al. 2011). Серед родини foxo передбачається, що FOXO3a відіграє важливу роль під час окисного стресу, посилюючи регуляцію кількох антиоксидантів, включаючи SOD та CAT

(Хасегава та ін. 2008; Копс та ін. 2002). Зокрема, інактивація FOXO3a була пов’язана зі зниженням регуляції окисного стресу, викликаного CAT, під час станів гіперглікемії (Wang et al. 2017b). SIRT1 керує активацією FOXO3a шляхом деацетилювання та прямо чи опосередковано модулює реакцію клітин на окислювальний стрес (Hori et al. 2013). Було оголошено, що існує функціональний зв’язок між SIRT1 і FOXO3 регуляцією системи антиоксидантного захисту, опосередкованої MnSOD (Tanaka та ін. 2009; Zhang та ін. 2015). Відповідно, Zhang et al. (2015) продемонстрували, що ікаріїн захищає гостре ураження легенів, спричинене кишковою ішемією/опосередкованим реперфузією сигнальним шляхом SIRT1/FOXO3 шляхом посилення експресії MnSOD. Попередні звіти також вказували на те, що підвищення регуляції SIRT1 полегшує нефропатію, спричинену цисплатином,нирковийішемічне/реперфузійне пошкодження та діабетична нефропатія (Funk та Schnellmann 2013; Gu та ін. 2016; Kim та ін. 2011). Примітно, що індуковане діабетом зниження регуляції SIRT1, яке спричиняє патофізіологічні зміни, призводить донирковийтоксичність (Wang et al. 2017b). Хасегава та ін. (2013) продемонстрували, що зниження SIRT1 у проксимальних канальцях викликає ініціацію ДН і призводить до альбумінурії. Відповідно, результати цього дослідження виявили зниженнянирковийЕкспресія гена SIRT1 у групі діабетиків. Таким чином, активація SIRT1 викликала резистентністьнирковийканальцевих клітин до клітинного стресу (Kume et al. 2013). Загалом, активатори SIRT1 привернули значну увагу як цікаві кандидати для терапії діабету (Song et al. 2018)

Крім того, дане дослідження також показало виражену запальну реакцію у діабетиківниркипро що свідчить підвищення NF-κB. Це важливий регулюючий фактор, пов’язаний з імунною відповіддю та запаленням (Hayden and Ghosh 2012). У відповідності з результатами цього дослідження кілька досліджень повідомляють про те, що активація NF-κB і його ядерна транслокація посилюються як в експериментальній, так і в людській ДН (Alzahrani та ін. 2020; Kuhad і Chopra 2009). Крім того, підвищення SIRT1 сприяє інактивації NF-κB для порятунку подоцитів від пошкоджень у діабетиківнирка(Лю та ін. 2014). Цікаво, що надмірна експресія SIRT1 послаблює експресію білка в тісних епітеліальних з’єднаннях, а саме клаудин-1, у щурів з гіперглікемією, що корелює з рівнем протеїнурії. Активований клаудин-1 у подоцитах погіршує функцію клубочкового бар’єру через зниження експресії синаптоподіну або подоцину, що призводить до альбумінурії (Hasegawa et al. 2013). Ці висновки також були підтверджені в нирках щурів з діабетом.

Тут було вперше продемонстровано, що за умов діабету введення тропісетрону призвело до посилення експресії гена SIRT1 і одночасного зниження співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a, рівня NF-κB і білка claudin-1. Отже, цілком логічно, що така активація в SIRT1 і подальше зниження співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a, NF-κB і клаудину-1 частково можуть бути відповідальними за покращення в діабетичнийфункції нирок. Дослідники повідомили, що захисні ефекти тропісетрону при DN не залежать від 5-рецепторів HT3, оскільки гранісетрон, інший селективний блокатор 5-рецепторів HT3, не захистив DN. Було заявлено, що антиоксидантні та протизапальні механізми тропісетрону можуть відігравати вирішальну роль униркова тканиназахист при діабеті (Barzegar-Fallah et al. 2015). Нещодавно наша лабораторія виявила, що лікування тропісетроном збільшило секрецію інсуліну та знизило рівень глюкози в крові шляхом підвищення експресії гена GLUT2, а також шляху UCP2/ZnT8 (Naderi та ін. 2020). Тропісетрон як блокатор 5-рецептора HT3 збільшував вивільнення інсуліну з лінії бета-клітин підшлункової залози, що продукує інсулін, що призводило до гіпоглікемії (Heimes et al. 2009). Таким чином, здається, що модулювання вивільнення інсуліну і, згодом, гомеостазу глюкози може брати участь у антиоксидантних і протизапальних реакціях, сприяючинирказахисту.

Згідно з поточними висновками, тропісетрон зменшив окислювальне пошкодження шляхом збільшення експресії гена SIRT1 під час старіння у мишей (Mirshafa et al. 2020). Крім того, у печінці щурів із цукровим діабетом після спільного лікування тропісетроном спостерігалося ослаблення рівня ураження печінки, TNF- та білка IL-6 (Amini та ін., 2020; Gholizadeh-Ghaleh Aziz та ін., 2019). Крім того, у цьому дослідженні тропісетрон продемонстрував подібну реакцію на стандартний препарат, глібенкламід. Відповідно, вплив глібенкламіду збільшив SIRT1 і знизив співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a, рівні NF-κB і клаудину-1 у діабетиківниркиу поточному дослідженні. Глібенкламід є відомим лікарським засобом, який широко використовується для лікування хворих на цукровий діабет шляхом інгібування АТФ-чутливих K+ каналів. Оскільки були отримані деякі суперечливі результати щодо ефекту глібенкламіду при ДН (Akbar та ін. 2013; Elmalí та ін. 2004; Nakamura та ін. 2000), ймовірно, через дозування або тривалість лікування, ця подія стала мотивацією для введення новий препарат для хворих на діабет як безпечний і ефективний засіб з меншою кількістю побічних ефектів

В цілому тропісетрон ефективно покращує станфункції нироку DN, ймовірно, шляхом зміни експресії SIRT1, співвідношення фосфорильованого FOXO3a/загального білка FOXO3a, NF-κB і клаудину-1. Це дослідження мало певні обмеження щодо підтримки цього предмета. Наприклад, морфологічні дослідження мають спробувати надати додаткові докази для підтвердження поточного дослідження. Крім того, дослідники не використовували молекулярні інгібітори для перевірки точного механізму сигнального шляху.

Висновок

Підсумовуючи, результати цього дослідження показали нефропротекторний ефект тропісетрону при СД1, спричиненому STZ. Варті уваги результати цього дослідження показали, що нефропротекторний ефект тропісетрону, можливо, включав зміни в експресії SIRT1, FOXO3a, NF-κB і клаудіну-1. Ці дані можуть бути стимулом для подальших досліджень у цій галузі.