Центральна роль трансформуючого фактора росту (TGF-) у розвитку фіброзу нирок
Mar 26, 2022
Контакт: Одрі Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Електронна пошта:audrey.hu@wecistanche.com
ЧАСТИНА Ⅰ: Роль первинних ниркових фібробластів людини в TGF- 1-опосередкованих пристроях, що імітують фіброз
Сон Хе Хван, Юн Мі Лі та ін.
1. Введення
Фіброз нирок, остаточний загальний шлях незліченних прогресуючих захворювань нирок, характеризується збільшенням виробництва протеїну позаклітинного матриксу (ECM), зниженням деградації матриксу, дисфункцією взаємодії між клітинами та матриксом, трансформацією резидентних клітин і запальною клітинною інфільтрацією.Трансформуючий фактор росту-(TGF-) є багатофункціональним димерним пептидом, який регулює біологічні процеси, такі як клітинна проліферація, диференціація та імунологічні відповіді [1]. Серед численних фіброгенних факторів TGF- (Трансформуючий фактор росту-) відіграє центральну роль і має протизапальну дію. TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)-дефіцитні миші гинуть від масивного запалення. Трансгенні миші з надмірною експресією TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)практично захищені від розвитку фіброзної патології нирок, головним чином завдяки своїй протизапальній активності [2]. Профібротичні та протизапальні властивості TGF-(Трансформуючий фактор росту-)є палицею з двома кінцями щодо терапевтичного застосування TGF-(Трансформуючий фактор росту-)гальмування. Були докладені значні зусилля, щоб перешкодити TGF-(Трансформуючий фактор росту-)дії, щоб перешкодити прогресуваннюнирковийфіброз[3]. Хоча для боротьби було використано багато підходівнирковийфіброз, експериментальна модель для оцінки наявних ліків не є ідеальною.
цистанхея трава запобігаєзахворювання нирок
Загалом дослідження на тваринах відіграють ключову роль у доклінічних випробуваннях у прогнозуванні фармакокінетики та ефективності ліків. Однак існують різні відмінності між тваринами та людьми, що змушує нас поставити під сумнів точність тестів на ефективність і безпеку ліків на тваринах 4. Попередні звіти залежали від доклінічних досліджень на тваринах під час розробки ліків для оцінки нефротоксичності та безпеки ліків. Функціонування нирок тварин більш ніж вдвічі перевищує функцію нирок людини. Отже, ліки метаболізуються швидше у тварин, ніж у людей, що ускладнює з’ясування результатів тестів на токсичність ліків за допомогою досліджень на тваринах. Крім того, результати експериментів на тваринах не можна використовувати для прогнозування реакції на ліки у людей, оскільки тварини мають різні фізіологічні функції. На основі тваринфіброз нирокмоделі мають труднощі у відтворенні людинифіброз нирок; отже, ведуться дослідження, щоб подолати поточні перешкоди та оптимізувати платформи для відкриття ліків [5].
Технологія «орган-на-чіпі» (OoC) стала новою концепцією для вирішення цих проблем. Ця платформа була розроблена з урахуванням поточних недоліків, і вона показала великі перспективи в галузі нефрології [6]. Крім того, OoC-моделі мають великий потенціал як заміна експериментальним моделям тварин, забезпечують вирішення міжвидових відмінностей і можуть допомогти покласти край жорстокому поводженню з тваринами та етичним суперечкам [7]. Існує кілька моделей in vitro, які одночасно використовують первинні ниркові фібробласти з ендотеліальними та епітеліальними клітинами, які є важливими клітинами вниркафіброз. Роль кожної клітини вфіброзвивчається окремо; однак відомості про взаємодію клітин обмежені.
У цьому дослідженні ми розробилифіброз-імітаційні пристрої з використанням первинних фібробластів людини. Ми підтвердили, що TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)Лікування має різний вплив нафіброз нирокмодель. Примітно, що фібробласти відіграють ключову роль як ефекторні клітини, сприяють утворенню профіброзного мікрооточення та секретують фактори росту та цитокіни. Таким чином, на основі цього нового методу фібробласти можуть стати ідеальною системою клітинної моделі для вивчення захворювань нирок. Ми оцінили, чи фібробласти, отримані від фіброзного захворювання нирок, впливають на цілісність клітин, культивованих у трьох вимірах (3D). Нарешті, ми представляємо доказове дослідження принципу, яке демонструє потенціал людинифіброз нирок-імітаційні пристрої як модель для прогнозування реакції людинифіброз нирок.
ефекти цистанхи: лікування ниркової інфекції
2. Результати
2.1. Ідентифікація альфа-актину гладких м’язів (a-SMA) і кератину-8(KRT-8) TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)у клітинках HK-2
На ранній стадії ми досліджували відомі маркерифіброзі цитоскелет у двовимірних (2D) культурах. Імунофлуоресцентний аналіз фарбування проводили для оцінки експресії -SMA фіброзу та маркера переходу канальцевого епітелію в мезенхіму (EMT) і рівнів KRT8 як маркера цитоскелету. Імунофлуоресцентне фарбування показало, що експресія -SMA спочатку була слабкою, а рівні KRT8 були високими в моношарових епітеліальних клітинах HK-2. Не було суттєвої зміни інтенсивності флуоресценції TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)(5 нг/мл) або обробка специфічним інгібітором епітеліальних клітин HK-2 протягом 24 годин (рис. 1).
Рисунок 1. Імунофлуоресценція показує, що експресія альфа-SMA та кератину-8(KRT8) підтримувалася лікуванням TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або інгібітор у клітинах HK-2.(A) Експресія альфа-SMA та (B)CCK-8 не мала впливу на HK-2клітини TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)(5 нг/мл) або інгібітор. Клітини спочатку висівали з щільністю 1×10 градусів на лунку (ac) необробленого контролю та （df）стимулювали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-) або（gi）10 мкМ інгібітора（SB431542） протягом 24 годин і фіксують 4% параформальдегідом. Потім клітини фарбували анти- -SMA та анти-цитокератином-8 протягом 20 хв. Проводили спільне фарбування барвником Hoechst H33342 для ідентифікації клітинних ядер. Масштабні шкали на мікрофотографіях вказують на 200 мкм.
порошок цистанки покращує роботу нирок
2.2. Експресія KRT8 знижена TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)на чіпі
Далі ми оцінили рівні експресії -SMA та KRT8 у 3D-культивованому HK-2 та загальну довжину GFP-ендотеліальних клітин пупкової вени людини (HUVEC), оброблених TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)і специфічний інгібітор. Щоб досягти цього, ми спочатку створили структуру тканинного чіпа, що складається з двох типів клітин: епітеліальних клітин HK-2 і GFP-HUVEC. Після підтвердження конструкції ми оголили тканинний чіп TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)(5 нг/мл) або специфічний інгібітор (10 мкм SB431542) протягом 24 год.
Як показано на рисунку 2A-C, експресія -SMA не була спеціально змінена TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або лікування специфічним інгібітором. Однак експресія KRT8 була знижена в двоклітинному чіпі спільного культивування. Крім того, додавання інгібітора TGF-ß1 посилило експресію KRT8.
Ми досліджували формування тривимірної трубчастої капілярної мережі TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування в HUVEC, оскільки ендотеліальні клітини можуть спонтанно утворювати тривимірну трубчасту капілярну мережу. Відповідно до наших культурних умов утворення товстих ліній було значно зменшено. Однак капілярно-подібні тонкі лінії були збільшені в TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)оброблені GFP-HUVEC. У випадку TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування інгібіторами на 3D-культивованому чіпі, загальна довжина товстих і товстих ліній показала зворотну тенденцію до TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування. Спостерігалося збільшення довжини товстої лінії порівняно з контрольною групою без лікування. Подібна картина спостерігалася в діаметрі товстої лінії в GFP-HUVEC після TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування та лікування інгібіторами. Діаметр GFP-HUVEC був пригнічений TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування, але збільшений незалежно від товщини лінії інгібітором порівняно з контролем і TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-). Загальна довжина та діаметр товстої лінії різко збільшилися під час лікування інгібітором TGF- 1 порівняно з необробленим контролем та лікуванням TGF- 1. Примітно, що отримані результати свідчать про збільшення щільності дрібних судин у TGF-(Трансформуючий фактор росту-)групу, що отримувала лікування, порівняно з нелікованими аналогами. Навпаки, щільність товстих судин у TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування була нижчою, ніж у контрольній групі без лікування (рис. 2D, E).
Рисунок 2. Експресія KRT8 у HK-2 та загальна довжина та діаметр HUVEC.(A) Імунофлуоресценція показує, що експресія -SMA зберігалася, а експресія KRT8 була різко знижена під час лікування TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)у HK-2. Клітини висівали та стимулювали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або 10 мкм інгібітора (SB 431542) протягом 24 годин і фіксують 4% параформальдегідом. Клітини фарбували анти- -SMA та антицитокератином-8 протягом 20 хв. Проводили спільне фарбування барвником Hoechst H33342 для ідентифікації клітинних ядер. Експресія -SMA(ac) не змінювалася, але експресія KRT8(df) у клітинах HK-2 і GFP у HUVEC (gi) були значно змінені TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)(5 нг/мл) та інгібітор (B, C). У загальній довжині HUVECs тонка судина була збільшена, але товста судина була зменшена TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-). Діаметр збільшували як у тонких, так і в товстих посудинах. Ці результати були скасовані інгібітором SB431542 (D, E). Масштабні шкали на мікрофотографіях означають 100 мкм.*стор<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
для чого використовується цистанх: лікування хронічних захворювань нирок
2.3. TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)Впливає на три типи клітин мікросхеми з багатокамерною структурою
Для вивчення TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)відповідей запропонованого 3D-чіпа, ми провели імунне фарбування кожного компартменту окремо (рис. 3). У цьому аналізі використовувалися первинні ниркові фібробласти людини. Зразки були проаналізовані за допомогою FACS і підтверджені як позитивні на антитіла до маркера фібробластів. Після інкубації трьох типів клітин із TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)протягом 24 годин проводили імунне фарбування для оцінки експресії -SMA і KRT8. Експресія a-SMA посилювалася під час лікування TGF-1, а протилежні результати спостерігалися з TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування інгібіторами. І навпаки, експресія KRT8 знижувалася TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)і показали протилежну відповідь на TGF-(Трансформуючий фактор росту-)інгібітор (рис. 4A-C).
Малюнок 3. Приклад зображення зі схематичною демонстрацією пристрою виготовлення та графіком експериментів.(A) Два верхні зображення показують макет. На лівому зображенні показано загальне фото пристрою зверху вниз. На нижніх зображеннях показано поперечний розріз. Схематичний вигляд із детальним описом розмірів рідинних напрямних. (B) Цей малюнок описує експериментальні графіки дляфіброз- імітаційні пристрої. Чотирьохетапний процес завантаження для кожної лунки. Розташування кожної ділянки візерунка гідрогелю, а також розміщення носія зверху вниз та в ізометричному перерізі. (1) Загалом 1,5 мкл гідрогелю 1 спонтанно направляється в центральний канал. (2) Центральний канал заповнений 5 мкл гідрогелю. (3) Загалом 10 мкл гідрогелю 3 нанесено на дно резервуара. （4）Видається загалом 200 мкл середовища. Червона шкала =9 мм.
Як показано на малюнку 4D-G, довжина капілярної тонкої лінії була значно збільшена TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування в GFP-HUVEC. Однак товщина товстої лінії була зменшена в TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)оброблені HUVEC. Діаметр було зменшено в середньому для тонких і товстих судин у HUVEC. У випадку TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування інгібітором на 3D-культивованому чіпі, загальна довжина товстих і товстих ліній показала протилежну тенденцію до обробки TGF- 1. Крім того, довжина товстої лінії була збільшена порівняно з необробленою контрольною групою.
Рисунок 4. Зміна 3D-культивованих HK-2 і HUVEC з первинними нирковими фібробластами.Загальну кількість клітин висівали з щільністю 5×10 градусів на 3D-чіп і стимулювали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або 10 мкм інгібітора (SB 431542) протягом 24 годин і фіксують 4% параформальдегідом. (A) Клітини в 3D-чіпі були пофарбовані анти-o-SMA та анти-цитокератином-8. Експресія -SMA (ac) була підвищена, а експресія KRT8(df) була значно знижена TGF- 1(5 нг/мл). Загальна довжина HUVEC; тонкі судини різко збільшилися, а товсті судини зменшилися під дією TGF-ß1(Трансформуючий фактор росту-)（D, E). Діаметр зменшено для тонких і товстих посудин (F, G). Ці результати були скасовані інгібітором SB431542. Масштабні шкали на мікрофотографіях означають 100 мкм.*стор<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Модулює медіатор запалення та фактори росту
Далі ми досліджували запальні цитокіни та фактори росту в супернатанті; IL-1 , FGF-2, TGF- 2(Трансформуючий фактор росту-)і TGF- 3(Трансформуючий фактор росту-)секреція білка була значно вищою в 3D-культивованих чіпах, ніж у 2D-культивованих фібробластах, навіть якщо вони мали однакову загальну кількість клітин. Однак TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-) рівні були подібними, оскільки 2D- або 3D-культивовані моделі обробляли подібними концентраціями TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)(Малюнок 5A-E). Зокрема, вивільнення FGF-2 із первинних ниркових фібробластів людини становило 20,9 ± 0,4 пг/день/5×10 градусів клітин двовимірної одношарової культури та 3094,8±0,2 пг/день/5×10 градусів клітин, включаючи HUVEC і HK-2 3D-культивованого чіпа в необробленому контролі. Секреція FGF-2 TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)стимуляція становила 31.0±0.2 пг/день/5×10 градусів клітин для 2D культури та 3683,9± 0.8 пг/день/5×10 градусів клітин для 3D -культивований чіп. Це збільшення виробництва білка FGF-2 у двовимірній моношаровій культурі відбувалося паралельно зі збільшенням у 3D-культивованій моделі чіпа за допомогою TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування (Малюнок 5B).
Рисунок 5. Порівняння 2D- і 3D-культивованих моделей як платформ, що імітують фіброз нирок.Клітини висівали з щільністю 5×10 градусів на 2D-лунку або 3D-чіп і стимулювали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або 10 мкм інгібітор (SB 431542) протягом 24 год. Первинні ниркові фібробласти людини використовували в моделі 2D-культивування та 3D-культивування. Фібробласти використовували при щільності 8×10*, культивовані з HUVEC та HK-2. Первинне співвідношення ниркових фібробластів людини до HUVEC, або співвідношення F:H, становило 1:5 для оцінкифіброзКлітини .HK-2 використовували з щільністю 2×104. Виявлення (A)IL-1, (B)основного фактора росту фібробластів (FGF-2) і (CE)TGF-бета 1, 2 і 3 у супернатанті проводили за допомогою мультиплексного аналізу цитокіни та мультиплексний імуноаналіз. Кожен стовпчик представляє середнє значення ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Трансформуючий фактор росту-).
Переваги cistanche tubolosa: лікування захворювань нирок
Крім того, ми оцінили експресію мРНК прозапальних цитокінів, таких як IL-1, IL-6, IL-8 і TNF-. Результати були значно знижені рекомбінантним людським TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування в 3D-культивованому чіпі як протизапальну властивість TGF-(Трансформуючий фактор росту-). Ми виявили, що TGF посилює експресію мРНК- 1(Трансформуючий фактор росту-)інгібітор (SB431542). Крім того, опосередкована інгібіторами експресія IL-6, IL-8 і TNF- була специфічно знижена порівняно з необробленим контролем (рис. 6A-D). Рівень мРНК VEGF, фіброзного фактора, значно підвищувався TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)лікування. Рівень мРНК VEGF знижувався інгібітором TGF- 1 (рис. 6E), тоді як експресія мРНК IL-10 з антифіброзним ефектом була знижена у фіброзних станах, індукованих TGF- 1 . Навпаки, експресія I-10мРНК була збільшена під час обробки інгібітором TGF- 1 (рис. 6F).
Рисунок 6. ПЛР у реальному часі показує загальну експресію мРНК 3D-чіпа.Клітини висівали з щільністю 5×10 градусів на 3D-чіп і стимулювали 5 нг/мл TGF- 1(Трансформуючий фактор росту-)або 10 мкм інгібітора (SB431542) протягом 24 год. Загальна РНК, виділена з 3D-культивованого чіпа. Експресія мРНК (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 та (D)IL-8 представляє протизапальну дію TGF{ {10}}(Трансформуючий фактор росту-)лікування. Експресія (E)VEGF як ангіогенного фактора була підвищена. Експресія (F)IL-10 як антифіброзного фактора була значно знижена TGF- 1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Трансформуючий фактор росту-).
