Антиапоптоз подоцитів і проапоптоз мезангіальних клітин для телмісартану в полегшенні діабетичного ураження нирок

АНОТАЦІЯ

Пошкодження подоцитів і розширення мезангіальних клітин є двома важливими патологічними проявами ушкодження клубочків на ранніх стадіях діабету. Телмісартан, як інгібітор рецептора ангіотензину типу 1 (AT1), може покращити продукти кінцевого глікування (AGE) або індуковане ангіотензином Ⅱ (Ang Ⅱ) пошкодження подоцитів, включаючи відшарування або апоптоз. У цій поточній статті ми вперше підтвердили захисний ефект телмісартану щодо раннього діабетичного ураження нирок у щурів з діабетом 1 типу. Телмісартан зменшував втрату подоцину та пригнічував експресію -SMA, відображаючи його захисну дію на пошкодження подоцитів і мезангіальну проліферацію відповідно. Більш цікаво, що ми спостерігали протилежну дію телмісартану на життєздатність клітин і апоптоз подоцитів і мезангіальних клітин у середовищі з високим вмістом глюкози in vitro. Антиапоптотична дія телмісартану на подоцити може бути пов’язана з його пригніченням експресії свіпросину-1 (білка, який може опосередкувати високий рівень індукованого глюкозою апоптозу подоцитів). Хоча телмісартан індукував високу експресію PPAR у мезангіальних клітинах, а GW9662 (антагоніст PPAR) частково пригнічував індукований телмісартаном апоптоз і знижував життєздатність мезангіальних клітин. Крім того, висока індукована глюкозою експресія PKC 1/TGF 1 у мезангіальних клітинах може блокуватися телмісартаном. Ці дані забезпечують більш точний клітинний механізм виявлення захисного ефекту телмісартану при діабетичному ураженні нирок.

КЛЮЧОВІ СЛОВА

діабетична хвороба нирок, подоцити (MeSH: D050199), мезангіальні клітини, телмісартан (PubChem CID: 65, апоптоз

Натисніть тут, щоб купити продукцію Cistanche

ВСТУП

Діабетична хвороба нирок (ДЗН), добре відома як хронічна хвороба нирок, спричинена цукровим діабетом (ЦД) типу 1 або 2 (Podgórski та ін., 2019), може погіршити швидкість клубочкової фільтрації (ШКФ) поступово знижується, а потім з часом розвивається до кінця. -стадія ниркової недостатності (Hou та ін., 2018; Ruiz-Ortega та ін., 2020; Експертна група Китайського товариства нефрології, 2021). Існує два механізми, які опосередковують гіперглікемію через пошкодження подоцитів нирки та зміни базальної мембрани клубочків (GBM), спричинені розширенням або проліферацією мезангіальних клітин (Anders et al., 2018).

Подоцити — це спеціалізовані вісцеральні епітеліальні клітини, що вистилають зовнішній шар GBM, міжпальцевими міжпальцевими відростками ніжки, утворюючи основний бар’єр для запобігання втраті білка з сечею (Podgórski та ін., 2019). Кількість і/або щільність кожного клубочка вивчали у пацієнтів із ЦД (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Пошкодження подоцитів сприяє втраті їх адгезивних властивостей і є основною причиною розвитку DKD (Podgórski et al., 2019). Іншою помітною характеристикою подоцитів є те, що зрілі подоцити є обмежено проліферативними клітинами (Podgórski et al., 2019), (Griffin et al., 2003). Втрата подоцитів призводить до проліферації мезангіальних клітин, однак більш значні втрати призводять до фіброзу клубочків і збільшення протеїнурії внаслідок подальшого оголення GBM (Fukuda et al., 2012). Поганий глікемічний контроль призводить до подоцитопатії (Anders et al., 2018), морфологічних змін, що характеризуються гіпертрофією подоцитів, епітеліально-мезенхімальної трансдиференціації подоцитів (Chang et al., 2017), відшарування подоцитів (Zhang et al., 2020), апоптозу подоцитів ( Wang et al., 2018a) і втрата подоцитів, що призводить до прогресуючих аберацій подоцитів, призводить до відшарування GBM з наступним гломерулосклерозом.

Мезангіальні клітини мають значний вплив не лише на регулювання клубочкової та внутрішньоклубочкової циркуляції, але й на збереження клубочків, наприклад на захист ендотеліальних клітин клубочка та відтік речовин із сироватки та рідини з мікросудин (Wakisaka et al., 2021). Потовщений GBM і розширений мезангіальний є помітними гломерулярними порушеннями при діабеті (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Потовщення GBM є ранньою гістопатологічною ознакою DKD і на нього впливають аномальний надходження та зміна позаклітинного матриксу, що секретується ендотеліальними клітинами та подоцитами (Anders et al., 2018). Гіперглікемія спонукає мезангіальні клітини до проліферації та виготовлення матриксу (Kriz et al., 2017) через активацію трансформуючого фактора росту (TGF), який безпосередньо спричиняє транскрипційну активацію матриксних колагенів (Ziyadeh et al., 2000), що сприяє розширенню мезангіальної тканини. матриця.

Раннє втручання з гіпоглікемічним та антигіпертензивним лікуванням є корисним для затримки виникнення та розвитку DKD (Martins and Norris, 2001). У дорослих із нормальним артеріальним тиском із ЦД та альбумінурією особливо рекомендований інгібітор ангіотензинперетворювального ферменту (АПФ) або блокатор рецепторів ангіотензину (БРА) (Liew et al., 2020). Блокада ренін-ангіотензинової системи покращує експресію ANGPTL2 та інтегрину, які підтримують клубочковий бар’єр (Tawfik et al., 2021). Причина, по якій було обрано телмісартан, полягає в тому, що він описаний як більш ефективний, ніж інші БРА-препарати, щодо пом’якшення протеїнурії (Naruse та ін., 2019; Гуо та ін., 2020). Крім того, телмісартан може зменшити спричинену цисплатином нефротоксичність, таку як апоптоз подоцитів і рівні експресії білка, пов’язані з аутофагією (Malik et al., 2015). Дивовижно те, що телмісартан має такі характеристики, враховуючи його подвійну роль у блокуванні рецепторів AT1 і властивість часткового агонізму гамма-рецепторів, активованих проліфератором пероксисом (PPAR) (Balakumar et al., 2012). Метою цієї статті було вивчити захисний вплив телмісартану на пошкодження подоцитів і мезангіальне розширення на ранній стадії ЦД 1 типу відповідно.

Порошок цистанчі

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

1. Тварини

Самці щурів SD були придбані у SLRC Laboratory Animal Ltd. (Шанхай, Китай). Щурів утримували при контрольованій температурі 22 ± 2 градуси C, відносній вологості 50–60 відсотків, 12-годинні цикли світла та 12-годин темряви (світло, 08:00–20 :00, темрява, 20: 00–08:00), і дозволено вільний доступ до стандартної сухої дієти та водопровідної води. Усі тварини отримали гуманний догляд, а протоколи експериментів були затверджені Комітетом з догляду за тваринами Військово-морського медичного університету.

2. Діабетична модель і лікування

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>В експерименти включено 16,7 ммоль/л.

Потім щури з діабетом отримували телмісартан (Merck, PHR 1855, 10 мг кг−1 ·d−1 перорально, група DM плюс Tel, n=10) або носій (група DM, n=10) через зонд. протягом 4 тижнів. Телмісартан, використаний у цьому документі, був отриманий від Sigma-Aldrich Germany, Inc., чистота якого становить 98 відсотків плюс (ВЕРХ). Періодично вимірювали рівень глюкози в крові та масу тіла, а зразки сечі для кількісного вимірювання альбумінурії збирали в метаболічні клітки. Щурів умертвляли під наркозом через 4 тижні, нирки видаляли та зважували для гістологічного аналізу та виділення білка.

3. Альбумін сечі

Зразки сечі центрифугували при 10,000 об/хв протягом 5 хв для видалення нерозчинних матеріалів. Супернатант ділили на аліквоти та зберігали при -80°C до використання. Набір ELISA для альбуміну сечі щурів від Chondrex (Redmond, WA) використовували відповідно до інструкцій виробника.

4. Швидкість кліренсу креатиніну

Для визначення креатиніну в крові та сечі використовували набір для аналізу креатиніну (Nanjing Jiancheng, C011-2-1). Ccr розраховували за формулою: Ccr=(креатинін у сечі*24 год об’єм сечі)/(креатинін крові*24 год*60 хв/год)/кінцева вага (кг).

5. Імуногістохімічне та TUNEL фарбування

Нирки розрізали в мікротомі для нарізки на 7–8 мкм і фіксували 4% параформальдегідом у PBS протягом 10 хв. Блокування проводили буфером (PBS, 2% BSA, 10% FBS) протягом 1 години з подальшою 10-хвилинною інкубацією з другим буфером (PBS, 0,4% Triton). Первинне антитіло проти -SMA (Servicebio, GB13044) або NPHS2 (Abcam, ab229037) інкубували протягом 3 годин при кімнатній температурі у зволоженій камері. Після промивання зрізи інкубували з Cy3 козячими анти-мишачими IgG (H плюс L) (Servicebio, GB21301), HRP-кон’югованими козячими анти-кролячими IgG (H плюс L) (Servicebio, GB23303) або імунофлуоресцентним TUNEL (Servicebio, G1501). ) реакція у вологій камері (темрява, 37 градусів, 1 год). Потім зрізи контрастно фарбували DAPI (Servicebio, G1012) для виявлення ядер. Нарешті, пофарбовані зрізи були занурені в стійку до гасіння флуоресценції герметизуючу рідину та зображені за допомогою флуоресцентного мікроскопа (NIKON ECLIPSE C1, Японія).

Екстракт цистанхи

6. Культура клітин

Ниркові мезангіальні клітини людини (HRMCs) були отримані від ScienCell Research Laboratories, Сантьяго, Каліфорнія, і культивовані в середовищі мезангіальних клітин (MsCM, ScienCell Research Laboratories). HRMC поміщали в колбу, покриту полі-L-лізином (2 мкг/см2), і вирощували при 37 градусах у зволоженій атмосфері, що містить 5 відсотків CO2. Клітини в цьому експерименті використовували протягом 3–4 пасажів і досліджували, щоб переконатися, що вони демонструють специфічні характеристики мезангіальних клітин. Лінія клітин подоцитів миші MPC-5 була отримана з ATCC, Меріленд, США. Клітини вирощували на колагені I типу в RPMI 1640 (10 відсотків FBS) з 50 ОД/мл IFN- при конфлюентності від 33 до 85 відсотків, а потім переносили в 37 градусів без IFN- протягом 10–14 днів для диференціювання.

7. Дослідження життєздатності та проліферації клітин

Набір для підрахунку клітин-8 (CCK-8) використовувався для вимірювання проліферації та життєздатності клітин. Клітини висівали в кожну лунку 96-лункових культуральних планшетів (5 × 103/лунку). Після обробки додали 10 мкл CCK-8 (Beyotime, Шанхай, Китай) та інкубували протягом 1 години при 37°C. Абсорбцію вимірювали за допомогою пристрою для зчитування мікропланшетів (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) при довжині хвилі 450 нм.

8. Фарбування анексином V і пропідію йодидом

Клітини висівали та вирощували до досягнення 60-відсоткового злиття, а потім обробляли високим вмістом глюкози (50 ммоль/л) або телмісартаном. Через 96 годин зібрані клітини промивали холодним PBS і ресуспендували в буфері для зв’язування. Annexin V-FITC і PI (eBioscience, Сантьяго, Каліфорнія, Сполучені Штати) додавали до клітинної суспензії згідно з інструкціями виробника, а флуоресценцію зразка з 10 000 клітин аналізували проточною цитометрією, проведеною за допомогою FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Франклін, Нью-Джерсі, Сполучені Штати).

9. Вестерн-блот

Кору нирок, HRMCs і MPC-5 гомогенізували в реагенті для екстракції тканинного або клітинного білка (Beyotime) з додаванням інгібіторів протеази та фосфатази (Merck, Whitehouse Station, NJ, Сполучені Штати). Зразки розділяли на 10-відсотковому SDS PAGE і переносили на нітроцелюлозну мембрану (Pall Corporation, Нью-Йорк, Сполучені Штати). Мембрану блокували 5% бичачим сироватковим альбуміном і протирали антитілами. Анти-PKC 1 (Технологія клітинної сигналізації, 46 809), анти-свіпросин-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), тубулін (Beyotime, AT819) і GAPDH (Beyotime, AF5009) ) використовували в концентрації 1:1, 000. Білки візуалізували за допомогою вторинних антитіл проти миші або кролика, кон’югованих з IRDye (Рокленд, Лімерік, Пенсильванія, США) у співвідношенні 1:5, 000. Використання ІНФРАЧЕРВОНОЇ СИСТЕМИ ОДІССЕЙ (LI-COR) для аналізу результатів.

10. Статистичний аналіз

Обробку даних аналізували за допомогою Origin 6.1 (OriginLab, Нортгемптон, Массачусетс) і виражали як середнє ± стандартне відхилення принаймні трьох незалежних експериментів. Статистичну значущість визначали за допомогою ANOVA. Значення p < 0.05 вважалося статистично значущим.

Цистанка трубчаста

ДИСКУСІЯ

Телмісартан є селективним блокатором рецепторів АТ1, який клінічно використовувався для зниження підвищеного артеріального тиску та екскреції білка з сечею у пацієнтів з гіпертензією (Baden та ін., 2008; Mann та ін., 2009). Кілька клінічних випробувань показали, що телмісартан ефективний для зниження протеїнурії у пацієнтів з макроальбумінурією та затримки початку та прогресування діабетичної нефропатії (Makino та ін., 2005; Nakamura та ін., 2010; Fujita та ін., 2011; Schmieder та ін. ., 2011). У цьому дослідженні пероральне лікування телмісартаном у щурів з цукровим діабетом, індукованим STZ, запобігло виникненню ранніх аномалій з боку нирок і в цілому, включаючи зниження маси тіла, рівня глюкози в крові та білка в сечі. Ці результати підтвердили, що телмісартан має ренопротекцію у мишей з діабетичною нефропатією на ранній стадії. Що більш важливо, це дослідження виявило, що захисний ефект телмісартану на діабетичні клубочки відображався в антиапоптотичному та проапоптотичному ефектах на подоцити та мезангіальні клітини відповідно.

Кінцеві продукти глікації (AGE) можуть спричинити пошкодження та відшарування ДНК подоцитів частково через стимуляцію осі Ang II-AT1R, таким чином забезпечуючи інноваційну корисну властивість телмісартану при DKD (Fukami et al., 2013). При нормотензивних протеїнуричних гломерулярних захворюваннях низького ступеня, лікування телмісартаном на ранній стадії захворювання послаблює гломерулярне та тубулоінтерстиціальне пошкодження (Villa et al., 2011). І кілька шляхів, ймовірно, пов’язані з плейотропними наслідками, включаючи сигналізацію фактора росту, сигналізацію рапаміцину від ссавців, убіквітування білка, шлях Wnt-бета-катеніну та сигналізацію гіпоксії (Villa et al., 2011).

Нещодавно ми повідомили, що свіпросин-1 (Wang et al., 2018b), інша назва домену EF-hand, що містить 2 (EFhd2), відіграє вирішальну роль у прогресуванні DKD, яке розпочалося після індукції, хоча він локалізований в подоцитах клубочка миші. Відсутність свіпросину-1 покращувала залежний від мітохондрій апоптоз подоцитів, стимульований гіперглікемією або високим рівнем глюкози через сигнальний шлях p38 MAPK. Тут ми також виявили, що телмісартан пригнічує гіперглікемію або індуковану високим вмістом глюкози експресію свіпросину-1 як in vivo, так і in vitro, що вказує на те, що антиапоптозна дія телмісартану на подоцити може бути пов’язана з регуляцією свіпросину{ {12}} вираз.

Встановлено, що проліферація мезангіальних клітин і надмірне відкладення протеїнів позаклітинного матриксу сприяють розвитку DKD (Lee et al., 2004). Попередні дослідження показали, що високий рівень глюкози може індукувати експресію білків мезангіального позаклітинного матриксу в умовах гіперглікемії (Taniguchi et al., 2013). -SMA зазвичай використовується для диференціації мезангіальних клітин від інших клубочкових клітин у STZ-індукованого діабету мишей, і підвищена експресія -SMA може бути маркером фенотипових зрушень мезангіальних клітин від неактивованої фази до проліферативної, секреторно активованої фази (Niu та ін., 2014). Тут ми виявили, що телмісартан знижує експресію -SMA в діабетичному клубочку. Крім того, повідомлялося, що проліферація мезангіальних клітин має значний вплив на патогенез DKD (Zeng et al., 2013). Наші результати в цьому дослідженні відображали залежний від часу та дози депресивний ефект телмісартану на проліферацію мезангіальних клітин, пов’язану з проапоптичними характеристиками.

Клінічні дані свідчать про те, що телмісартан є більш ефективним, ніж лозартан, у зменшенні протеїнурії у пацієнтів з артеріальною гіпертензією та ДЗН, що може бути пов’язано з його здатністю частково агонізувати PPAR (Bichu et al., 2009). Крім того, ці сприятливі зміни, такі як запобігання атрофії нирок і фіброзу телмісартану, були пов’язані зі зменшенням експресії TGF 1 та інших прозапальних і профіброзних генів цитокінів через активацію PPAR/HGF (Kusunoki et al., 2012), незалежну блокада рецепторів Ang II типу 1. Тут ми також виявили, що телмісартан специфічно активував експресію гена PPAR у мезангіальних клітинах, і проапоптотичний ефект, спричинений телмісартаном на мезангіальні клітини, міг бути послаблений інгібіторами PPAR.

PKC 1 є одним із широко експресованих сімейств серин-треонінкіназ, які трансдукують широкий спектр клітинних прогресій шляхом субстрат-специфічного фосфорилювання (Newton, 1995). Повідомлялося, що не тільки підвищена активність PKC, але й рівні її мРНК спостерігаються в біоптатах людської діабетичної нефропатії (Langham et al., 2008). Спричинена гіперглікемією експресія та активація PKC має плейотропні ефекти в мезангіальних клітинах, включаючи сприяння надмірному накопиченню білків ECM (Brownlee, 2001). Дослідження показали, що інгібування PKC послаблює гломерулярну гіперцелюлярність і експансію позаклітинного матриксу в db/db мишей і гломерулярну дисфункцію у STZ-щурів (Ishii et al., 1996; Koya et al., 2000). Подібним чином інгібітор PKC послаблював проліферацію мезангіальних клітин і вироблення колагену, спричинені фактором росту тромбоцитів (PDGF) (Tokuyama et al., 2011). У нашому дослідженні телмісартан знижував регуляцію експресії мРНК PKC 1 і білка в мезангіальних клітинах, стимульованих гіперглікемією. Крім того, експресія TGF 1 у мезангіальних клітинах, індукована високим вмістом глюкози, також може пригнічуватися телмісартаном.

Рецептори AT1 і AT2, добре відомі як сім трансмембранних G-білкових рецепторів, були клоновані та фармакологічно проілюстровані (Touyz and Berry, 2002). Телмісартан може селективно антагонізувати рецептори AT1, тоді як блокатори рецепторів AT1 можуть індукувати експресію рецепторів AT2 (Touyz and Berry, 2002). Дослідження показали, що рецептори AT1 здійснюють свій вплив, стримуючи ріст клітин і провокуючи апоптоз (Horiuchi et al., 1997; Touyz et al., 1999). Крім того, рецептори AT2 індукують клітинний апоптоз у специфічній конформації через p38 MAPK-опосередковану апоптотичну передачу сигналів (Miura and Karnik, 2000). У нашій цій статті експресія мРНК AT1 і AT2 була незмінною в культивованих мезангіальних клітинах, стимульованих телмісартаном або гіперглікемією. Таким чином, індукований телмісартаном апоптоз мезангіальних клітин і зниження експресії PKC 1 можуть не опосередковуватися рецепторами AT1 і AT2.

Цистанхе капсули

Підсумовуючи, телмісартан послаблював раннє пошкодження клубочків у щурів з діабетом 1 типу шляхом пригнічення апоптозу подоцитів і сприяння мезангіальному апоптозу. Антиапоптотичний ефект телмісартану в подоцитах може бути пов’язаний з його інгібуванням експресії свіпросину-1, тим часом проапоптотичний ефект на мезангіальні клітини був частково пов’язаний з його агоністичним ефектом на PPAR. Крім того, телмісартан вибірково блокував експресію PKC 1/TGF 1 у мезангіальних клітинах, але не в подоцитах. Необхідні поглиблені дослідження, щоб з’ясувати протилежний, але сприятливий вплив телмісартану на подоцити та мезангіальні клітини та основні молекулярні механізми.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 та Ye Tu2

1 кафедра клінічної фармації, лікарня Сіньхуа, медична школа Шанхайського університету Цзяотун, Шанхай, Китай,

2 Факультет фармації, Шанхайська східна лікарня, Університет Тунцзі, Шанхай, Китай,

3 Департамент клінічної фармації, Центр клінічних випробувань, Перша афілійована лікарня Першого медичного університету Шаньдуна та лікарня Цяньфошань провінції Шаньдун, Цзінань, Китай,

4 Кафедра реанімації, Школа анестезіології, Військово-морський медичний університет, Шанхай, Китай,

5 Департамент фармації, Шанхайська муніципальна лікарня традиційної китайської медицини, Шанхай, Китай,

6 Інститут судинних захворювань, Шанхайська інтегрована лікарня TCM, Шанхай, Китай