Спектроскопія Терагерца з високою роздільною здатністю продуктів теплового розкладання діабетичної та недіабетичної плазми крові та гранул з тканин нирок
Mar 28, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Абстрактний
Значення:Один з сучасних напрямків медичної діагностики базується на метаболоміці , підході, що дозволяє визначити метаболіти, які можуть бути специфічними особливостями захворювання. Газова спектроскопія з високою роздільною здатністю дозволяє досліджувати вміст метаболітів газу у зразках біологічного походження. Представляємо розробку методики вивчення діабетичних і недіабетичних біологічних зразків, підготовлених у вигляді гранул, методом спектроскопії високої роздільної здатності терагерца (ТГц).
Мета:Основна ідея роботи полягає у вивченні вмісту термічних продуктів розпаду газу діабетичної та недіабетичної сушкиплазма кровіітканини нирок,для виявлення набору газомаркерів, що характеризуються цукровим діабетом, методом спектроскопії високої роздільної здатності ТГц.
Підхід:Представляємо підхід до вивчення діабетичного та недіабетичногоплазма крові(людина і щури) ітканини нирок,(щури), використовуючи спектроскопію з високою роздільною здатністю, засновану на нестаціонарному впливі частотного діапазону ТГц. Розроблено методи підготовки зразків крові та тканин нирок у вигляді гранул та випаровування зразків.
Результатів:Вимірювання спектрів обертального поглинання парів при нагріванні гранул, приготованих з крові ітканини нирок,здійснювалися в діапазоні частот від 118 до 178 ГГц. Були виявлені і ідентифіковані лінії поглинання, що з'являються в спектрах парів зразка. Молекулярний вміст термічних продуктів розпаду відрізнявся для недіабетичних і діабетичних зразків; наприклад, основним маркером є ацетон, що з'являється в діабетичній крові (людина і щури) і у діабетикатканини нирок.
Висновки: Наша робота ілюструє потенційну здатність до визначення вмісту метаболітів біологічних зразків для діагностики та прогнозу захворювань для клінічної медицини. © Автори. Опубліковано SPIE в рамках ліцензії Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Розповсюдження або відтворення цього твору повністю або частково вимагає повної атрибуції оригінальної публікації, включаючи її DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Ключові слова: терагерцова спектроскопія з високою роздільною здатністю; термічне розкладання; тканини;плазма крові; цукровий діабет; ліофілізація.
Ключові слова:терагерцова спектроскопія з високою роздільною здатністю; термічне розкладання; плазма крові; цукровий діабет; ліофілізація, тканини нирок.
1 Вступ
У наш час проблема діагностики соціально важливих захворювань (цукрового діабету, онкологічних захворювань і т.д.), в тому числі ранньої стадії, привертає велику увагу наукових груп світу.Одним з нових підходів, що відкривають нові можливості в діагностиці та лікуванні різних захворювань, є метаболоміка. Метаболоміка - це галузь науки, яка досліджує кінцеві і проміжні продукти обміну речовин біологічної системи (клітини, органів або всього організму в цілому). Метаболоміка може виявити метаболіти, які можуть бути специфічними особливостями захворювання і можуть відігравати велику роль у діагностиці та прогнозі захворювання. Засобами масової інформації, що містять кінцеві і проміжні продукти обміну речовин в організмі людини і корисні для виявлення метаболітів, пов'язаних із захворюваннями і патологіями, є видихається дихання, кров, сеча, слина та ін.
Одним із суспільно важливих захворювань, що загрожують якості життя людей, є цукровий діабет. Цукровий діабет 2 типу раніше був захворюванням середнього віку, але зараз його діагностують у дорослих, молоді, дітей. Результати метаболомічних досліджень зразків крові та сечі хворих на цукровий діабет від 18 років, а також дітей від 1 до 13 років представлені в базі даних метаболомів людини (HMDB).1 Головним чином, досліджено кров (21 хімічна речовина, включаючи ізомери), сечу (30 хімічних речовин, включаючи ізомери) та спинномозкову рідину (1 хімічна речовина). Наприклад, (R)-3-гідроксимасляна кислота була виявлена у всіх трьох типах рідин. Деякі речовини (ацетоцтова кислота, D-фруктоза і D-глюкоза) були виявлені в обох рідинах (крові і сечі). Більш характерна особливість цукрового діабету (ацетон, CH3COCH3) була присутня тільки для сечі. Зразки рідин, результати досліджень, представлені в HMDB, були досліджені різними методами — газовою хроматографією;2 газова хроматографія з мас-спектрометрією;3,4 газорідинна хроматографія з мас-спектрометрією;5 спектроскопія з високою роздільною здатністю ядерного протонного магнітного резонансу;6 та методи з використанням спеціальних приладів для моніторингу стану хворих на цукровий діабет, система безперервного моніторингу глюкози.7
Розвиток хронічної хвороби нирок є основним ускладненням цукрового діабету. Хоча визначення глікованого альбуміну є поширеним підходом до скринінгу, пошкодження нирок може початися задовго до того, як з'являться клінічно значущі зміни альбуміну сечі. Враховуючи багатофакторний патогенез хронічної хвороби нирок, для його скринінгу розглядалися різні маркери.8,9 Однак їх діагностичне значення без біопсії нирок виявилося сумнівним.
Спектроскопічний підхід може надати інформацію про вміст біологічних зразків, які можуть бути використані для медичної діагностики. Частотний діапазон терагерц (ТГц) дуже важливий для вивчення газів, рідин, тканин живих організмів. Є деякі огляди, присвячені застосуванню методів частотного діапазону ТГц, включаючи спектроскопію часових областей ТГц, рефлекторометрію ТГц і візуалізацію ТГц для біології та медицини10.
Спектроскопія часової області ТГц дозволяє виявити спектри, де коефіцієнт поглинання або показник заломлення має деякі спектральні особливості, відповідні наявності в зразках деяких біомолекул (білків, цукрів і т.д.) або їх різних концентрацій11.
Молекулярно-абсорбційна спектроскопія і зокрема газова спектроскопія ТГц є дуже перспективним підходом для досліджень багатокомпонентних газових сумішей різного походження.12 Зразки в рідкому і твердому стані можуть бути досліджені шляхом випаровування або термічного розкладання. Метаболіти-маркери соціально важливих захворювань (цукрового діабету, раку тощо) можуть бути виявлені його спектральними лініями в спектрах поглинання, що здійснюються при передачі випромінювання через проби газу.
Рівень ацетону в зразках видихуваного дихання і сечі, взятих у хворих на цукровий діабет (12 осіб), вимірювали за допомогою спектрометра діапазону терагерц з фазовим ключем зміни діючого випромінювання. Експерименти проводилися у співпраці з Національним медичним дослідницьким центром імені Алмазова. Вимірювання проводилися на лініях поглинання ацетону з центральними частотами 150, 537 і 151, 647 ГГц. Вимірювання проводилися без підігріву. Одночасний аналіз зразків видихуваного дихання і сечі хворих на цукровий діабет виявив, що рівень ацетону в сечі був набагато вище, ніж при видихуваному диханні, в деяких випадках на порядок вище.13,14
Результати досліджень газової спектроскопії високої роздільної здатності ТГцплазма кровіхворих і щурів (умовно здорових і хворих на цукровий діабет), а також щурівтканини нирок,(здорові і при цукровому діабеті) представлені висушені і пресовані до гранул. Тканини абоплазма кровіживих організмів, без будь-якої підготовки, необхідно досліджувати відразу після відбору проб. Підготовка у вигляді гранул дозволяє досліджувати через досить тривалий час після забору крові або біопсії нирок.
2 Експерименти та методологія
2.1Спосіб приготування плазмових гранул крові і гранул нирок
Венозна кров у хворих на цукровий діабет 2 типу та умовно здорових учасників була зібрана у відділенні ендокринології Національного медичного дослідницького центру імені Алмазова; центр надає медичну допомогу хворим на цукровий діабет. Троє пацієнтів і двоє учасників були чоловіками, віком (від 39 до 43 років). Усі експериментальні протоколи, які використовувалися в цьому дослідженні, були розглянуті та затверджені пацієнтами та учасниками та Комісією з використання Медичного центру. Венозна кров була зібрана вранці після від 8 до 12 годин голодування в трубці з антикоагулянтом К3ЕДТА (Vacutest Kima, Італія). Плазму отримували для аналізу біохімічних показників шляхом центрифугування цільної крові при 3000 об/хв протягом 15 хв в лабораторній центрифузі (Eppendorf 5702R, Німеччина) при температурі þ4°C. Значення біохімічних показниківплазма кровізразки і контрольні інтервали представлені в таблиці 1 (рівень глікованого гемоглобіну був отриманий на всій крові). З таблиці 1 видно, що концентрація глюкози, тригліцеридів і глікованого гемоглобіну в зразках хворого на цукровий діабет збільшується в 1, 5, 2 і 2, 3 рази відповідно.
Дослідження також проводилося з щурами-самцями Wistar у віці 8 тижнів і вагою від 180 до 200 г, згідно з протоколом експериментальних досліджень, затвердженим Комісією з догляду та використання тварин Національного медичного дослідницького центру Інституту експериментальної медицини Імені Алмазова. Рівень глюкози у тварин експериментальної групи становив 21 ммоль ∕л через 120 хв після глюкозного навантаження. Неушкоджені щури використовувалися в якості контрольної групи. Венозна кров була зібрана з нижньої порожнистої вени до того, як тварини були евтаназовані. Також була зібрана нирка. Зразки крові збирали в трубки, що містять антикоагулянт.
Тестові зразки були заморожені при температурі−80°C (низькотемпературний холодильник DW-86L388A, Хаєр, Китай). Потім його ліофілізували шляхом заморожування-сушіння Вако 2 (ZirBus, Німеччина) при температурі−50°C і тиску 3 Па. Заморожування проводиться перед ліофілізацією, оскільки при ліофілізації під впливом високого внутрішнього тиску біологічні компоненти можуть бути знищені. Висушені зразки представляли собою губку, що складається з біологічних кристалів. Губка була зруйнована металевим шпателем і подрібнена до кристалів розміром в кілька десятків мікрометрів. Застосування ступки і товкача було неможливим, так як подрібнення білків в складі зразків призвело б до їх небажаної адгезії і утворення круглих гранул.
Порошок ліофілізованих зразків зважували (аналітичний баланс OHAUS Discovery, Швейцарія), а потім поміщали в сталеву пресову форму. Використовуючи лабораторні преси (Ангкор, Росія і Спецак, Великобританія) при певному формувальному тиску,плазма кровібули отримані пелети і гранули нирок. Кожен кристал гранул містить певний відсоток жирів (тригліцеридів), білків (альбуміну) і фібриногену - всі вони нормальні або гліковані (у діабетичному випадку). Гранули зразків з контрольної групи далі іменуються як «недіабетична гранула» та гранули зразків іздіабетична група далі іменується як «діабетична гранула».
2.2 THz Експериментальна установка спектроскопії з високою роздільною здатністю
Спектроскопія ТГц з високою роздільною здатністю, заснована на нестаціонарних впливах, дозволяє аналізувати компонентний склад газових і парових багатокомпонентних газових сумішей. Спектрометри забезпечують чутливість, близьку до теоретичної межі, з роздільною здатністю, обмеженою тільки ефектом Доплера і можуть фіксувати швидкі процеси. Чутливість зберігається навіть при істотному зниженні тиску газу і становить приблизно 0,2 проміле в режимі сканування деяких газів (наприклад, аміаку при вимірах лінії поглинання поблизу частоти 572 ГГц). Крім того, це дає можливість визначити компонентний склад газової суміші з високою надійністю.12 Проведено дослідження продуктів термічного розкладання пелет методом нестаціонарної газової спектроскопії ТГц діапазону від 118 до 178 ГГц. У спектрометрі використовується фазовий контур для автоматичного контролю частоти зворотної хвильової лампи і зсуву фаз, реєстрації в часовій області, усереднення і обробки спектроскопічного сигналу переходу. Пристрій реєструє сигнал в області часу. Пари зразків аналізувалися за допомогою наступної процедури. Пелети поміщали в пробірку, за допомогою вакуумного накачування, поступово нагрівали пробірку (до 240°С) і отриману суміш термічних продуктів розпаду зразка пускали в вимірювальну комірку. Файл даних зазвичай включає записи вибраного або загального робочого діапазону спектрометра. Тому речовини можна ідентифікувати по лініях поглинання, що з'являються в загальному спектрі вибірки, а динаміку концентрацій в суміші можна простежити, порівнявши кілька файлів даних. Речовини були ідентифіковані шляхом їх пошуку в базах даних З відкритим вихідним кодом МВт, ммв і ТГц.15,16
3 Аналіз парів плазми крові та парів нирок з використанням спектрометра Терагерца з високою роздільною здатністю
За допомогою наших систем THz-TDS ми вимірювали передачу пелет у спектральному діапазоні від 0,2 до 1,4 ТГц,17, але ми знаємо, що біомолекули і зокрема продукти її розпаду в газовому стані мають інформативну реакцію (спектри обертання поглинання) на цих частотах і нижче також, таким чином ми провели додаткове дослідження на газовому спектрометрі високої роздільної здатності ТГц. Виявлені лінії всмоктування речовин у діабетиківплазма кровізбігаються з речовинами недіабету людини,плазма крові, крім ацетону. Існує безліч ліній поглинання ацетону, що лежать в робочому діапазоні частот спектрометра (від 118 до 178 ГГц). Зазвичай її більш ніж достатньо, щоб виявити якусь лінію поглинання однієї речовини для однозначного визначення наявності речовини в багатокомпонентній газовій суміші. Приклад запису частин спектрів поглинання з лінією поглинання ацетону наведено на рис. Ацетон може з'явитися в крові при порушенні вуглеводного обміну. Як зазначається в літературі, в крові хворих на цукровий діабет містилися β-ОН-бутират і ацетоацетат, але пізніше ці речовини розкладалися на ацетон і вуглекислий газ.18 Вуглекислий газ не має дипольного моменту; тому вона не має обертальних переходів. Його підвищений вміст можна виявити, тільки вивчаючи вібраційний спектр зразка в ІЧ-діапазоні.
Парові речовини плазми, такі як карбонілсульфід (OCS), діоксид сірки (SO2), мурашина кислота (HCOOH), ізоціанова кислота (HNCO) і аміак (NH3), були виявлені як в діабетичних зразках людини, так і в недіабетичних зразках людини. У деяких випадках існує одна експериментальна лінія, виявлена в спектрах зразка, що відповідає більшій кількості ліній, ніж одна для однієї речовини (наприклад, ізоціанової кислоти) в каталожних даних (див. табл. 2).15,16
Пояснюється це тим, що каталоги містять дані про гіпердисперсних структурах речовин, які не вирішені в даному експерименті, так як лінії мають скінченну ширину близько декількох сотень кГц. Отримані абсорбційні лінії досліджуваних речовин збігаються зі спектрами поглинання парів капілярної крові іплазма кровіхворих на цукровий діабет і умовно здорових учасників, які були опубліковані в нашій попередній роботі.19 Виявлені газоподібні речовини могли утворитися при приготуванні проби як продукти хімічного перетворення амінокислот. Питання про те, чи мають ці сполуки діагностичну цінність, вимагає дослідження. У клінічній практиці в діабетології аналіз на вміст цих речовин поки не використовується.
Париплазма кровіздорових щурів містилися карбонілсульфід (ООС), метанетіол(СН3Ш), бутиронітрил (C3H7CN), ацетальдегід (CH3CHO) і мурашина кислота (HCOOH). Зразокплазма кровідіабетичних щурів відрізнялася наявністю ацетону. Крім абсорбційних ліній пропіонітрилу (C2H5CN), був виявлений метилформат (CH3OCHO).
Зразки парів сушених гранул здорових і діабетичних щурів.тканини нирок,вивчалися. паритканини нирок,здорових щурів містять карбонілсульфід (OCS), діоксид сірки (SO2), мурашину кислоту (HCOOH), ізоціанову кислоту (HNCO), етиловий форміат (C2H5OCHO) і пропіленгліколь (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Вміст парів у щурів-діабетиківтканини нирок,від здорового щура відрізнявся наявністю не тільки карбонілсульфіду (OCS), але і його ізотополога OCS-34. Ацетальдегід (CH3CHO), метанетіол (CH3SH), етиленсульфід (C2H4S), метанол (CH3OH) і гліколегід (CH2ðOHÞCHO) також були виявлені в парах гранули діабетичного щуратканини нирок,(див. рис. 2 і рис. 3).
Наявність сполук сірки, таких як метанетиол, може бути обумовлено термічним розкладанням в складі білка крові амінокислот сірки (метіоніну, цистеїну, цистину). Метіонін - незамінна амінокислота, яка не синтезується в організмах людини. Він отриманий з їжі і є джерелом сірки для біосинтезу цистеїну. При нагріванні сірчаних амінокислот до температур близько 240°С у масовому спектрі цих речовин були виявлені метанетіол і етиленсульфід (розкладання метіоніну)20.
4 Висновок
Молекулярний вміст людини і щураплазма кровіі щуртканини нирок,при термічному розкладанні зразків вивчався за допомогою спектрометра високої роздільної здатності ТГц. Був представлений спосіб підготовки біологічних зразків у вигляді пелет. Такий спосіб дає можливість зберігання і транспортування зразків. Газова спектроскопія з високою роздільною здатністю дозволяє визначити вміст багатокомпонентних газових сумішей будь-якого походження, в тому числі біологічних зі слідовими концентраціями компонентів газу. Ацетон виявили у діабетикаплазма кровіЗразки. Інформація про відмінність змісту діабетичного і здоровогоплазма кровічоловіків і щурів і діабетиків і здорових щурівтканини нирок,була отримана з абсорбційних обертальних спектрів парів. Застосування спектроскопії високої роздільної здатності ТГц забезпечує якісний аналіз компонентного вмісту зразків парів крові ітканини нирок,Гранули. Можливість проведення кількісної оцінки концентрацій важливих газових маркерів цукрового діабету в залежності від стану хворихслід вивчати в подальших дослідженнях.
